Pesquisa
PCR em tempo real
Uma Inovao tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Caroline Monteiro Novais
Estudante do curso de farmcia do
Centro Universitrio de Barra Mansa.
E-mail: carol_farmacia@hotmail.com
Melissa Pires-Alves
Doutora em Biologia Celular e Molecular pela
Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Professora do Centro Universitrio de Barra Mansa.
E-mail: melalves@ig.com.br
Colaborador
Fbio Freitas Silva
Introduo
advent o da bi ol ogi a
molecular foi certamente
um dos maiores passos das
cincias biolgicas durante
o Sculo XX. A descoberta da Reao
em Cadeia da Polimerase (PCR) trou-
xe enormes benefcios e desenvolvi-
ment os ci ent fi cos como o
seqenciamento de genomas, a ex-
presso de genes em sistemas
recombinantes, o estudo de gentica
molecular, a determinao rpida da
paternidade e o diagnstico rpido de
doenas infecciosas.
Ultimamente, uma inovao
tecnolgica resultante da PCR, deno-
minada de PCR em Tempo Real, vem
ganhando espao nos diagnsticos cl-
nicos e nos laboratrios de pesquisa
por apresentar a capacidade de gerar
resultados quantitativos. Essa tcnica
permite o acompanhamento da rea-
o e a apresentao dos resultados de
forma mais precisa e rpida, em rela-
o PCR que apresenta somente
resultados qualitativos.
PCR
A Reao em Cadeia de Polimerase
(PCR, do ingls Polymerase Chain
Reaction), uma metodologia que
pode ser executada inteiramente in
vitro sem o uso de clulas (BRUCE,
1999). A tcnica da PCR foi desenvol-
vida nos anos 80 por Kary Mullis, que
recebeu, em 1994, o prmio Nobel.
A PCR possibilita a sntese de
fragmentos de DNA, usando a enzima
DNA-polimerase, a mesma que parti-
cipa da replicao do material genti-
co nas clulas. Esta enzima sintetiza
uma seqncia complementar de DNA,
desde que um pequeno fragmento (o
iniciador, ou primer, em ingls) j
esteja ligado a uma das cadeias do
DNA no ponto escolhido para o incio
da sntese. Os iniciadores definem a
seqncia a ser replicada e o resultado
obtido a amplificao de uma deter-
minada seqncia DNA com bilhes
de cpias (MULLIS, 1990).
Utilizao da tcnica da PCR
O desenvolvimento da tcnica
de amplificao de segmentos de DNA
utilizando a PCR abriu enormes pers-
pectivas para a anlise de genes, diag-
nstico de doenas genticas e
deteco de agentes infecciosos como
citomegalovrus, vrus da hepatite B e
C, herpes vrus simples, vrus da rub-
ola, vrus da imunodeficincia humana
(HIV), Chlamydia trachomatis,
Helicobater pylori, Mycobacterium
tuberculosis e Pneumocistis carinii.
O avano da cincia sobre a com-
preenso dos genes trouxe para a
rotina do laboratrio de gentica, fer-
ramentas que permitem o diagnstico
em nvel molecular. Na linha das doen-
as genticas, o permanente desen-
volvimento de novos protocolos tem
permitido a pesquisa de pequenas
alteraes na seqncia de DNA, como,
por exemplo, na fibrose cstica.
Outras aplicaes especialmente
teis para a PCR a clonagem de um
determinado fragmento de DNA, que
pode ser um gene e o conhecimento
do DNA codificante (cDNA) obtido a
partir da molcula de RNA, o que
permite o estudo da expresso de
genes.
Finalmente, a PCR tem um gran-
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de potencial na medicina forense. Sua
sensibilidade torna possvel utilizar uma
amostra bastante pequena (traos m-
nimos de sangue e tecidos que pode-
riam conter os restos de somente uma
nica clula) e ainda se obter uma
impresso digital de DNA da pessoa
da qual a amostra foi coletada, poden-
do assim fazer comparaes com aque-
les obtidos de vtimas e/ou suspeitos
de casos de infrao penal (SILVA &
PASSOS, 2002).
O genoma de cada ser humano
(exceto dos gmeos idnticos) dife-
rente nas regies polimrficas, sendo
possvel amplificar essas regies. As-
sim, a pesquisa de STRs (Small Tan-
dem Repeats) atravs da PCR, utilizan-
do um conjunto de iniciadores que
cobrem estas partes altamente vari-
veis do genoma humano, pode gerar
uma impresso digital caracterstica de
DNA para cada indivduo (BRUCE,
1999).
