Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.

, 1993,12 (2), 385-404

Hibridizacin de cidos nucleicos y amplificacin en cadena por polimerasa en el diagnstico de enfermedades infecciosas de los animales
M. R O D R G U E Z y A . A . S C H U D E L *

Resumen: Los autores describen el uso de mtodos de deteccin de cidos nucleicos genmicos - hibridizacin de cidos nucleicos y amplificacin en cadena por polimerasa (polymerase chain reaction) - en el diagnstico de enfermedades infecciosas de animales domsticos. La amplificacin en cadena por polimerasa es una poderosa herramienta que permite la amplificacin exponencial in vitro de un fragmento genmico especfico del cido desoxirribonucleico. En la actualidad se la utiliza para estudiar la patogenia a nivel molecular de numerosas enfermedades infecciosas y tambin como un eficaz mtodo diagnstico. Dado que posee gran especificidad y una sensibilidad superior a la de los mtodos convencionales, y que no requiere infraestructura compleja, ser en un futuro cercano la tecnologa de uso diario de veterinarios de campo, funcionarios del rea de salud y laboratorios de diagnstico veterinario. P A L A B R A S CLAVE: Amplificacin Diagnstico - Sanidad animal - Sondas. en cadena por polimerasa -

INTRODUCCIN
El diagnstico de e n f e r m e d a d e s infecciosas ha sufrido limitaciones r e s u l t a n t e s de la complejidad de las tcnicas, la infraestructura necesaria y la lentitud de los procedimientos disponibles para la deteccin y caracterizacin de patgenos. Con el advenimiento de la tecnologa de sondas moleculares, los veterinarios de c a m p o , funcionarios de sanidad animal y l a b o r a t o r i o s de diagnstico p o d r n disponer de nuevos mtodos que ofrecen una sensibilidad y especificidad similar o superior a la de los procedimientos convencionales y que, adems, al ser mtodos rpidos (resultados en el mismo da), dan la oportunidad de tomar medidas de control ms racionales. La presencia de agentes infecciosos en muestras de tejido o muestras fluidas puede ponerse de manifiesto a travs de su visualizacin microscpica, actividad biolgica o la deteccin de sus componentes estructurales - protenas antignicas y cidos nucleicos.

* Instituto de Virologa, Instituto nacional de tecnologa agropecuaria, Centro de investigaciones en ciencias veterinarias, C.C. 77, Morn 1708, Argentina.

386 La secuencia nucleotdica del genoma de cada patgeno es nica, esto es, diferente a la de otros microorganismos y de los cidos nucleicos del animal husped. Este hecho representa la base del desarrollo de recientes tcnicas diagnsticas: la hibridizacin de cidos nucleicos y la amplificacin en c a d e n a p o r polimerasa (polymerase chain reaction: P C R ) . Sus caractersticas y aplicaciones en el diagnstico de enfermedades infecciosas de animales domsticos son decritas en esta revisin. A fin de obtener una visin ms amplia, el lector podr consultar excelentes publicaciones previas sobre estas tecnologas (15,20,24,27,52,56,57,61,67).

CONSIDERACIONES TCNICAS
La deteccin de cidos nucleicos se basa en la p r o p i e d a d de cadenas simples y complementarias de reasociase. Si una de estas cadenas (sonda) es marcada, es posible detectar la presencia de la otra en una muestra mediante una prueba de hibridizacin. Por otra parte, si se utilizan dos pequeas sondas (cebadores o primers) en condiciones de reaccin adecuadas, es posible detectar hasta mnimas cantidades de cido nucleico en un patgeno a travs de una prueba PCR (Fig. 1).

Dot blot
Hibridizacin

Marcacin radioactiva Marcacin no radioactiva Biotina Digoxigenina Sulfonilacin

In situ
Reaccin en cadena por polimerasa

Amplificacin

Los resultados pueden leerse en geles de agarosa o por hibridizacin

FIG.l

Las tcnicas de deteccin de cidos nucleicos dominantes para la deteccin de agentes infecciosos

Extraccin de cidos nucleicos El paso inicial d e la deteccin d e cidos nucleicos ( A N ) es su extraccin de la muestra. G e n e r a l m e n t e , muestras fluidas u h o m o g e n e i z a d a s son incubadas con detergentes y digeridas con proteasa a fin de liberar a los A N que se s e p a r a n de protenas, lpidos y restos celulares m e d i a n t e una extraccin fenlica. El A N se precipita con etanol y se siembra en una m e m b r a n a de nylon o nitrocelulosa p a r a hibridizar, o bien es usado directamente en PCR. Cuando el A N de inters es cido ribonucleico (ARN), deben tomarse precauciones para evitar su degradacin por ribonucleasas (ARNsas). Todo material, vidrio o agua que tomara contacto con la muestra debe tratarse. D e b e utilizarse material plstico descartable autoclavado y guantes en todo momento. Las muestras deben procesarse en fro y rpidamente. Inhibidores de ARNsas como vanadil-ribocomplejos y extractos de placenta (ARNsin) son tiles para evitar esta degradacin (64).

387 Los mtodos tradicionales de extraccin han sido en algunos casos reemplazados con xito por protocolos ms sencillos. Ejemplos de stos son la purificacin del cido desoxirribonucleico ( A D N ) de citomegalovirus a partir de muestras de orina con polvo de vidrio (11) y la liberacin de genomas del virus de la hepatitis B presentes en suero, mediante incubacin de la m u e s t r a a 100C p o r unos m i n u t o s ( F . E . Baralle, comunicacin personal). Hibridizacin Clsicamente las sondas se producen por insercin de secuencias del gene de inters en el A D N de plsmidos o vectores bacterifagos, que pueden ser propagados para obtener cantidades adecuadas de sonda (2). D e la biblioteca de secuencias genmicas obtenidas se seleccionan clones con determinadas caractersticas: especificidad, sensibilidad y reactividad con un amplio espectro de cepas de campo. La pureza del A N que se utiliza como sonda es fundamental para evitar seales de fondo que haran difcil la interpretacin de los resultados. La excisin del fragmento de A D N clonado reduce el ruido de fondo debido a hibridizacin inespecfica con secuencias del husped o contaminantes. Una estrategia alternativa para la produccin de sondas es el uso de oligonucletidos sintticos, sondas A R N y productos de PCR. El diseo de sondas de oligonucletidos se basa en la informacin existente de la secuencia del patgeno. Pueden ocurrir diferencias de bases c u a n d o estas sondas son utilizadas p a r a detectar aislados de campo con la consiguiente reduccin del grado de interaccin e n t r e sonda y A N blanco. Varios autores han sealado que si se eligen regiones genmicas conservadas y si las condiciones de hibridizacin son optimizadas, este tipo de sonda puede ser til para la deteccin de virus (9,10, 30). Las sondas de A R N , que deben ser manejadas teniendo en cuenta la presencia de ARNsas en el medio, pueden ser sintetizadas in vitro en grandes cantidades usando plsmidos recombinantes especiales, como los que contienen el promotor SP6. Dado que las sondas de A R N son de cadena simple (ss) no existe reasociacin que compita con el A N blanco d u r a n t e la hibridizacin, lo que garantiza una m a y o r sensibilidad (1). Si la P C R ha sido optimizada para un microorganismo particular, se pueden producir sondas para su deteccin utilizando cebadores ( primers) marcados o desoxirribonucletidos unidos a residuos de biotina o digoxigenina. Las sondas p u e d e n ser marcadas con istopos o marcadores no radioactivos tales como la biotina o la digoxigenina. Esto se lleva a cabo a travs del reemplazo de una proporcin de nucletidos de la sonda por nucletidos marcados (nick translation y random priming) o agregando nucletidos marcados a un extremo de la sonda (end labelling). El A N p u e d e ser t a m b i n q u m i c a m e n t e modificado (sulfonado) de tal manera que su presencia es d e t e c t a b l e p o r m e d i o de un a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l especfico. A u n q u e el P ha sido el marcador de eleccin cuando una alta sensibilidad es esencial, existen muchos informes y la propia experiencia de los autores, que indican que p u e d e ser r e e m p l a z a d o por m a r c a d o r e s no radioactivos. Estos ltimos ofrecen importantes ventajas operativas tales como larga vida til y ausencia de riesgos para la salud del operador.
3 2

La biotina presenta una gran afinidad con la avidina. Si esta ltima es marcada con una enzima como peroxidasa o fosfatasa alcalina, es posible leer los resultados de una reaccin de hibridizacin por m t o d o s colorimtricos. E n forma similar, el h a p t e n o digoxigenina es usado para marcar sondas que son detectables por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con enzimas. Fluorocromos conjugados a biotina o anticuerpos han sido utilizados con xito en p r u e b a s de hibridizacin in situ p e r m i t i e n d o la localizacin de secuencias particulares en cortes de tejido y monocapas celulares.

