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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CINCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA E BIOQUMICA



PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATRIAS DE
FLAVONIDES MECANISMOS DE ACO CELULAR


Catarina Cabrita Ramos


MESTRADO EM BIOQUMICA
(Bioqumica Mdica)

2009



UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CINCIAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA E BIOQUMICA



PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATRIAS DE
FLAVONIDES MECANISMOS DE ACO CELULAR


Catarina Cabrita Ramos

Dissertao orientada pela
Professora Doutora Maria de Lurdes Mira

MESTRADO EM BIOQUMICA
(Bioqumica Mdica)

2009


iii

Agradecimentos

Agradeo, em primeiro lugar, Professora Lurdes Mira, pela oportunidade de trabalhar no
seu Laboratrio e por todo o empenho e dedicao demonstrados ao longo deste ano.

Um agradecimento especial Professora Luisa Cyrne, pela pacincia, disponibilidade e por
todo o apoio prestado na segunda parte deste trabalho.

Agradeo, tambm, Dra. Eduarda Fernandes, pelas clulas THP-1.

A todas as pessoas do 4 piso que se mostraram sempre prontas a ajudar, muito obrigada.

Agradeo, tambm, aos dadores de sangue e funcionrios do Instituto Portugus do San-
gue, sem a colaborao dos quais este trabalho no teria sido possvel.

s minhas colegas de laboratrio, Mariana e Vnia, sempre presentes, nas alturas mais
alegres, nas mas difceis e at nas mais caricatas e divertidas! Ficam muitas histrias para
contar! Muito obrigada, nheris!

Agradeo a todos os meus amigos, por me ajudarem sempre que precisei e compreende-
rem as ausncias foradas.

Finalmente, agradeo aos meus pais, pela compreenso, apoio, motivao e pacincia
constantes. Muito obrigada!



v

Resumo
O cido hipocloroso (HOCl) um oxidante forte produzido por neutrfilos e moncitos
activados. Esta espcie reactiva de oxignio (ROS) gerada a partir da reaco do H
2
O
2

com o Cl

, catalisada pelo mieloperoxidase e desempenha um papel fundamental no pro-


cesso inflamatrio. Embora a formao de HOCl tenha como finalidade matar os microor-
ganismos invasores dentro do fagossoma, pode, tambm, ser libertado para fora da clula,
onde pode lesar os tecidos e contribuir para a patognese de doenas inflamatrias. Tor-
na-se, assim, til captar esta espcie oxidante, de modo a proteger os tecidos circundantes
e avaliar o papel potencial de compostos antioxidantes na preveno de leses nos locais
de inflamao. Considerou-se, por isso, ser importante estudar as propriedades anti-
inflamatrias de alguns flavonides (quercetina, fisetina, naringenina e naringina), em
relao captao de HOCl produzido quimicamente e gerado por neutrfilos activados ex
vivo, bem como os seus efeitos na activao do factor de transcrio NF-B.
Em relao captao de HOCl, para cada flavonide foram determinados valores de IC50,
determinados atravs de diferentes mtodos de competio: oxidao do vermelho pirogalol
(PGR), clorao da taurina e oxidao da sonda 3-aminofenilfluorescena (APF) que foi seguida
por espectrofluorimetria e citometria de fluxo.
O flavonide que apresentou melhor actividade foi a quercetina, uma vez que possui
todas as caractersticas estruturais importantes que lhe permite ter um efeito protector em
relao s reaces de clorao/oxidao mediadas pelo HOCl. A fisetina e a naringenina, ape-
sar de no possurem algumas das caractersticas estruturais importantes, que existem na
quercetina, tambm, demonstraram uma elevada capacidade antioxidante, quando o HOCl era
gerado por neutrfilos activados, o que poder ser explicado pela sua maior lipofilicidade em
comparao com a quercetina.
Estudou-se, tambm, a capacidade dos flavonides quercetina, fisetina e naringenina
para induzirem variaes na activao do NF-kB em clulas monocticas THP-1 activadas por
LPS. Atravs da anlise por Western blot, observou-se que estes flavonides exerciam efeitos
inibitrios na activao do NF-kB. Esta resposta reflectia-se numa menor translocao da pro-
tena p65 para o ncleo e numa menor degradao das protenas inibitrias do NF-B (IB).
Estes resultados sugerem que os flavonides quercetina, fisetina e naringenina podem exercer
efeitos anti-inflamatrios, atravs da inibio da activao do NF-B e da captao de HOCl,
um oxidante forte produzido pelos neutrfilos.