PCR em Tempo Real
A possibilidade de monitorar a
PCR em tempo real revolucionou o
processo de quantificao de frag-
mentos de DNA e RNA. A PCR em
tempo real realiza a quantificao des-
tes cidos nuclicos de maneira preci-
sa e com maior reprodutibilidade, por-
que determina valores durante a fase
exponencial da reao. O ponto que
detecta o ciclo na qual a reao atinge
o limiar da fase exponencial denomi-
nado de Cycle Threshold (C
T
) (Figura
1). Este ponto permite a quantificao
exata e reprodutvel baseado na
fluorescncia.
A emisso dos compostos fluo-
rescentes gera um sinal que aumenta
na proporo direta da quantidade de
produto da PCR. Sendo assim, os valo-
res da fluorescncia so gravados du-
rante cada ciclo e representam a quan-
tidade de produto amplificado (http:/
/www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/
WhatIs.asp, 2004). Os compostos flu-
orescentes mais utilizados so o SYBR
Green e TaqMan.
A PCR em tempo real requer uma
plataforma de instrumentao que con-
tm um termociclador com sistema
tico para a excitao da fluorescncia
e na coleo da emisso e um compu-
tador com um software para aquisio
de dados e anlise final da reao.
Estas mquinas, disponveis de diver-
sos fabricantes, diferem na capacidade
da amostra (96-poos padro,
processamento de poucas amostras
ou requerem tubos capilares de vidro
especializados), no mtodo da excita-
o (lasers ou fontes claras do espec-
tro largo com filtros ajustveis), e na
sensibilidade total. H tambm dife-
renas nos soft wares para o
processamento dos dados (http://
www.ambion.com/techlib/tn/81/
813.html, 2004).
Fluorforos
Os fluorforos so molculas que
absorvem e emitem luz em um com-
primento de onda especfico. Os siste-
mas de deteco da PCR em Tempo
Real utilizam estas molculas que pro-
porcionam o acompanhamento da re-
ao ao longo dos ciclos.
SYBR Green
O SYBR Green se liga entre a
fita dupla de DNA (Figura 2) e com a
excitao da luz emitida pelo sistema
tico do termociclador, emite uma
fluorescncia verde. As vantagens da
utilizao do SYBR Green so: baixo
custo, facilidade no uso e sensibilida-
de. A desvantagem a ligao em
todo DNA fita dupla que surge durante
a reao, incluindo os dmeros dos
iniciadores e outros produtos
inespecficos, podendo superestimar
a concentrao do fragmento alvo. O
SYBR Green no ligado ao DNA
exibe uma fluorescncia muito pe-
quena. Entretanto, a fluorescncia
realada quando ligado na fita dupla
do DNA.
No comeo da amplificao, a
mistura da reao contm o DNA
desnaturado, os iniciadores e o SYBR
Green. As molculas no-ligadas do
SYBR Green apresentam
fluorescncia fraca produzindo um si-
nal mnimo sendo este subtrado du-
rante a anlise de computador. Aps o
reconhecimento dos iniciadores, algu-
mas molculas do SYBR Green po-
dem ligar-se na fita dupla previamen-
te formada. Durante a polimerizao
catalisada pela enzima Taq DNA
polimerase, as molculas do SYBR
Green vo se ligando ao DNA recen-
temente sintetizado. Assim, a reao
Figura 1: Curva de amplificao do PCR em Tempo Real. C
T
Cycle Threshold. A
amplificao mostra 3 fases distintas (1) linha basal: no houve produtos da PCR
suficiente para detectar a fluorescncia; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR
dobra a cada ciclo e (3) fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
Figura 2: Molcula de SYBR
Green entre a fita dupla de
DNA.
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monitorada continuamente e um au-
mento da fluorescncia observado
em tempo real. No ciclo seguinte, na
etapa de desnaturao do DNA, as
molculas do SYBR Green so libe-
radas e h queda no sinal da
fl uorescnci a. A deteco da
fluorescncia no fim da etapa de ex-
tenso de cada ciclo da PCR permite
monitorar a quantidade crescente de
DNA amplificado (VITZTHUM et al.,
1999).
As duas alternativas mais utiliza-
das alm do SYBR Green so
TaqMan e Molecular Beacons, am-
bos com capacidade de hibridizao
gerando transferncia de energia para
quantificao.
4.1.2. TaqMan
TaqMan uma sonda (fragmen-
to de DNA marcado usado para
hibridizar outra molcula de
DNA) utilizada para detectar
seqncias especficas nos
fragmentos de DNA amplifi-
cados na PCR. Esta sonda apre-
senta em uma extremidade
um fluorforo, e na outra ex-
tremidade um quencher (mo-
lcula que aceita energia do
fluorforo na forma de luz e a
dissipa na forma de luz ou calor) como
mostrado na Figura 3. Os produtos da
reao so detectados pel a
fluorescncia gerada aps a atividade
exonuclease 5'>3' da Taq DNA
polimerase.