388 Una prueba de hibridizacin se lleva a cabo incubando en condiciones apropiadas una sonda marcada por algn medio con la m e m b r a n a en la que se han sembrado los A N extrados de muestras. Luego de varios lavados, la m e m b r a n a es expuesta a una pelcula sensible a radiaciones si la sonda fue marcada con istopos, o procesada para la visualizacin colorimtrica de los resultados si se utiliz marcacin no radioactiva (27). Amplificacin en cadena por polimerasa Esta tcnica, descrita por p r i m e r a vez p o r Saiki y col. (63), hace posible la amplificacin de una secuencia de A D N especfica un milln de veces o ms. Si la secuencia de inters es A R N debe sintetizarse una copia A D N por transcripcin reversa antes de realizar la prueba P C R . E s t a reaccin requiere un proceso de ciclado que comprende tres etapas: a) desnaturalizacin del A D N , b) anillado de cebadores, y c) extensin de cebadores. D u r a n t e la desnaturalizacin a 93C-95C, las dos cadenas de A D N se separan. Durante el anillado los cebadores se unen a regiones complementarias que bordean la secuencia blanco a la derecha (5') o a la izquierda (3'). Durante la primera extensin, se producen nuevas cadenas de A D N al agregar nucletidos, en el extremo 3 ' de cada cebador anillado, a la cadena de A D N suelta. Este proceso ocurre mediante el efecto cataltico del A D N polimerasa termoestable. El nmero de copias de A D N se duplica al final de cada ciclo, y luego de 30 a 45 ciclos, se a c u m u l a n millones de copias (denominadas amplicones) de la secuencia de inters (Fig. 2).
2 cadenas (original)

(a)

(b)

(c)

4 cadenas ( p r i m e r ciclo)

8 cadenas (segundo ciclo) (d) M i l l o n e s de copias (30-40 ciclos)

FIG.2

El proceso de la amplificacin en cadena por polimerasa

Las cadenas de cido desoxirribonucleico ( A D N ) del patgeno (a) son separadas (desnaturalizadas) a 94C y los cebadores (primers) hibridizan (anillan) a sus secuencias complementarias a 37-60C (b). E n un tercer paso (extensin) una A D N polimerasa termoestable produce cadenas complementarias a 72C (c). Si este proceso de 3 pasos es repetido 30 a 40 veces se produce una acumulacin exponencial de copias de A D N (d) y la secuencia blanco de origen es amplificada millones de veces

389 Seleccin de cebadores (primers) Los cebadores son oligonucleotidos sintticos ss cuya secuencia es complementaria al extremo izquierdo de una de las c a d e n a s o al e x t r e m o d e r e c h o de la otra del fragmento g e n m i c o q u e se ha de amplificar. A fin de disear c e b a d o r e s p a r a la deteccin de un patgeno en particular es necesario contar con datos de la secuencia de su genoma. Generalmente las zonas genmicas ms adecuadas para pruebas de P C R sobre material de campo son aquellas que estn conservadas entre los aislados, aunque diferencias de 2 o 3 bases no inhiben necesariamente la amplificacin enzimtica. Luego de la seleccin de un fragmento genmico para P C R se trata de identificar cebadores (pares de oligonucletidos 18-24 mer) con ciertas caractersticas: - contenido de 40% a 60% de G+C, - ausencia de polipurinas o polipirimidinas, - ausencia de estructura secundaria, y - ausencia de complementariedad, en particular en el extremo 3 ' entre cebadores, para evitar la formacin de un artefacto denominado dmero de cebadores. Existen programas de computacin, accesibles por pedido, que son tiles para llevar a cabo la seleccin (62). D a d o que la eficiencia de la prueba P C R disminuye cuando la longitud del fragmento que se ha de amplificar aumenta, los cebadores seleccionados no deben estar separados entre s por ms de 600 bases. Optimizacin de la amplificacin en cadena por polimerasa Los c o m p o n e n t e s bsicos de una reaccin de P C R son los c e b a d o r e s , deoxinucletidos ( d N T P s ) , un buffer que contiene cloruro de magnesio, una A D N polimerasa termoestable y A D N blanco. La concentracin de los componentes y los parmetros de duracin y temperaturas de ciclado deben ajustarse para la amplificacin eficiente de cada A D N . U n punto inicial sera 200 M de cada dNTP, 0,2 M de cada primer, una concentracin de Cl Mg de 1,5 mM, 2,5 unidades de enzima y 10.000 copias de A D N blanco semipurificado. La temperatura de anillado es definida inicialmente por las caractersticas de los cebadores, mientras que la desnaturalizacin y extensin generalmente se llevan a cabo a 94C y a 7C, respectivamente. Treinta y cinco ciclos de 90 seg para cada paso en general permiten visualizar la banda amplificada en geles de agarosa. El paso siguiente consiste en determinar la concentracin ptima de Cl Mg, entre 1 y 6 mM. Si se detectan en el gel productos inespecficos adems del amplicn del tamao esperado, puede ser necesario elevar la temperatura de anillado, optimizar la concentracin de cebadores o ensayar otros cebadores. Luego deben realizarse pruebas disminuyendo el nmero de molculas de A N blanco y preparando muestras artificiales que incluyen controles positivos y negativos. F i n a l m e n t e , a fin de d e t e r m i n a r la sensibilidad y especificidad del protocolo desarrollado, se debe examinar un nmero significativo de muestras de campo y controles negativos, y comparar los resultados con aquellos obtenidos con tcnicas de referencia convencionales.
2 2

Deteccin de amplicones El producto de la prueba P C R (amplicn) generalmente se detecta como una banda en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio. Su tamao, comparado con los pesos moleculares de referencia, corresponde a la longitud de la secuencia blanco definida por los cebadores. La identidad del producto amplificado es confirmada por hibridizacin

390 con un oligonucletido sonda cuya secuencia es complementaria a una zona interna de una de las cadenas del amplicn, y por la presencia de sitios de restriccin que cortan el amplicn en fragmentos de t a m a o predecible visibles en gel de agarosa. La hibridizacin se lleva a cabo con producto de P C R sembrado en membranas (tcnica del dot blot) o luego de la transferencia de cidos nucleicos presentes en gel de agarosa a una membrana (tcnica del Southern blot). Estos procedimientos son relativamente complejos y excesivamente largos para el laboratorio de diagnstico microbiolgico. U n a alternativa interesante que podra permitir el procesamiento de un gran nmero de muestras simultneamente y an su automatizacin, es la captura especfica del amplicn por una fase slida, seguida de una deteccin colorimtrica. Esta estrategia utiliza placas de 96 pozos a los cuales se ha unido covalentemente una sonda de captura (55). Las molculas de P C R generadas usando cebadores marcados con biotina son atrapadas y la presencia de los hbridos detectada con un conjugado estreptavidina-peroxidasa en presencia de un sustrato cromognico (35). Organizacin del laboratorio para las pruebas de amplificacin en cadena por polimerasa y prevencin de contaminacin Resultados falsos positivos de la prueba P C R resultan de la contaminacin de una muestra por amplicones de reacciones previas. Dado que en cada reaccin positiva se p r o d u c e n millones de copias y que slo son necesarias unas pocas molculas contaminantes p a r a producir un resultado falso positivo, d e b e n t o m a r s e ciertas precauciones. La incorporacin de controles positivos, negativos y sin A D N en cada prueba resulta esencial para detectar este fenmeno denominado carryover. Varias normas, adems de una buena prctica de laboratorio, deben ser adoptadas (37): - usar diferentes laboratorios y equipos para manipulaciones pre y post-PCR, - autoclavar el agua, buffers, puntas de pipeta y material plstico y exponer las mesas de trabajo a luz ultravioleta, - preparar alquotas de reactivos de uso diario en un ambiente libre de producto amplificado, - agregar el A D N al final a cada tubo. Los experimentos crticos deben repetirse y siempre que sea posible debe utilizarse en ellos dos pares de cebadores que amplifiquen fragmentos genmicos distintos.