Palavras-chave: inflamao; flavonides; HOCl, neutrfilos, clulas THP-1 e NF-B.


vii

Abstract
Hypochlorous acid (HOCl) is a powerful oxidant produced by stimulated neutrophils and
monocytes. This reactive oxygen specie (ROS) is generated by the reaction of H
2
O
2
with Cl
-
,
catalyzed by myeloperoxidase (MPO), and has long been recognized to play an important role
in the inflammatory process. Although this toxic specie is formed with the aim of killing the
ingested microorganisms (inside the phagosome), it can also be released to the outside of the
cell, where it may damage normal tissue and thus contribute to the pathogenesis of inflamma-
tory diseases. Considering this fact, it should be useful to scavenge HOCl, in order to protect
the nearby tissues and to evaluate the potential modulator role of antioxidant compounds in
the prevention of tissue injury at sites of inflammation. Therefore it was considered of interest
to study anti-inflammatory properties of some flavonoids (quercetin, fisetin, naringenin and
naringin) towards the scaveging of hypochlorous acid (HOCl) chemically generated and by ex
vivo activated human neutrophils, as well as their effects on the activation of the transcription
factor NF-B.
For each flavonoid different IC
50
values were obtained, when assessed through differ-
ent competition methods: oxidation of pyrogallol red (PGR), taurine chlorination and oxidation
of the probe 3-aminophenilphluorescein (APF), which was followed by spectrofluorimetry and
flow cytometry.
Quercetin was the studied flavonoid who presented the highest HOCl scavenging activ-
ity, since this flavonoid possesses structural features that are determinant on the protection
against HOCl mediated chlorination/oxidation reactions. Fisetin and naringenin, in spite of not
possessing some of these structural features, also showed high antioxidant activity, when HOCl
was generated by activated neutrophils. The lipophilicity of these compounds may be respon-
sible for the behaviour of these flavonoids.
We also examined the ability of the flavonoids quercetin, fisetin and naringenin to in-
duce changes in the activation of NF-B in THP-1 cells activated by LPS. Innibitory effects in the
activation of NF-B, analysed by Western blotting, were observed for the studied flavonoids.
This response was reflected in terms of nuclear translocation of NF-B and degradation of
NF-B inhibitory protein (IB).
Our results suggest that the flavonoids, quercetin, fisetin, and naringenin may exert
anti-inflammatory effects through the inhibition of NF-B activation and the scavenging of
HOCl, a strong oxidant produced by phagocytic cells.