Durante a PCR em tempo real a
sonda TaqMan hibridiza com a se-
qncia da fita simples de DNA com-
plementar alvo para a amplificao.
No processo da amplificao a sonda
TaqMan degradada devido ativi-
dade exonuclease 5'>3' da Taq DNA
polimerase, separando o quencher da
molcula fluorescente durante a ex-
tenso. A separao do fluorforo do
quencher resulta em um aumento da
intensidade da fluorescncia (Figura
4). Assim, durante o processo de am-
plificao a emisso de luz aumenta-
da de forma exponencial. Esse au-
mento da fluorescncia ocorre apenas
quando a sonda hibridiza e quando a
amplificao da seqncia alvo
estabelecida (HEID et al., 1996).
A reao com a TaqMan con-
siderada um mtodo sensvel para
determinar a presena ou ausncia de
seqncias especficas (HOLLAND et
al., 1991).
Molecular beacons
Molecular beacons so
oligonucleotdeos usados como son-
das de fita simples que formam uma
estrutura secundria entre as extremi-
dades 5 e 3, chamada de haste-e-
loop. O loop contm uma seqncia
que complementar seqncia-alvo
e a haste formada pelo anelamento
das seqncias complementares que
esto localizadas nas extremidades.
Um fluorforo covalentemente liga-
do no final de uma extremidade e um
quencher covalentemente ligado na
outra extremidade (Figura 5A). Os
oligonucleotdeos molecular beacons
no emitem fluorescncia quando es-
to livres em soluo. Entretanto, quan-
do hibridizam com a fita de DNA
contendo a seqncia-alvo, as sondas
assumem uma mudana
conformacional tornando-a capaz de
emitir fluorescncia (Figura 5B).
Figura 3: Ilustrao de uma sonda TaqMan.
F Fluorforo e Q quencher.
Figura 4: PCR em tempo real com sonda TaqMan.
1.Polimerizao
3.Clivagem
2.Substituio da fita
Fluorforo
Quencher
4.Polimerizao finalizada
Iniciador reverso
Iniciador foward
SONDA
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Na ausnci a de al vos, o
ol i gonucl eot deo no emi t e
fluorescncia, pois o quencher est
prximo do fluorforo captando ener-
gia. No momento em que o molecular
beacon encontra o seu alvo, ocorre a
hibridizao resultando em uma reor-
ganizao conformacional, onde o
fluorforo de dissocia do quencher,
emitindo assim a fluorescncia.
Os molecular beacons podem
ser sintetizados com diferentes cores
de fluorforos, possibilitando ensaios
que necessitam detectar diferentes
alvos em uma mesma reao. So
altamente especficos permitindo dis-
criminar seqncias-alvo que diferem
entre si por apenas um nucleotdeo
substitudo. So sondas ideais, no en-
saio diagnstico para identificao ge-
ntica, deteco de SNP (single
nucleotide polymorfism) e aplicaes
farmacogenticas (KRAMER, 2004).
Utilizao da PCR em
Tempo Real
O sistema de quantificao em
tempo real tem as seguintes aplica-
es:
Identificao de alelos em DNA
genmico;
Anlise de seqncias virais,
bacterianas ou de protozorios a partir
de vrias fontes;
Anlise de patgenos em ali-
mentos;
Anl i se de produt os
transgnicos;
A aplicao em diagnsticos, como
a deteco de patgenos, ou doenas,
torna-se interessante uma vez que
esta tcnica permite a quantificao e
rapidez do resultado, pois no mais
requer a deteco em gel de
eletroforese, necessrio na anlise da
PCR.
Concluso
As tcnicas associadas biologia
molecular e engenharia gentica
progrediram muito desde a dcada de
50, quando o DNA teve sua estrutura
descrita. O avano foi to grande que
em pouco tempo, pouco mais de 50
anos, suas aplicaes prticas j
permeiam o nosso cotidiano.
A descoberta da PCR faz parte
desse progresso, sendo que o mais
novo avano tecnolgico partiu da
prpria PCR, gerando a PCR em Tem-
po Real, que permite a quantificao
das amostras amplificadas, sendo de
grande relevncia para diagnsticos
de patgenos e doenas genticas.
Dentre as vantagens, esta tcnica em
relao PCR qualitativa esto a faci-
lidade na quantificao, maior sensibi-
l i dade, mai or preci so,
reprodutibilidade e acurcia, velocida-
de na anlise, melhor controle de qua-
lidade no processo e menor risco de
contaminao.
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Figura 5: (A) Oligonucleotdeo usado como sonda sintetizado de modo a
possibilitar a formao de uma estrutura secundria nas extremidades 5e 3. (B)
Toda fita nova formada durante a amplificao alvo para o anelamento do
molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescncia.
A
B