APLICACIONES DIAGNSTICAS
Aunque las pruebas de hibridizacin sirven muy bien algunos propsitos especficos, su sensibilidad relativamente baja y la complejidad de su realizacin han limitado su aplicacin en laboratorios de diagnstico. Esta tecnologa ha sido extensamente revisada recientemente por Knowles y Gorham (36). Por otra parte, la alta sensibilidad de la prueba PCR, que es usualmente superior a la de las tcnicas convencionales, hace de esta tcnica una verdadera candidata para reemplazar muchos de los procedimientos utilizados actualmente para la deteccin rpida de patgenos. Gracias al hecho que muy pocas molculas de cido nucleico genmico son suficientes para detectar un patgeno, los laboratorios que implementan la prueba P C R con propsitos diagnsticos son cada vez ms numerosos.

391 A diferencia de las tcnicas convencionales que r e q u i e r e n una infraestructura distinta para cada grupo de microorganismos, la implementacin de la p r u e b a P C R necesita reactivos y procedimientos similares para todos los patgenos. Deteccin del virus de la fiebre aftosa por amplificacin en cadena por polimerasa Con propsitos ilustrativos se describir a continuacin el desarrollo y evaluacin de un protocolo para la deteccin del virus de la fiebre aftosa (VFA) por PCR. Se eligi para amplificacin enzimtica el gen que codifica para la polimerasa viral, localizado cerca del extremo 3 ' del genoma viral, p o r q u e su secuencia, adems de ser disponible, est altamente conservada en los distintos serotipos (45). Se identificaron oligonucletidos con varias caractersticas, incluyendo la ausencia de estructura segundaria y un contenido G+C de 50% a 60%, mediante la utilizacin de un programa de computacin (62). La concentracin de los diferentes reactivos y los parmetros de duracin y temperatura de ciclado fueron optimizados utilizando un plsmido en el cual se haba insertado la secuencia de inters. Las condiciones de transcripcin reversa fueron definidas utilizando ARN viral purificado. La extraccin de A R N de muestras se realiz segn el protocolo desarrollado ad hoc por Meyer y col. (47). Los resultados se leyeron en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio y fueron confirmados por hibridizacin de los productos amplificados sembrados en membrana de nylon con una sonda de 30 bases marcada con digoxigenina (Rodrguez y col., manuscrito en preparacin). A fin de d e t e r m i n a r la sensibilidad y especificidad de la p r u e b a , se realizaron experimentos utilizando diluciones de suspensiones virales de los serotipos A , O y C, muestras artificiales y tejidos t o m a d o s en la necropsia de bovinos infectados experimentalmente (Cuadros I y II). A d e m s , se obtuvieron datos adicionales que indicaron una especificidad de 100% al examinarse 50 muestras de distintos tejidos (epitelio lingual, faringe, ganglio linftico, esfago, pulmn y rion) de bovinos sanos e infectados experimentalmente (P. Murphy y col., comunicacin personal). Los resultados experimentales indican que la p r u e b a de P C R desarrollada para la deteccin del V F A es especfica y que su sensibilidad es por lo menos del mismo orden de magnitud que la de los m t o d o s convencionales cuando los resultados se leen en geles de agarosa. U n a sensibilidad m a y o r se observa luego de la hibridizacin del producto de P C R . Se r e q u i e r e n m e n o s de 24 horas p a r a procesar muchas muestras simultneamente y luego de su optimizacin la deteccin del V F A por este mtodo no necesita una infraestructura compleja.
CUADRO I

Evaluacin de la sensibilidad de la amplificacin en cadena por polimerasa para la deteccin del virus aftoso utilizando diluciones virales de los serotipos A, O y C Ttulo (log DL /ml)
10 50

Stock viral No. No. No. No.

5 0

Serotipo i i A87 C85

Sensibilidad

(DL50)
1,90 0,27 0,27 0,19

644 547 622 578

6,90 7,04 7,04 6,80

D L : dosis media para ratones recin nacidos Los resultados fueron ledos en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio, y confirmados por hibridizacin

392
CUADRO II

Evaluacin de la sensibilidad y especificidad de la amplificacin en cadena por polimerasa para la deteccin del virus de la fiebre aftosa utilizando muestras artificiales (a) y carne y epitelio tomados en la necropsia de animales experimentalmente infectados (b) Muestra a) Homogenato normal Homogenato normal Homogenato normal Homogenato normal b) Carne infectada Carne infectada Carne infectada Carne normal
01 01 01

Serotipo

Ttulo (DL /0,25 ml)

50

Resultados di de la PCR Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo

+ stock No. 567 + stock No. 567 + stock No. 567 + PBS

O Ol O

54,00 5,40 . 0,54

A O

c
A O

1,98 15,70 1,98 1,00 1,24 1,00

Epitelio Epitelio Epitelio Epitelio

infectado' infectado' infectado' normal

21 21 21

El ensayo se realiz con alcuotas de 0,25 ml de homogenatos 1/10 y los resultados fueron ledos en geles de agarosa y confirmados por hibridizacin PCR: amplificacin en cadena por polimerasa PBS: phosphate-buffered saline (1) muestras tomadas a los 3 das p.i. (2) muestras tomadas a los 16 das p.i.

OTRAS APLICACIONES DE LA AMPLIFICACIN EN CADENA POR POLIMERASA PARA LA DETECCIN Y CARACTERIZACIN DE AGENTES INFECCIOSOS
Virus Virus de la peste porcina africana Se disearon y sintetizaron cuatro primers y una sonda oligonucleotdica con el propsito de amplificar un fragmento de 740 pares de bases (pb) correspondientes a una zona conservada del genoma viral del virus de la peste porcina africana. Se amplific especficamente un fragmento de 640 pb y se realizaron ensayos con t e m p l a d o s extrados de rganos y plasma de animales infectados. Se determin que la prueba P C R es ms rpida y sensible que los mtodos convencionales (73). Virus de la leucemia endgena aviar A travs del uso de mtodos de amplificacin del A D N se secuenciaron genes de la envoltura viral encontrndose que secuencias de sub-grupo especficas poseen una alta homologa con las de R A V - O (Rous-associated virus type O) (60).

393 Poliomavirus aviar

Se desarroll un ensayo P C R para la deteccin del poliomavirus llamado B F D V (budgerigar fledgling disease virus). El ensayo utiliza un solo grupo de primers complementarios a una zona del gen de la p r o t e n a VP1 de B F D V . La p r u e b a es ltamente especfica y sensible, y permite detectar 20 copias del genoma viral. E s t e estudio sugiere la posibilidad de infeccin p e r s i s t e n t e de aves adultas y de la transmisin in ovo (58). Virus de la lengua azul Se a d o p t una p r u e b a P C R p a r a la deteccin de secuencias g l o b a l m e n t e conservadas, serogrupo especficas del A R N del virus de la lengua azul (BTV) (210 pb) de serotipos d e t e c t a d o s en E s t a d o s U n i d o s de A m r i c a . R e s u l t a d o s p r e l i m i n a r e s indican que es posible detectar menos de 2 fg de secuencias blanco del A R N de BTV, equivalentes a 7.500 partculas virales (16). Utilizando primers complementarios al segmento 7 de BTV-ISA, fue posible detectar 6 molculas por muestra del segmento 7 cadena doble (ds) A R N como t a m b i n A R N purificado de otros serotipos. Se obtuvieron resultados positivos en glbulos rojos de bovinos infectados conteniendo 16 T C I D p e r o no 1,6 T C I D (81). Primers construidos en base a la secuencia del segmento 3 que codifica p a r a la p r o t e n a reactiva V P 3 se usaron p a r a d e t e c t a r diferentes serogrupos en plaquetas, buffy coat y glbulos rojos de ovinos infectados (43).
5 0 5 0