Keywords: inflammation; neutrophils; THP-1 cells; flavonoids; HOCl; NF-B



ix

ndice
Agradecimentos ........................................................................................................................... iii
Resumo .......................................................................................................................................... v
Abstract ........................................................................................................................................ vii
ndice de Figuras .......................................................................................................................... xii
ndice de Quadros ....................................................................................................................... xiv
Abreviaturas ................................................................................................................................. xv
I Introduo ................................................................................................................................... 1
1 Inflamao .............................................................................................................................. 2
1.1 Libertao de mediadores inflamatrios ........................................................................ 2
1.1.1 Aco do formil-Metionil-Leucil-Fenilalanina (fMLP) ............................................... 3
1.1.2 Aco do lipopolissacrido (LPS) .............................................................................. 4
1.2 Migrao dos fagcitos ................................................................................................... 6
1.3 Fagocitose ....................................................................................................................... 7
1.4 Espcies reactivas de oxignio ........................................................................................ 8
1.5 Factor de transcrio NF-B .......................................................................................... 12
2 Fagcitos .............................................................................................................................. 17
2.1 Neutrfilos ..................................................................................................................... 17
2.2 Moncitos ..................................................................................................................... 19
3 Consequncias da inflamao .............................................................................................. 21
4 Flavonides .......................................................................................................................... 23
II Objectivo .................................................................................................................................. 27
III Materiais e Mtodos ............................................................................................................... 29
1 Reagentes ............................................................................................................................. 30
2 Material Biolgico ................................................................................................................ 31
3 Estudo da captao de HOCl por flavonides ...................................................................... 32
3.1 Captao de HOCl produzido quimicamente ................................................................ 32
3.1.1 Oxidao do PGR ................................................................................................ 32
x

3.1.2 Clorao da Taurina ............................................................................................ 34
3.2 Captao de HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo ............................... 35
3.2.1 Isolamento dos leuccitos .................................................................................. 36
3.2.2 Clorao da taurina ............................................................................................ 36
3.2.3 Oxidao da sonda APF ...................................................................................... 37
3.2.2.1 Deteco da oxidao da APF por espectrofluorimetria ............................ 38
3.2.2.2 Deteco da oxidao da APF por citometria de fluxo ............................... 38
4 Inibio da activao do factor de transcrio NF-B .......................................................... 41
4.1 Linha Celular THP-1 ....................................................................................................... 41
4.1.1 Citotoxicidade dos flavonides .............................................................................. 41
4.1.2 Escolha do tempo de incubao com LPS .............................................................. 42
4.1.2.1 Realizao do ensaio ....................................................................................... 43
4.1.2.2 Preparao dos extractos celulares ................................................................ 43
4.1.2.3 Preparao das protenas celulares ................................................................ 44
4.1.2.4 Anlise das protenas celulares ....................................................................... 44
4.1.3 Efeito dos flavonides na activao do NF-B ....................................................... 45
4.1.3.1 Realizao do ensaio ....................................................................................... 45
4.1.3.2 Preparao dos extractos celulares ................................................................ 46
4.1.3.3 Preparao das protenas celulares ................................................................ 46
4.1.3.4 Anlise das protenas celulares ....................................................................... 46
4.2 Clulas mononucleares do sangue perifrico - PBMC .................................................. 46
4.2.1 Isolamento das PBMC ............................................................................................ 46
4.2.2 Citotoxicidade dos flavonides .............................................................................. 47
IV Apresentao dos Resultados ................................................................................................. 49
1 Estudo da captao, por flavonides, de HOCl produzido quimicamente .......................... 50
1.1 Oxidao do PGR ........................................................................................................... 50
1.2 Clorao da Taurina ....................................................................................................... 52
xi

2 Estudo da captao, por flavonides, de HOCl produzido por neutrfilos activados
quimicamente ......................................................................................................................... 55
2.1 Clorao da Taurina ....................................................................................................... 56
2.2 Oxidao da sonda APF ................................................................................................. 57
2.2.1 Deteco da oxidao da sonda APF por espectrofluorimetria ............................. 57
2.2.2 Deteco da oxidao da sonda APF por citometria de fluxo ................................ 60
3 Estudo do efeito de flavonides na activao do factor de transcrio NF-B em clulas
THP-1 activadas por LPS .......................................................................................................... 66
3.1.1 Citotoxicidade dos flavonides .............................................................................. 66
3.1.2 Escolha do tempo de incubao das clulas com LPS ............................................ 67
3.1.3 Aco dos flavonides na activao do NF-B ....................................................... 69
V Discusso .................................................................................................................................. 73
Referncias Bibliogrficas .......................................................................................................... xvii


