DETERMINACIN DE PROTENAS MTODO DE LOWRY

FUNDAMENTO DEL MTODO DE LOWRY Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del Biuret, el complejo protena-C !" #e $a%e rea%%&onar %on e' rea%t&(o )e Fo'&n-C&o%a'te #* dando una coloracin azul, con un mximo de absorcin a 650 mm. La coloracin se atribuye a la reduccin del cido fosfomol bdico!fosfot"n#stico a azul de $eteropolimolibdeno de composicin no definida, por medio de los residuos tirosilos, tripofanilos, y en menor #rado, cisteinilos e $istidilos de las prote nas %ue forman el complejo con el &u'(. CARACTERSTICAS DEL MTODO La intensidad de la coloracin )ar a con la composicin de aminocidos. *s ms sensible %ue el ensayo del Biuret. *l ran#o es de 0,+ a ,+ m#!ml. Presenta muc$as interferencias. *l reacti)o de -olin .cido fosfomol bdico,fosfot"n#stico/ es reducido por las prote nas para formar un complejo azul de molibdeno. *s ms sensible %ue el Biuret, pero mas tedioso de realizar. Puede detectar cantidades del orden de 0.+ m# de prote na0 el m1todo se basa en la reaccin de prote nas con el &u.22/ en medio alcalino y tambi1n de la reaccin de #rupos fenlicos .mayoritariamente tirosina en prote nas/ con un reacti)o denominado de -olin, &iocalteau %ue contiene fosfomolibdato y fosfo3olframato. Las prote nas reaccionan con el reacti)o de -olin,&iocalteau para dar un complejo coloreado. *l color %ue se forma se debe a la reaccin del cobre con la prote na. La intensidad de color depende del n"mero de aminocidos aromticos presentes en especial la tirosina y el triptfano. La t1cnica se basa en la reduccin de una mezcla de cidos %ue forman el reacti)o crom#eno de -olin,&iocalteu por la oxidacin de los aminocidos aromticos de las prote nas. 4e utiliza cobre como catalizador de la reaccin ya %ue este ultimo forma un es%ueleto con la estructura pept dica %ue facilita la transferencia de electrones a la mezcla cromo#1nica de cidos, produciendo una o mas especies reducidas las cuales tiene un caracter stico color azul con una 5mx 675,650 8m y una 5min a 750 8m. 9l producirse dic$a reaccin $ay un cambio en el color de la muestra %ue puede ser cuantificado determinando la absorbancia a 660 8m. :entro de determinados ran#osa de concentracin de prote nas existe una relacin lineal entre C y 9bs 660. 9 concentraciones altas de prote nas la linealidad se pierde y por lo tanto este m1todo no ser adecuado para determinar el C real. *l ran#o adecuado es de 5 a +0 +&%ro,ra+o# de prote nas. *xiste una amplia lista de sustancias .como buffers, deter#entes, l pidos, etc./ %ue interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinacin de la C real. La solucin a este problema se consi#ue diluyendo la muestra, y as la cantidad e interferente o por precipitacin de las prote nas y resuspensin en un buffer sin interferentes. *l m1todo de -olin Lo-r. es capaz de medir cantidades de prote nas en forma mas precisa, en micro#ramos. Por ejemplo en un )irus, detecta las prote nas con muc$a ms exactitud.

Mater&a'/ , , , , , , , , ;amiz .60 mes$/ <ortero *spectrofotmetro 9#itadores Barras ma#n1ticas &entr fu#a ;ubos de ensayo Pipetas

Rea%t&(o# , , , , , , , =a&2 0,+5 < &arbonato de sodio an$idro =a>? 4ulfato de cobre ;artrato de sodio y potasio @eacti)o de fol n 9lbumina de suero bo)ina

Prepara%&0n )e 'a# M e#tra#/ , , , , , ;omar 50 #r. de frijol y moler $asta una #ranulometr a A de 60 mes$. @eser)ar una porcin para determinacin de =itr#eno total. Preparar suspensiones de 5B., +0B., +5B y '0B en soluciones de =a&2 0.+5 < y a#itar por + $ora .una por #rupo/. &entrifu#ar y medir el )olumen del sobrenadante. @eser)ar una al cuota para determinacin de nitr#eno total. .Cjelda$l/. :eterminar el contenido de prote nas por el m1todo de Lo3ry. La muestra debe ser preparada a partir del extracto $aciendo una dilucin de +!'0 y tomando al cuotas de 0,' y 0,D ml. 12 So' %&0n a'%a'&na/ &arbonato de sodio an$idroEEEEEEEEEEEEEEE '0 #. =a>?EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE.. 7 #. 9#ua destiladaEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE +000 mL

!2

So' %&0n )e S '3ato )e Co4re/ &u4>7EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE.. ' #.