Coronavirus

bovino

Se sintetizaron por P C R sondas A D N ss y ds p a r a la deteccin del Coronavirus bovino (BCV) utilizando plsmidos recombinantes como templado. Mediante P C R de fragmentos especficos se detectaron aproximadamente 10 genomas virales luego de la lectura en geles de agarosa (78). El diagnstico de BCV en 134 muestras clnicas fue ms eficiente por hibridizacin con sondas ss que con sondas ds sintetizadas por P C R o con una combinacin de 6 sondas plasmdicas de secuencias no yuxtapuestas (79). Herpesvirus bovino tipo 4 Se compar la prueba PCR con las tcnicas de hibridizacin y aislamiento en cultivo de tejidos para la deteccin del herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4) en tejidos de conejos e x p e r i m e n t a l m e n t e infectados. Se d e t e c t el virus p o r P C R en varios rganos, incluyendo tejido nervioso, que dieron resultados negativos p o r las otras tcnicas utilizadas (50). Virus de la inmuno deficiencia bovina

La infeccin de clulas de p u l m n e m b r i o n a r i o bovino con virus de la inmunodeficiencia bovina fue monitoreada por la formacin de sincicios y transcripcin reversa seguida por PCR; se determinaron las ventajas de esta ltima tcnica (33). Virus de la leucemia bovina

Se detect A D N proviral en A D N linfoctico y tumoral en todos los estadios de la infeccin de bovinos p o r amplificacin enzimtica e hibridizacin del p r o d u c t o amplificado (51). La prueba PCR para gag-p24, env-gp51, previa transcripcin reversa, fue utilizada para examinar la presencia de A D N especfico en clulas mononucleares perifricas de animales seropositivos y seronegativos. El protocolo permiti detectar 1 genoma viral entre 100.000 clulas (49). Utilizando cebadores para los genes pol y px del virus de la leucemia bovina se amplificaron consistentemente hasta 10 copias del

394 A D N del virus. Esta tcnica se utiliz con xito en un estudio a ciegas de clulas mononucleares sanguneas de 18 bovinos (72). Papillomavirus bovino

Por PCR se detect A D N del papillomavirus bovino (BPV) en el 70% de partidas comerciales de suero fetal bovino observndose una correlacin de 100% con los datos obtenidos por aislamiento (69). Se detectaron genomas de BPV por P C R en cortes de tejido fijado con formol de 20 sarcoides equinos utilizando primers correspondientes al marco de lectura abierta de la zona E5 del genoma viral de los tipos 1 y 2 de BPV. Estos resultados apoyan la visin generalizada que sugiere que el B P V desempea un papel importante en los sarcoides equinos (74). Rotavirus bovino

Por PCR se amplific A D N copia (cADN) del gen completo que codifica el antgeno neutralizante mayor. La prueba PCR posee 100.000 y 5.000 veces ms sensibilidad que el electroferotipo y la hibridizacin respectivamente, para la deteccin de rotavirus bovino en materia fecal (89). Virus de la diarrea viral bovina A travs de la amplificacin y secuenciado de la regin que codifica para la protena pl25 de un par homlogo del biotipo del virus de la diarrea viral bovina (BVDV), cepas Pe 515 citopatognicas y no citopatognicas fueron d e t e c t a d a s (18). Por m e d i o de primers de 20 pb localizados en la regin conservada cercana al extremo 3 ' genmico fue posible obtener un producto de 205 pb a partir del A D N del B V D V . La p r u e b a permiti detectar una molcula de c A D N clonado lo que demuestra que la sensibilidad de PCR es superior a 1 T C I D (42). La prueba P C R fue 10 veces ms sensible que los mtodos convencionales para la deteccin de B V D V (77). Primers que amplifican la zona 6322-7475 de la cepa N A D L se usaron para detectar B V D V en suero y glbulos blancos de bovinos persistentemente infectados (8). Seis secuencias de 20 bases de distintas reas genmicas fueron seleccionadas por anlisis de homologa de las cepas N A D L y Osloss de B V D V . La sonda c o r r e s p o n d i e n t e al extremo 5 ' del A R N viral (ND001), detect el 86% de los aislamientos citopticos y no citopticos analizados (38). Utilizando primers de la regin gp 48 de la cepa citoptica N A D L se d e t e c t B V D V en muestras de suero de animales p e r s i s t e n t e m e n t e infectados (6). Oligonucletidos cebadores degenerados diseados en base a la secuencia de dos cepas de B V D V y una de peste porcina clsica permitieron detectar al A R N viral en clulas infectadas in vitro y en linfocitos circulantes (83).
5 0

Virus de la artritis/encefalitis

caprina

Los virus de la artritis/encefalitis caprina y del Maedi-Visna fueron detectados por PCR (90). Virus del moquillo Morbillivirus de Phoca vitulina y cADN obtenido del morbillivirus de la peste bovina fueron detectados por P C R (25). Virus de la arteritis infecciosa equina Mediante transcripcin reversa y PCR con tres diferentes pares de primers se detect A R N genmico en muestras clnicas con una sensibilidad de hasta 600 P F U / m l en plasma seminal (14).

395 Herpesvirus equino tipo 1 Se examinaron por P C R cultivos celulares normales e infectados y 63 muestras de 29 fetos equinos abortados. Resultados generados en menos de 24 horas y evaluados en geles de agarosa y por hibridizacin con un oligonucletido sonda marcado con biotina mostraron una fuerte correlacin con aquellos obtenidos por aislamiento (3). A D N no purificado derivado de cultivos infectados con herpesvirus equinos tipos 1 y 4 fue amplificado por P C R utilizando un par de oligonucletidos cebadores. Restriccin enzimtica con P V u I I seguida p o r electroforesis revelaron un polimorfismo de los fragmentos de restriccin enzimtica lo que permiti la diferenciacin de los dos tipos virales (53). Virus de la anemia infecciosa equina

Se detectaron por P C R genomas del virus de la anemia infecciosa equina ( E I A V ) , cepa CL22, en clulas m o n o n u c l e a r e s perifricas de equinos infectados (87). Se monitore la presencia de secuencias provirales en clulas mononucleares de sangre perifrica en tres equinos por P C R . Luego de cada episodio virmico los niveles de provirus en monocitos perifricos disminuyeron a menos de 1 copia en 5 x 10 clulas (54).
6

Virus de la leucemia felina La prueba P C R fue utilizada para examinar la patognesis de la coinfeccin de gatos con virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (FeLV) (76). H a sido tambin utilizada para la deteccin de FeLV en neuroblastomas olfatorios felinos (68). Virus de la fiebre aftosa Se logr una rpida y sensible deteccin del virus de la fiebre aftosa en tejidos porcinos y bovinos por amplificacin enzimtica del gen de la polimerasa viral. La sensibilidad del mtodo fue de menos de 1 T C I D mediante hibridizacin del producto amplificado a una sonda marcada. No se observ reactividad cruzada con otros doce virus, incluyendo enterovirus (47).
5 0

Virus de la peste porcina clsica Luego de la transcripcin reversa del A R N total aislado de tejidos infectados, el cADN fue amplificado por PCR con una sensibilidad de 10.000 T C I D . La sensibilidad aument 1.000 veces luego de la reamplificacin con c e b a d o r e s i n t e r n o s (nested primers) (40).
5 0

Virus de la laringotraquetis infecciosa aviar El gen del virus de la laringotraquetis infecciosa aviar (IALV) homlogo del de la glicoprotena B (g B) del virus herpes simplex tipo 1 fue identificado por amplificacin del A D N genmico de I A L V (59). Virus de la bronquitis infecciosa

Se desarroll una tcnica de P C R que permite la tipificacin de aislamientos del virus de la bronquitis infecciosa causantes de nefritis (39). Influenzavirus A fin de determinar la persistencia del influenzavirus en gansos luego de la infeccin por va oral, se realiz una prueba P C R del gen de la hemoaglutinina; no se encontr ARN viral en muestras de bazo (82).