xii

ndice de Figuras

Figura 1. Situao de inflamao. ................................................................................................. 2
Figura 2. Mecanismo de activao da protena cinase C. ............................................................. 3
Figura 3. Estrutura e posio do LPS na parede celular de bactrias gram negativas. ................. 4
Figura 4. Mecanismo de reconhecimento do LPS pelo TLR4. ....................................................... 5
Figura 5. Extravaso dos leuccitos. ............................................................................................. 6
Figura 6. Fagocitose. ..................................................................................................................... 7
Figura 7. Produo de ROS. ......................................................................................................... 12
Figura 8. Vias de activao do NF-B. ......................................................................................... 15
Figura 9. Transduo de sinal para a activao do NF-B, atravs da ligao LPS/TLR4. ........... 16
Figura 10. Morfologia do neutrfilo. .......................................................................................... 17
Figura 11. Morfologia do moncito e do macrfago. ................................................................. 19
Figura 12. Estrutura dos flavonis, incluindo quercetina e fisetina. .......................................... 23
Figura 13. Estrutura das flavanonas, incluindo naringenina e naringina. ................................... 23
Figura 14. Esquema das caractersticas dos flavonides que conferem poder de captao de
radicais. ....................................................................................................................................... 24
Figura 15. Esquema das caractersticas dos flavonides que conferem poder de captao de
HOCl............................................................................................................................................. 25
Figura 16. Estrutura do vermelho de pirogalol ........................................................................... 33
Figura 17. Estrutura da taurina ................................................................................................... 34
Figura 18. Esquema da reaco da sonda APF com hROS. ......................................................... 37
Figura 19. Propriedades de disperso de luz de uma clula. ...................................................... 39
Figura 20. Subpopulaes de leuccitos num grfico FS vs SS.. ................................................. 39
Figura 21. Esquema da converso resazurina a resorufina. ....................................................... 42
Figura 22. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na oxidao
do PGR mediada pelo HOCl produzido quimicamente ............................................................... 51
Figura 23. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na clorao
da taurina, mediada pelo HOCl produzido quimicamente ......................................................... 53
Figura 24. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na clorao
da taurina, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA ............. 56
Figura 25. Oxidao da sonda APF ao longo do tempo, detectada por espectrofluorimetria,
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA, na presena de
quercetina, fisetina e naringenina .............................................................................................. 58
xiii

Figura 26. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina e naringenina na oxidao da sonda
APF, detectada por espectrofluorimetria, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA. ......................................................................................................... 59
Figura 27. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por
citometria de fluxo e mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA,
nas clulas analisadas nas leituras efectuadas com quercetina 0 e 5 M .................................. 60
Figura 28. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por
citometria de fluxo e mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA,
nas clulas analisadas nas leituras efectuadas com fisetina 0 e 2,5 M .................................... 61
Figura 29. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por
citometria de fluxo e mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA,
nas clulas analisadas nas leituras efectuadas com naringenina 0 e 5 M ................................ 62
Figura 30. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por
citometria de fluxo e mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA,
nas clulas analisadas na ltima leitura efectuada para as vrias concentraes de quercetina,
fisetina e naringenina estudadas. ............................................................................................... 63
Figura 31. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina e naringenina na oxidao da sonda
APF, detectada por citometria de fluxo, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA .......................................................................................................... 64
Figura 32. Avaliao da toxicidade da quercetina, fisetina e naringenina, aps 16h de
incubao com as clulas THP-1, atravs de medidas de fluorescncia obtidas no ensaio com o
alamarBlue. .............................................................................................................................. 67
Figura 33. Variao da quantidade de p65 e IB, no citoplasma, nos diferentes tempos de
incubao testados. .................................................................................................................... 68
Figura 34. Variao da quantidade de p65, no ncleo, nos diferentes tempos de incubao
testados. ...................................................................................................................................... 68
Figura 35. Efeito dos flavonides nos nveis citoplasmticos de p65 e IB. ............................. 69
Figura 36. Efeito dos flavonides nos nveis de p65 no ncleo. ................................................. 70
Figura 37. Actividade metablica de PBMC, aps 16h de incubao na presena de quercetina,
fisetina e naringenina. ................................................................................................................. 71