9#ua destiladaEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE +00 mL 52 So' %&0n )e tartrato )e #o)&o . pota#&o/ ;artrato de sodio y potasioEEEEEEEEEEEEEEE 7 #. 9#ua destiladaEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE +00 mL 62 M&7t ra rea%t&(a/ 9dicionar en ese orden .para no formar pp/. Preparar diariamente 4olucin n"mero ' .&u4o7/EEEEEEEEEEEEEE.. ' mL 4olucin n"mero D .tartrato de sodio o potasio/ EEEEEE ' mL 4olucin alcalina .+/ EEEEEEEEE. &ontemplar para +00 mL 82 , , , , , , , So' %&0n e#to9 e )e Fo'&n C&o%a'tea / *n un baln de '00 mL, disol)er +00# de tun#stato de sodio y '5 # de molibdato de sodio .=a'<o>7 . '?'>/ adicionar 600 mL de a#ua destilada. 9dicionar +00 mL de ?&L concentrado y 50 mL de ? DP>7.F5B/. 9daptar a un condensador de reflujo y $er)ir le)emente durante +0 $oras. *nfriar. 9dicionar +50# de Li4o7, 50 mL de a#ua destilada y al#unas #otas de bromo .en campana extractora/. *nfriar. &ompletar a +000 mL con a#ua destilada, el color de este reacti)o debe ser amarillo,dorado. La re#eneracin puede ser $ec$a por la adicin de #otas de bromo y $er)or por +5 minutos cuando se presenta )erdosa.

:2 ,

Rea%t&(o )e Fo'&n C&%o%a'tea )&' &)o/ :iluir un )olumen de reacti)o esto%ue .5/ con .'/ )ol"menes de a#ua destilada. *s recomendable titular con =a>? +=, de tal forma %ue corresponda a un cido +=.

;2

So' %&0n )e NaO< 1N =a>?EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE.. 9#ua destiladaEEEEEEEEEEEEEEEEEEE.. 7# +00 mL

=2 , ,

So' %&0n pa)r0n )e A'4 +&na >o(&na Pesar +00 m# de suero alb"mina bo)ina y 0,+ mL de =a>? +=. :isol)er con a#ua destilada y completar para +00 mL .sin muc$a a#itacin/.

PROCEDIMIENTO ="mero ;ubos + ' D 7 5 6 6 F Blanco <uestra Padrn &oncent 49B .mL/ .m#./ G 0,+ 0,' 0,D 0,7 0,5 0,6 0,6 0,F ,,, 0,' 0,05 0,+0 0,+5 0,'0 0,'5 0,D0 0,D5 0,70 ,,, ,,, ?'> .mL/ 0,J 0,F 0,6 0,6 0,5 0,7 0,D 0,' +,0 0,F <ez react .mL/H 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 -ol n .mL/HH 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 9bsor) .660 nm/ I 0,+65 0,'65 0,D55 0,750 0,6 0,605 0,67 0,65 0,00 0,5

H *sperar +0 minutos HH *sperar D0 minutos y leer la absorbancia a 660 nm. Ca'% 'ar 'a %on%entra%&0n )e protena# a tra(?# )e/ 12 Le%t ra )&re%ta en e' ,r@3&%o2 *n el #rafico nos da un )alor a partir de una absorbancia de 0,5 de 0,'' m# de concentracin, a partir de a$ realizamos los si#uientes clculosK

Las diluciones fueronK +0# ! +00 mL L 6F mL L + mL ! '5 mL L 0,' mL L 0,'+J7 m#

x M 0,'' m#. y M 0,5 y M a(bx

0,'' m# N 0,' mL G N '5mL G M '6,5 m# N + mL G N 6F mL G M ',+75 # N 6F mL G N +00 mL G M ',65# N +0 # G N +00 # A B !;*8C

!2 ECUACIN DE LA RECTA Otilizando el m1todo de la recta en ajuste de cur)as o por re#resin lineal, donde se introdujeron todos los datos se obtu)o el si#uiente porcentajeK Las diluciones fueronK +0# ! +00 mL L 6F mL L + mL ! '5 mL L 0,' mL L 0,'+J7 m# a M 0,+0+6F6 m#. b M +,6J66' y M 0,5 real y M a(bx x M 0,''+5 0,''+5 m# N 0,' mL G N '5mL G M '6,6F65 m# N + mL G N 6F mL G M ',+5J6 # N 6F mL G N +00 mL G M ',66FF# N +0 # G N +00 # A B !;*:DC t&'&Ean)o 'a &n%'&na%&0n )e 'a

52 Ap'&%a%&0n )&re%ta )e 'a 'e. )e 4eer* re%ta2 Otilizando la ley de beer se obtu)oK Las diluciones fueronK +0# ! +00 mL L 6F mL L + mL ! '5 mL L 0,' mL L 0,'+J7 m#

a M 0,++6+ b M +,65 r M J6B x M 0,5 P 0,++6+ +,65 x M 0,'+J7 m#. y M a(bx

0,'+J7 m# N 0,' mL G N '5mL G M '6,7'5 m# N + mL G N 6F mL G M ',+DJ+5 # N 6F mL G N +00 mL G M ',67'5# N +0 # G N +00 # A B !;*65C