396 Virus del Maedi-Visna Utilizando mltiples cebadores que generan segmentos de A D N con extremos complementarios es posible detectar el virus del Maedi-Visna en cultivos celulares infectados con una sensibilidad superior de dos rdenes de magnitud a la de los mtodos existentes (26). Un aislamiento de un virus (EV-1) similar al virus del Maedi-Visna obtenido de una oveja con signos de artritis y neumona fue analizado por PCR con el propsito de demostrar el grado de homologa con cepas conocidas del virus del Maedi-Visna (65). Virus de la fiebre catarral maligna (alcelaphine herpesvirus type 1) Dos pares de cebadores de 30 bases, correspondientes a la secuencia nucleotdica del herpesvirus tipo 1 fueron utilizados con xito para la prueba P C R de lisados celulares crudos (31). U n fragmento del virus de la fiebre catarral maligna ( A H V - 1 ) fue subclonado en P V C 1 8 y secuenciado. Se desarroll PCR de dos pasos basndose en un fragmento del A D N de A H V - 1 clonado. Cinco aislamientos de A H V - 1 y A H V - 2 fueron especfica e idnticamente positivos. Los herpesvirus bovinos B H V - 1 , BHV-2 y B H V - 4 no pudieron ser d e t e c t a d o s p o r esta p r u e b a . P o r esta tcnica se detect 0,01 T C I D de AHV-1 (34).
5 0

Virus de la enfermedad de

Aujeszky

Secuencias genmicas del virus de la e n f e r m e d a d de Aujeszky ( P R V ) fueron amplificadas por PCR a partir de cultivos infectados, clulas nasales y rganos de cerdos con infeccin aguda y latente (5). Una prueba P C R de 25 ciclos permiti la deteccin de P R V presente en homogenatos celulares en 1 hora con una sensibilidad igual a la de los mtodos convencionales (32). A fin de investigar varios aspectos de la latencia de P R V en cerdos, se utiliz amplificacin enzimtica in vitro basada en P C R con primers del gen gpll en A D N extrado de ganglios trigminos de porcinos latentemente infectados con PRV. Cien fg de P R V - A D N se detectaron en geles y 1 fg (equivalente a 6 genomas virales) por PCR combinada con hibridizacin (41). Se detect A D N de P R V latente en 7 de 8 muestras utilizando cebadores correspondientes a los genes gX y gII por P C R combinada con hibridizacin (44). U n p r o t o c o l o de P C R (bases 433-651 de gp50) permiti detectar consistentemente en 24 horas P R V en m u e s t r a s de amgdala examinadas con el propsito de detectar latencia viral (85). A D N latente de P R V fue detectado por PCR en ganglios trigminos de 10 cerdos infectados por va intranasal con vacunas preparadas con cepas TK negativas de P R V a los 81 das o ms luego de la infeccin (80). Virus de la rabia Se investig m e d i a n t e P C R el sitio de multiplicacin de un virus de la vaccinia recombinante ( V V T G g R A B ) que expresa la glicoprotena G del virus de la rabia en comparacin con la cepa parental Copenhagen, luego de la administracin oral a zorros. La prueba P C R permiti detectar V V T G g R A B en las amgdalas y mucosa bucal de zorros a las 24 y 48 h, en el paladar blando del 50% de los animales a las 24 h y luego de 48 h en un 30% ms. Se inocularon zorros con virus aislado de amgdalas 24 h luego de la administracin oral (con o sin amplificacin en cultivo de tejido) para realizar ambos pasajes. No se detect virus en ningn caso luego de este pasaje. La inocuidad de V V T G g R A B para zorros fue demostrada (75). Se us PCR para examinar la patogenia del virus rbico en ratones luego de la inoculacin en el msculo masetero. Se detect A R N de cadena positiva en estadios tempranos en ganglios trigminos; en estadios ms tardos (96 h p.i.), A R N de cadena positiva fue detectado en grandes cantidades en el msculo masetero (71).

397 Bacterias Brucella abortus Se desarroll una prueba especfica y sensible de P C R para el gen que codifica una protena de superficie capaz de detectar 0,1 pg de A D N de la cepa 19 (menos de 100 bacterias) utilizando cebadores que permiten la amplificacin de un fragmento de 635 pb de un gen proteico 43KD de membrana exterior de la cepa 19 de Brucella abortus (21). Escherichia coli Se d e s a r r o l l a r o n p r o t o c o l o s de P C R q u e p o s e e n la misma sensibilidad y especificidad que los m t o d o s convencionales p a r a d e t e c t a r c o n t a m i n a c i n p o r Escherichia coli en agua (4), queso (46), excremento de cerdo (29) y carne (84). H a sido posible la amplificacin enzimtica, m e d i a n t e cebadores con inosina, de diferentes alelos del gen que codifica para la toxina termoestable tipo I de E. coli enterotoxignica (13). La amplificacin del o p e r n mal B de cepas E. coli A I I E produjo fragmentos especficos de A D N . El lmite de deteccin fue de 10 bacterias. La prueba fue validada con 27 cepas enterotoxignicas (13). Leptospira spp. Se desarroll una p r u e b a P C R p a r a d e t e c t a r un fragmento de 631 pb del A D N ribosomal 16S bacteriano de la regin 5 ' (28). Cuando se aplic P C R en muestras de orina bovina, se detectaron hasta 5-10 leptospirae por ml (23). Listeria monocytogenes Se detect Listeria monocytogenes en p r o d u c t o s alimenticios a travs de la amplificacin enzimtica de secuencias especficas b a c t e r i a n a s utilizando cinco oligonucletidos como cebadores (7). Se amplificaron por P C R fragmentos genmicos correspondientes a las hemolisinas alfa y beta en salchichas cocidas y leche en 48 h. La sensibilidad fue de 10 L. monocytogenes/10 ml de leche (22). Resultados variables se obtuvieron al utilizar P C R para L. monocytogenes en muestras de queso (84). A travs de PCR se determin que la ausencia del gen que codifica para el fosfatidil inositol est asociada a la patogenia de L. monocytogenes (12). Mycobacterium paratuberculosis Una sonda ( P C R 278) so obtuvo por amplificacin por P C R de un fragmento de 278 pb de la regin 5'de IS 900, un elemento de insercin contenido en el genoma de Mycobacterium paratuberculosis. Cuando esta sonda fue usada en conjunto con PCR, se obtuvo una sensibilidad de 10 fg de material inicial de M. paratuberculosis, equivalente a dos genomas bacterianos (48). Mycobacterium tuberculosis Un p r o d u c t o especfico de 396 p b se o b t u v o p o r P C R en ausencia de reaccin cruzada con 10 diferentes cepas de Mycobacterium incluyendo aquellas del complejo M. tuberculosis. El producto de P C R fue detectado por hibridizacin aun cuando slo 10 fg de A D N de M. tuberculosis fueron utilizados como blanco. Se obtuvo una buena correlacin con mtodos convencionales y una sensibilidad de 10 fg de A D N purificado (17). Se desarroll una p r u e b a P C R , realizable en 48 h, para el segmento repetitivo IS 6110 (123 pb) del cromosoma de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo (19). El protocolo P C R fue el m t o d o ms sensible p a r a el diagnstico de la meningitis tuberculosa (70).

398 Salmonella spp. C e b a d o r e s especficos y un m t o d o i n m u n o m a g n t i c o (partculas magnticas cubiertas con anticuerpos m o n o c l o n a l e s ) fueron utilizados p a r a amplificar un fragmento de 163 pb del genoma de Salmonella typhimurium. Por este mtodo se logr amplificar por P C R 25 cepas de Salmonella p e r o no otras 19 Enterobactereaceae. La sensibilidad del mtodo fue de 100 P F U (88). Otros patgenos Mycoplasma spp. U s a n d o c e b a d o r e s diseados p a r a las secuencias de los genes del A D N 16S de Mycoplasma pneumoniae y M. genitalis, se desarroll una prueba de amplificacin in vitro especfica y sensible que permiti detectar hasta 100 clulas de M. pneumoniae y 1.000 clulas de M. genitalis (66). Toxoplasma spp. Muestras de tejido de fetos abortados fueron examinadas en vistas de detectar la presencia de Toxoplasma p o r amplificacin p o r P C R del gen p30. Se d e m o s t r la presencia del agente en todos los casos (86).