xiv

ndice de Quadros
Quadro 1. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e
naringina no mtodo da oxidao do PGR, mediada pelo HOCl produzido quimicamente. ...... 51
Quadro 2. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e
naringina, no mtodo da clorao da taurina, mediada pelo HOCl produzido quimicamente .. 53
Quadro 3. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e
naringina no mtodo da clorao da taurina, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA. ......................................................................................................... 57
Quadro 4. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina e naringenina no
mtodo da clorao da oxidao da sonda APF, detectada por espectrofluorimetria, mediada
pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA. .............................................. 59
Quadro 5. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina e naringenina no
mtodo da clorao da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo, mediada
pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA. .............................................. 65
Quadro 6. Variao dos nveis de p65 e IB para os tempos de incubao, das clulas THP-1
com LPS, estudados ..................................................................................................................... 69
Quadro 7. Efeito dos flavonides na variao dos nveis de p65 e IB. ................................... 70
Quadro 8. Valores de IC
50
obtidos nos ensaios de captao de HOCl ........................................ 74


xv

Abreviaturas
APF 3'-p-aminofenil fluorescena (3'-p-aminophenyl fluorescein)
BSA Albumina de soro bovino (Bovine serum albumin)
CCL2 Ligando 2 de quimiocina com motivo C-C [Chemokine (C-C motif) ligand 2]
CCR2 Receptor 2 de quimiocina com motivo C-C [Chemokine (C-C motif) receptor 2]
DAG Diacilglicerol
DMF Dimetilformamida
D-PBS Soluo salina tamponada em fosfato de Dulbecco (Dulbeccos phosphate buffe-
red saline)
DTT Ditiotreitol
EDTA cido tetra-actico de etilenodiamina (Ethylenediamine tetra-acetic acid)
ENA-78 Pptido-78 epitelial activador de neutrfilos (Epithelial neutrophil activating pep-
tide-78)
FBS soro fetal bovino (Fetal bovine serum)
FcR receptor de Fc (Fc receptor)
fMLP - formil-metionil-leucil-fenilalanina
FPR receptor de pptidos formilados (Formylated peptides receptor)
FS Disperso frontal de luz (Forward-scattered light)
ICAM-1 molcula de adeso intercelular-1 (Intercellular adhesion molecule-1)
Ig Imunoglobulinas
IKK complexo cinase de IB (IB kinase complex)
IL-1 Interleucina-1
IP3 1,4,5-trifosfato de inositol (Inositol triphosfate)
IRAK cinases associadas ao receptor de IL-1 (IL-1 receptor associated kinases)
IB Protenas inibidoras do NF-B (Inhibitor proteins of NF-B)
LBP Protena que liga o LPS (LPS binding protein)
LDL Lipoprotenas de baixa densidade (Low density lipoproteins)
LPS Lipopolissacrido
MAP Protena activada por mitognios (Mitogen activated protein)
MPO Mieloperoxidase
NEMO Modulador essencial de NF-B (NF-B essencial modulator)
NF-B Factor nuclear B (Nuclear factor B)
NIK Cinase indutora do NF-B (NF-B inducing kinase)
xvi