T E C H N I Q U E S D ' H Y B R I D A T I O N D E S A C I D E S N U C L I Q U E S ET D'AMPLIFICATION EN CHANE PAR POLYMRASE APPLIQUES A U DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES ANIMALES. - M. Rodrguez et A.A. Schudel.

Rsum : Les auteurs dcrivent l'application des techniques de dtection des acides nucliques gnomiques - hybridation des acides nucliques et amplification en chane par polymrase (polymerase chain reaction : PCR) au diagnostic des maladies animales. La technique PCR est un outil biologique puissant qui permet l'amplification enzymatique exponentielle in vitro d'une squence d'acide dsoxyribonuclique donne. Cette technique est actuellement applique l'tude de la pathognie molculaire de nombreuses maladies infectieuses ainsi qu'au diagnostic. La technique PCR qui est, en gnral, plus sensible et plus spcifique que les mthodes traditionnelles et ne ncessite pas d'installations complexes, devrait prochainement devenir la mthode de prdilection des laboratoires de diagnostic, des vtrinaires praticiens et des autorits sanitaires. MOTS-CLS : Amplification en chane par polymrase - Diagnostic - Sant animale - Sondes. *

399

BIBLIOGRAFA 1. ANDERSON M.L.M. & YOUNG B.D. (1987). - Quantitative filter hybridization. In Nucleic acid hybridization: a practical approach (B.D. Hames & S.J. Higgins, edit.). IRL Press, Oxford & Washington D.C. 2. ARRAND J.E. (1987). - Preparation of nucleic acid probes. In Nucleic acid hybridization: a practical approach (B.D. Hames & S.J. Higgins, edit.). I R L Press, Oxford & Washington D.C.
3. BALLAGI-PORDANY A., KLINGEBORN B., FLENSBURG J. & BELAK S. ( 1 9 9 0 ) . - Equine

herpesvirus type 1: detection of viral D N A sequences in aborted foetuses with the polymerase chain reaction. Vet. Microbiol, 22 ( 4 ) , 3 7 3 - 3 8 1 .
4. BEJ A.K., M C C A R T Y S.C. & ATLAS R.M. ( 1 9 9 1 ) . - Detection of coliform bacteria and

Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. Comparison with defined substrate and plating methods for water quality monitoring. Appl. environ. Microbiol.,
57,2429-2432. 5. BELAK S., BALLAGI-PORDANY A., FLENSBURG J. & VIRTANEN A. ( 1 9 8 9 ) . - Detection of

Pseudorabies virus D N A sequences by the polymerase chain reaction. Arch. Virol, 108
(3-4), 279-286.

6. BELAK S. & BALLAGI-PORDANY A. ( 1 9 9 1 ) . - Bovine viral diarrhea virus infection. Rapid diagnosis by the polymerase chain reaction. Arch. Virol, (Suppl. 3 ) , 181-190.
7. BORDER P.M., HOWARD J.J., PLASTOW G . S . & SIGGENS K . ( 1 9 9 0 ) . - Detection of Listeria

species and Listeria monocytogenes Microbiol, 11, 158-162.

using polymerase chain reaction. Letters

appl.

8. BROCK K . V . ( 1 9 9 1 ) . - Detection of persistent bovine viral diarrhea virus infections by DNA hybridization and polymerase chain reaction assay. Arch. Virol., (Suppl. 3 ) ,
199-208. 9. BRUCE C , A L - N A K I B W., FORSYTH M., STANWAY G . & ALMOND J.W. ( 1 9 8 9 ) . - Detection

of enterovirus using cDNA and synthetic oligonucleotide probes. J. virol. Meth., 25,
233-240. 10. BRUCE C , A L - N A K I B W., A L M O N D J.W. & T Y R R E L D.A.W. ( 1 9 8 9 ) . - Use of synthetic

oligonucleotide probes to detect rhinovirus RNA. Arch. Virol, 105, 179-187.

11. BUFFONE G . J . , D E M M L E R G . J . , SCHIMBOR C M . & G R E E R J. ( 1 9 9 1 ) . - Improved

cytomegalovirus DNA amplification from urine after purification of DNA by using glass beads. Clin. Chem., 37, 1945-1949.
12. CAMILLI A., GOLDFINE H. & PORTNOY D.A. ( 1 9 9 1 ) . - Listeria monocytogenes 751-754. 13. CANDRIAN U., FURRER B., HFELEIN C. & LTHY J. ( 1 9 9 1 ) . - Use of inosine-containing mutants

lacking phosphatidylinositol-specific phospholipase C are avirulent. J. exp. Med., 173,

oligonucleotide primers for enzymatic amplification of different alleles of the gene coding for heat-stable toxin type I of enterotoxigenic Escherichia coli. Appl. environ. Microbiol, 57, 955-961.
14. CHIRNSIDE E . D . & SPAAN W.J.M. ( 1 9 9 0 ) . - Reverse transcription and c D N A

amplification by the polymerase chain reaction of equine arteritis virus. J. virol. Meth.,
30,133-140.

15. CLEWLEY J.P. ( 1 9 8 9 ) . - The polymerase chain reaction, a review of the practical limitations for human immunodeficiency virus diagnosis. J. virol. Meth., 25, 179-188.

400
16. DANGLER C.A., MATTOS C A . DE, MATTOS C . C . DE & OSBURN B.I. (1990). - Identifying

bluetongue virus ribonucleic acid sequences by the polymerase chain reaction. J. virol. Meth .,28 (3), 281-292.
17. D E L PORTILLO P., MURILLO L.A. & PATARROYO M . E . (1991). - Amplification of a

species-specific DNA fragment of Mycobacterium diagnosis. J. clin. Microbiol, 29,2163-2168.

tuberculosis and its possible use in

18. DESPORT M . & BROWNLIE J. (1991). - Molecular characterisation of the coding region for the pl25 from homologous BVDV biotypes. Arch. Virol, (Suppl. 3), 261-265.
19. EISENACH K . D . , SIFFORD M.D., CAVE M.D., B A T E S J . H . & CRAWFORD J . T . (1991). -

Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction. Am. Rev. respir. Dis., 144,1160-1163. 20. ERLICH H.A. (1991). - Recent advances in the polymerase chain reaction. Science, 252, 1643-1651.
21. F E K E T E A., BANTLE J . A . , H A L L I N G S.M. & SANBORN M.R. (1990). - Preliminary

development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction. J. appl. Bacteriol, 69,216-227.
22. F U R R E R B., CANDRIAN U . , H F E L E I N C . & L T H Y J . (1991). - D e t e c t i o n and

identification of Listeria monocytogenes in cooked sausage products and in milk by in vitro amplification of haemolysin gene fragments. J. appl. Bacteriol, 70,372-379.
23. GERRITSEN M.J., OLYHOEK T., SMITS M.A. & B O K H O U T B.A. (1991). - Sample

preparation method for polymerase chain reaction-based semiquantitative detection of Leptospira interrogans serovar hardjo subtype hardjobovis in bovine urine. 7. clin. Microbiol, 29,2805-2808.
24. GINGERAS T.R., RICHMAN D.D., KWOH D.Y. & GUATELLI J . C . (1990). - Methodologies

for in vitro nucleic acid amplification and their applications. Vet. Microbiol, 24, 235-251.
25. H A A S L., B A R R E T T T., H A R D E R T. & BOSTOCK C . J . (1990). - Detection of phocine

distemper virus using the polymerase chain reaction. Dt. tierrztl Wschr., 97, 93-95.
26. H A A S E A.T., R E T Z E L E . F . & STASKUS K . A . (1990). - Amplification and detection of

lentiviral DNA inside cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87,4971-4975. 27. HAMES B.D. & HIGGINS S.J. (edit.) (1987). - Nucleic acid hybridization: a practical approach. IRL Press, Oxford & Washington D . C . 28. HOOKEY J.V. (1992). - Detection of Leptospiraceae by amplification of 16S ribosomal DNA. FEMS Microbiol. Letters, 90,267-274. 29. HORNES E . , WASTESON Y. & OLSVIK O. (1991). - Detection of Escherichia coli heatstable enterotoxin genes in pig stool specimens by an immobilized, colorimetric, nested polymerase chain reaction. J. clin. Microbiol, 29 (11), 2375-2379.
30. H O W A R D M.J., COELEN R.J. & M A C K E N Z I E J.S. (1991). - Detection of immobilized

Murray Valley encephalitis virus using oligonucleotide probes with varying degrees of mismatch. J. virol. Meth., 34, 333-341. 31. Hsu D., SHIH L.M., CASTRO A . E . & Z E E Y.C. (1990). - A diagnostic method to detect alcelaphine herpesvirus 1 of malignant catarrhal fever using the polymerase chain reaction. Arch. Virol., 114 (3-4), 259-263.
32. JESTIN A., FOULON T., PERTUISET B., BLANCHARD P. & LABOURDET M. (1990). - Rapid

detection of Pseudorabies virus genomic sequences in biological samples from infected pigs using polymerase chain reaction D N A amplification. Vet. Microbiol, 23 (1-4), 317-328.

401
33. KASHANCHI F., LIU Z.Q., ATKINSON B. & W O O D C . (1991). - Comparative evaluation of

bovine immunodeficiency-like virus infection by reverse transcriptase and polymerase chain reaction. J. virol. Meth., 31,197-209. 34. KATZ J., SEAL B. & RIDPATH J. (1991). - Molecular diagnosis of alcelaphine herpesvirus (malignant catarrhal fever) infections by nested amplification of viral DNA in bovine blood buffy coat specimens. J. vet. Diagn. Invest., 3 (3), 193-198.
35. KELLER G . H . , H U A N G D.P., SHIRAND J . W . K . & M A N A K M.M. (1990). - Detection of

hepatitis B virus D N A in serum by PCR and microtiter sandwich hybridization. J. clin. Microbiol., 28,1411-1416. 36. KNOWLES D.P. JR & GORHAM J.R. (1990). - Diagnosis of viral and bacterial diseases. In Biotechnology and veterinary science. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 9 (3), 733-757. 37. KWOK S. & HIGUCHI R. (1989). - Avoiding false positives with PCR. Nature, 339, 237-238.
38. LEWIS T.L., RIDPATH J.F., BOLIN S.R. & BERRY E.S. (1991). - Detection of BVD viruses

using synthetic oligonucleotides. Arch. Virol, 117, 269-278.

39. LIN Z., KATO A., KUDOU Y., UMEDA K . & U E D A S. (1991). - Typing of recent infectious

bronchitis virus isolates causing nephritis in chicken. Arch. Virol, 120,145-149.

40. Liu S.T., Li S.N., WANG D . C , C H A N G S.F., C H I A N G S.C., H O W . C . , C H A N G Y.S. &

LAI S.S. (1991). - Rapid detection of hog cholera virus in tissues by PCR. J. virol. Meth., 35 (1), 227-236.
41. LOKENSGARD J.R., THAWLEY D . G . & MOLITOR T . W . (1991). - Enzymatic amplification

of latent Pseudorabies virus nucleic acid sequences. J. virol. Meth., 34, 45-55. 42. LOPEZ O., OSORIO F.A. & DONIS R . O . (1991). - Rapid detection of bovine diarrhea virus by PCR. J. clin. Microbiol, 29,578-582. 43. MCCOLL K.A. & GOULD A.R. (1991). - Detection and characterisation of bluetongue virus using the polymerase chain reaction. Virus Res., 21, 19-34.
44. MAES R.K., BEISEL C.E., SPATZ S.J. & THACKER B.J. (1990). - Polymerase chain reaction

amplification of Pseudorabies virus D N A from acutely and latently infected cells. Vet. Microbiol, 24 (3-4), 273-280.
45. MARTINEZ-SALAS E., ORTIN J . & DOMINGO E. (1985). - Sequence of the viral replicase

gene from FMDV Cl-Santa Pau. Gene, 35, 55-61. 46. MEYER R., LTHY J . & CANDRIAN U . (1991). - Direct detection by polymerase chain reaction (PCR) of Escherichia coli in water and soft cheese and identification of enterotoxigenic strains. Letters appl. Microbiol, 13, 268-271.
47. MEYER R.F., BROWN C.C., H O U S E C , H O U S E J . A . & MOLITOR T . W . (1991). - Rapid and

sensitive detection of foot-and-mouth disease virus in tissues by enzymatic R N A amplification of the polymerase gene. J. virol. Meth., 34 (2), 161-172.
48. Moss M.T., G R E E N E.P., T I Z A R D M.L., M A L I K Z.P. & H E R M O N - T A Y L O R J . (1991). -

Specific detection of Mycobacterium paratuberculosis by D N A hybridisation with a fragment of the insertion element IS900. Gut, 32, 395-398.
49. M U R T A U G H M.P., L I N G . F . , H A G G A R D D.L., W E B E R A . F . & M E I S K E J . C . (1991). -

Detection of bovine leukaemia virus in cattle by the polymerase chain reaction. J. virol. Meth., 33, 73-85.
50. NAEEM K . , M U R T A U G H M.P. & G O Y A L S.M. (1991). - Tissue distribution of bovid

herpesvirus-4 in inoculated rabbits and its detection by D N A hybridization and PCR. Arch. Virol., 119,239-255.

402
51. NAIF H.M., BRANDON R.B., DANIEL R.C.W. & LAVIN M.F. (1990). - Bovine leukaemia

proviral DNA detection in cattle using the polymerase chain reaction. Vet. Microbiol., 25 (2-3), 117-129. 52. NORVAL M. & BINGHAM R . W . (1987). - Advances in the use of nucleic acid probes in diagnosis of viral diseases of man. Arch. Virol., 97, 151-165.
53. O ' K E E F E J.S., MURRAY A., WILKS C.R. & MORIARTY K.M. (1991). - Amplification and

differentiation of the DNA of an abortigenic (type 1) and a respiratory (type 4) strain of equine herpesvirus by the polymerase chain reaction. Res. vet. Sci., 50, 349-351.
54. O ' R O U R K E K.I., BESOLA M . L . & M C G U I R E T.C. (1991). - Proviral sequences detected by

polymerase chain reaction in peripheral bloodcells of horses with equine infectious anemia lentivirus. Arch. Virol., 117, 109-119.
55. PACCIARINI M.L., SAVIO M.L., D O N I N I G . & T A G L I A B U E S. (1993). - T h e search for

improved methods for diagnosing leptospirosis: the approach of a laboratory in Brescia, Italy. In Biotechnology applied to the diagnosis of animal diseases. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12 (2), 647-663. 56. PERSING D.H. (1991). - Polymerase chain reaction: trenches to benches. J. clin. Microbiol, 29,1281-1285. 57. PERSING D.H. & LANDRY M.L. (1989). - In vitro amplification techniques for the detection of nucleic acids. Yale J. biol. Med., 62, 159-171. 58. PHALEN D.N., WILSON V . G . & GRAHAM D.L. (1991). - Polymerase chain reaction assay for avian Polyomavirus, J. clin. Microbiol, 29,1030-1037.
59. POULSEN D.J., BURTON C.R.A., O ' B R I A N J . A . , RABIN S.J. & K E E L E R C.L. JR (1991). -

Identification of the infectious laryngotracheitis virus glycoprotein gB gene by the polymerase chain reaction. Virus Genes, 5 (4), 335-347.
60. RONFORT C., AFANASSIEFF M., CHEBLOUNE Y., DAMBRINE G . , NIGON V.M. & VERDIER