NLS Sequncia de localizao nuclear (Nuclear localization sequence)
PBMC clulas mononucleares do sangue perifrico (Peripheral blood mononuclear cells)
PECAM-1 Molcula de adeso plaquetria-endotelial (Platelet endothelial cell adhesion
molecule-1)
PGR Vermelho de pirogalol (Pyrogallol red)
PIP2 4,5-bisfosfato de fosfatidil de inositol (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)
PKC Protena cinase C (Protein kinase C)
PLC Fosfolipase C (Phospholipase C)
PMA Acetato miristato de forbol (Phorbol myristate acetate)
PMN Fagcitos polimorfonucleares (Polymorphonuclear phagocytes)
PMSF Fenilmetanosulfonilfluorido (Phenylmethanesulphonylfluoride)
PSA Persulfureto de amnia
RDH Domnios de homologia rel (Rel domain homology)
RNS Espcies reactivas de azoto (Reactive nitrogen species)
ROS Espcies reactivas de oxignio (Reactive oxigen species)
SDS Dodecil sulfato de sdio (Sodium dodecyl sulfate)
SSC Disperso lateral de luz (Side-scattered light)
TAK1 Cinase1 activada pelo factor de crescimento transformador (Transforming
growth factoractivated kinase1)
TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina
TIR Receptor TollIL-1 (TollIL-1 receptor)
TLR Receptores Toll-like (Toll like receptors)
TMB 3,3,5,5-tetrametilbenzidina
TNF-o Factor de necrose tumoral (Tumour Necrosis Factor-o)
TRAF6 Factor 6 associado a receptor de TNF (TNF receptor associated factor 6)
TRIF Protena adaptadora indutora de interfero- contendo TIR (TIR-containing adaptor
inducing interferon-)
VCAM-1 molcula de adeso celular vascular-1 (Vascular cell adhesion molecule-1)










I Introduo

I Introduo
2

1 Inflamao
A inflamao representa uma resposta do organismo, imediata e no especfica, face a
uma infeco por um patogneo ou toxina ou a uma leso tecidual (Calder, 2006). Tem
como objectivo a neutralizao do agente agressor e a reparao dos tecidos lesados, de
modo a assegurar a sobrevivncia do organismo (Gomes et al, 2008).
A resposta inflamatria caracterizada pela ocorrncia de trs eventos vasodila-
tao, aumento da permeabilidade dos vasos sanguneos e influxo de clulas fagocticas
que so responsveis pelos cinco sintomas caractersticos de uma situao de inflamao
calor, rubor, edema, dor e perda de funo, no local afectado (Goldsby et al, 2003).

Figura 1. Situao de inflamao. 1 Aps a leso do tecido, h a libertao de factores quimioatractores e vasoac-
tivadores; 2 estes factores levam ao aumento da corrente sangunea e da permeabilidade dos capilares; 3 o
aumento da permeabilidade dos vasos permite o influxo de fluido e clulas; 4 as clulas fagocticas migram at ao
local da inflamao, onde, juntamente com o fluido rico em protenas, destroem o patogneo. Adaptado de Goldsby
et al, 2003.

1.1 Libertao de mediadores inflamatrios
Aps o estmulo agressor, ocorre a libertao ou activao de determinados mediadores
inflamatrios que apresentam propriedades vasoactivadoras, levando ao aumento do flu-
xo sanguneo e da permeabilidade dos vasos, e quimioatractoras, induzindo a activao
dos fagcitos e a expresso de molculas de adeso nas clulas endoteliais dos vasos san-
guneos e nas clulas fagocticas. Estes mediadores podem ser derivados dos microorga-
nismos invasores (como o lipopolissacrido LPS), libertados pelas clulas lesadas (hista-
mina, por exemplo) ou pelas clulas que participam no processo de inflamao (como a
citocina pr-inflamatria factor de crescimento tumoral- TNF-o) (Goldsby et al, 2003).
I Introduo

3

O aumento da permeabilidade dos capilares facilita o influxo de fluido, molculas de
grandes dimenses (protenas do complemento, citocinas, anticorpos e enzimas de coagu-
lao) e clulas fagocticas dos vasos para os tecidos (Goldsby et al, 2003).