G . (1991). - Identification and structure analysis of endogenous proviral sequences in a brown leghorn chicken strain. Poult. Sci., 70,2161-2175. 61. R O Y P. (1989). - Use of nucleic acid probes. In Biotechnology for livestock production. FAO Animal Production and Health Division. Plenum Press, Nueva York, 301-310. 62. RYCHLIK W . & RHOADS E. (1989). - A computer program for choosing oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res.,11,8543-8551.
63. SAIKI R . K . , S C H A R F S., F A L O O N A F . , M U L L S K . B . , H O R N G . T . , E R L I C H H . A . &

AMHEIM N. (1985). - Enzymatic amplification of beta-globin sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, 1350-1354.
64. SAMBROOK J., FRITSCH E . F . & MANIATIS T. (1989). - Molecular cloning. A laboratory

manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

65. SARGAN D.R., BENNET I.D., COUSENS C., R O Y D.J., BLACKLAWS B.A., DALZIEL R . G . &

WATT N.J. (1991). - Nucleotide sequence of E V 1 , a British isolate of maedi-visna virus. J. gen. Virol, 72,1893-1903.
66. SASAKI Y., SHINTANI T., SHIMADA T., WATANABE H. & SASAKI T. (1992). - Detection and

discrimination of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium by in vitro DNA amplification. Microbiol. Immunol., 36,21-27. 67. SCHOCHETMAN G . , O U Y.C. & JONES W . (1988). - Polymerase chain reaction. J. infect. Dis., 158,1154-1157.

403 68. SCHRENZEL M.D., HIGGINS R.J., HiNRiCHS S.H., SMITH M.O. & T O R T E N M. ( 1 9 9 0 ) . -

Type C retroviral expression in spontaneous feline olfactory neuroblastomas. Acta

neuropathol.,m

(5), 547-553.

69. SCHUURMAN R., VAANSTENIS B., VANSTRIEN A., VANDERNOORDAA J. & SOL C. ( 1 9 9 1 ) . -

Frequent detection of bovine Polyomavirus in commercial batches of calf serum by using

PCR. J. gen. Virol., 72, 2 7 3 9 - 2 7 4 5 .
70. SHANKAR P., M A N J U N A T H N., M O H A N K . K . , P R A S A D K . , B E H A R I M., SHRINIWAS &

AHUJA G . K . ( 1 9 9 1 ) . - Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction. Lancet, 337 ( 8 7 3 2 ) , 5-7.
71. SHANKAR V., DIETZSCHOLD B. & KOPROWSKI H. ( 1 9 9 1 ) . - Direct entry of rabies virus

into the central nervous system without prior local replication. J. Virol., 65, 2 7 3 6 - 2 7 3 8 .
72. SHERMAN M.P., EHRLICH G.D., FERRER J.F., SNINSKY J.J., ZANDOMENI R., DOCK N.L. &

POIESZ B.J. ( 1 9 9 2 ) . - Amplification and analysis of specific DNA and RNA sequences of bovine leukemia virus from infected cows by polymerase chain reaction. J. clin. Microbiol., 3 0 , 1 8 5 - 1 9 1 .
7 3 . STEIGER Y., ACKERMANN M., METTRAUX C. & KIHM U . ( 1 9 9 2 ) . - Rapid and biologically

safe diagnosis of African swine fever infection by using PCR. J. clin. Microbiol., 30, 1-8.
74. TEIFKE J.P. & WEISS E . ( 1 9 9 1 ) . - Detection of bovine papillomavirus D N A in equine

sarcoids using the polymerase chain reaction. Berl. Mnch, tierrztl. Wschr., 104,
185-187. 75. THOMAS I., B R O C H I E R B., L A N G U E T B . , B L A N C O U J., P E H A R P R E D., K I E N Y M.P.,

DESMETTRE P., CHAPPUIS G. & PASTORET P.-P. ( 1 9 9 0 ) . - Primary multiplication site of

the vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus administered to foxes by the oral route. J. gen. Virol., 71 ( 1 ) , 3 7 - 4 2 .
76. T O R T E N M., S P A R G E R E . E . , R I D E O U T B.A., P E D E R S E N N.C. & L u c i w P.A. ( 1 9 9 0 ) . -

Coinfection of cats with FIV and FeLV affects both quantity and distribution of FIV DNA in various tissues. In Vaccines 9 0 . Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS (F. Brown, R.M. Chanock, H.S. Ginsberg & R.A. Lerner, edit.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 3 7 5 - 3 7 8 .
77. VANIDDEKINGE B.J.L.H., VANWAMEL J.L.B., VANGENNIP H.G.P. & MOORMANN R.J.M.

(1992). - Application of the PCR to the detection of bovine viral diarrhea virus infections in cattle. Vet. Microbiol., 30, 21-34. 78. VERBEEK A. & TIJSSEN P. ( 1 9 9 0 ) . - Polymerase chain reaction for probe synthesis and for direct amplification in detection of bovine Coronavirus. J. virol. Meth., 29, 243-256.
79. VERBEEK A., D E A S. & TIJSSEN P. ( 1 9 9 1 ) . - Genomic relationships between turkey and

bovine enteric coronaviruses identified by hybridization with BCV or TCV specific cDNA probes. Arch. Virol, 121 ( 1 - 4 ) , 1 9 9 - 2 1 1 .
80. VOLZ D.M., LAGER K.M. & MENGELING W . L . ( 1 9 9 2 ) . - Latency of a thymidine kinase-

negative Pseudorabies vaccine virus detected by the PCR. Arch. Virol, 122, 341-348.
8 1 . WADE-EVANS A.M., M E R T E N S P.P.C. & BOSTOCK C.J. ( 1 9 9 0 ) . - Development of the

polymerase chain reaction for the detection of bluetongue virus in tissue samples. J. virol. Meth., 30 ( 1 ) , 15-24. 82. WANG M. & WEBSTER R.G. ( 1 9 9 0 ) . - Lack of persistence of influenza virus genetic information in ducks. Arch. Virol, 111, 263-267. 83. WARD P. &MISRA V. ( 1 9 9 1 ) . - D e t e c t i o n of bovine viral diarrhea virus, using degenerate oligonucleotide primers and the polymerase chain reaction. Am. J. vet. Res., 52,
1231-1236.

404
84. W E R N A R S K . , D E L F G O U E., SOENTORO P.S. & N O T E R M A N S S. (1991). Successful

approach for detection of low numbers of enterotoxigenic Escherichia coli in minced meat by using the polymerase chain reaction. Appl. environ. Microbiol., 57,1914-1919. 85. WHEELER J . G . & OSORIO F . A . (1991). - Investigation of sites of Pseudorabies latency, using PCR. Am. J. vet. Res., 52,1799-1803.
86. W H E E L E R R., WILMORE H . , SAVVA D . & T U R N E R C.B. (1990). - Diagnosis of ovine

toxoplasmosis using PCR. Vet. Rec., 126, 249.

87. W H E T T E R L., A R C H A M B A U L T D . , P E R R Y S., G A Z I T A . , C O G G I N S L., Y A N I V A.,

CLABOUGH D., D A H L B E R G J . , FULLER F . & TRONICK S. (1990). - Equine infectious

anemia virus derived from a molecular clone persistently infects horses. J. Virol., 64 (12), 5750-5756.
88. WIDJOJOATMODJO M . N . , F L U I T A.C., T O R E N S M A R., K E L L E R B . H . I . & V E R H O E F J .

(1991). - Evaluation of t h e magnetic immuno P C R assay for rapid detection of Salmonella. Eur. J. clin. Micro. infect. Dis., 10 (11), 935-938. 89. Xu L., HARBOUR D. & M C C R A E M . A . (1990). - The application of polymerase chain reaction to the detection of rotaviruses in faeces. J. virol. Meth., 27 (1), 29-37.
90. ZANONI R., PAULI U. & PETERHANS E. (1989). - Caprine arthritis-encephalitis (CAE)-

and maedi-visna viruses detected by the polymerase chain reaction (PCR). In Primer Congreso de la Sociedad europea de virologa veterinaria, Lieja, Blgica, 6-7 de abril.