1.1.1 Aco do formil-Metionil-Leucil-Fenilalanina (fMLP)
O formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) um tripptido, produzido pela Escherichia
coli, constituindo o principal e forte quimioatractor de fagcitos, libertado por esta bact-
ria. Este factor exerce o seu efeito ao ligar-se a receptores de pptidos formilados (FPR),
receptores associados a protenas G. Quando ligado ao FPR, o fMLP induz alteraes con-
formacionais no receptor, o que permite que este interaja com a protena G associada e
leve sua activao. A jusante da protena G, ocorre a activao de vrios sistemas de
sinalizao, como o fosfolipase C (PLC). O PLC hidrolisa o 4,5-bisfosfato de fosfatidil de
inositol (PIP
2
), formando diacilglicerol (DAG), que activa a protena cinase C (PKC), e 1,4,5-
trifosfato de inositol (IP
3
), que leva libertao de clcio (Ca
2+
) pelo retculo endoplasmti-
co. (Selvatici et al, 2006). Este mecanismo de activao encontra-se representado na figura
2.

Figura 2. Mecanismo de activao da protena cinase C. Representao do mecanismo de activao da protena
cinase C (PKC). 1 O receptor de pptidos formilados (FPR) est associado a uma protena G. 2 Quando o ligando
formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) se liga ao receptor, ocorre uma troca do GDP por GTP na subunidade o da
protena G. 3 A subunidade o dissocia-se das subunidades e | e activa a fosfolipase C (PLC). Este enzima, uma
vez activado, degrada o 4,5-bifosfato de fosfatidil de inositol (PIP
2
) em diacilglicerol (DAG) e 1,4,5-trifosfato de
inositol (IP
3
). 4 O IP
3
dirige-se para o retculo endoplasmtico (RE), onde induz a abertura de canais de clcio
(Ca
2+
), levando sada destes ies para o citosol. O aumento de Ca
2+
no citosol leva, entre outros fenmenos,
ligao da PKC membrana plasmtica. 5 Uma vez na membrana plasmtica, a PKC activada pelo DAG. Adapta-
do de Lodish et al, 2003.
I Introduo
4

A PKC uma cinase de serina/treonina com dois domnios funcionais principais: o domnio
cataltico, no terminal C, e um domnio regulador, no terminal N, onde se ligam os cofacto-
res Ca
2+
, DAG, steres de forbol e outros lpidos (Selvatici et al, 2006).
Uma vez activada, a PKC leva quimiotaxia, activao do NADPH oxidase e desgra-
nulao dos fagcitos (Selvatici et al, 2006).

1.1.2 Aco do lipopolissacrido (LPS)
O LPS um constituinte da parede celular das bactrias gram negativas, relativamente
conservado nas diversas espcies. constitudo por dois componentes de natureza polis-
sacardica e uma poro lipdica, sendo esta ltima associada toxicidade inerente a este
composto (Madigan et al, 2003).


Figura 3. Estrutura e posio do LPS na parede celular de bactrias gram negativas. a) Representao da parede
celular e membrana citoplasmtica das bactrias gram negativas: 1 LPS, 2 Membrana externa, 3 Peptidoglica-
no, 4 Periplasma, 5 Membrana citoplasmtica; b) Esquema da estrutura do LPS: 1 Polissacrido O-especfico,
que varia consoante as espcies; 2 Polissacrido principal, costituido por glucose (Glu), N-acetilglucosamina
(NAG), galactose (Gal), heptose (Hep) e cetodesoxioctonato (KDO); 3 Lpido A, constitudo por glucosamina (GA),
ligada a cidos gordos, atravs de ligaes ster-amina. Adaptado de Madigan et al, 2003.

O LPS funciona como mediador inflamatrio, iniciando a transduo de sinal pela sua liga-
o a um dos seus receptores TLR (Toll-Like-Receptor), muito importantes no reconheci-
mento de vrios padres tpicos de microrganismos, o receptor TLR4. A ligao do LPS ao

a b
I Introduo

5

TLR4 complexa e envolve a participao de trs outras protenas: a protena que liga o
LPS (LBP), a CD14 e a MD-2 (que est acoplada ao receptor TLR4) (Goldsby et al, 2003).
A LBP uma glicoprotena que existe em circulao, no soro. Reconhece e liga a
poro lipdica do LPS, com elevada afinidade, formando o complexo LBP-LPS (Goldsby et
al, 2003). O receptor do complexo LPS-LBP o CD14, uma glicoprotena que existe princi-
palmente ligada membrana, embora tambm se encontre em circulao. O CD14 reco-
nhece o lpido A, assim como as cadeias de hidrocarbonetos, e transfere o LPS para a pro-
tena MD-2 (Jerala, 2007). A MD-2 uma protena solvel que se liga no covalentemente
ao TLR4, sendo responsvel pela ligao do LPS (Guha e Mackman, 2001). Aps a ligao
do LPS MD-2, o TRL4 sofre uma oligomerizao, recrutando os seus adaptadores a jusan-
te, atravs de interaces com os domnios de receptor de TollIL-1 (TIR) (Lu et al, 2008).
O mecanismo de reconhecimento do LPS encontra-se representado na figura 4.


Figura 4. Mecanismo de reconhecimento do LPS pelo TLR4. Representao esquemtica da cascata de reconheci-
mento do LPS pelo receptor de padres de microrganismos, TLR4. A LBP liga o LPS, ou agregados de LPS, e depois
interage com o CD14, para o qual transfere o LPS. O LPS , depois, ligado s MD-2, o que provoca uma alterao
conformacional no TLR4, levando associao dos domnios intracelulares TIR. Isto permite o recrutamento de
protenas adaptadoras, que levam activao das vias de sinalizao. Adaptado de Jerala (2007).

A sinalizao LPS/TLR4 pode ser separada em duas vias principais, a dependente e
a independente de MyD88 (Lu et al, 2008). Em ambas, o sinal transduzido pode levar
activao do factor nuclear-B (NF-B) e, consequentemente, sntese de citocinas, como
por exemplo, o TNF-o e as interleucinas-1, -6 e -8 (IL-1, IL-6 e IL-8), assunto que ser
desenvolvido na seco 1.5 deste captulo. Assim, promovem respostas inflamatrias, que
resultam na migrao de fagcitos para o local da inflamao, por exemplo atravs da
I Introduo
6

induo da expresso de molculas de adeso na superfcie de clulas endoteliais e de
leuccitos (Goldsby et al, 2003; Calder, 2006).

1.2 Migrao dos fagcitos
Como foi referido anteriormente, os mediadores qumicos com aco pr-inflamatria
induzem a expresso de molculas de adeso nas clulas do endotlio vascular e nos leu-
ccitos, o que leva iniciao da extravaso dos ltimos para a rea inflamada (Selvatici et
al, 2006).

Figura 5. Extravaso dos leuccitos. Esquema dos vrios passos inerentes ao processo de extravaso dos leuccitos.
1 contacto aleatrio do leuccito com as clulas endoteliais; 2 movimento de rolamento; 3 adeso; 4 diape-
dese, atravs do endotlio vascular; 5 quimiotaxia ou migrao atravs do tecido epitelial at regio inflamada.
Adaptado de Soehnlein et al, 2009.

Este processo iniciado pelo contacto aleatrio entre os leuccitos e as clulas
endoteliais dos vasos. Quando os leuccitos se aproximam da regio subendotelial dos
vasos sanguneos perto das reas inflamadas, respondem aos mediadores inflamatrios
produzidos localmente, iniciando-se o processo de rolamento (Selvatici et al, 2006). O
rolamento ocorre devido ao estabelecimento de interaces de baixa afinidade entre os
leuccitos e o endotlio, mediadas pelas selectina-P e -E nas clulas endoteliais e da selec-
tina-L nos leuccitos (Calder, 2006; Selvatici et al, 2006). medida que a afinidade aumen-
ta, inicia-se a aderncia das clulas parede endotelial dos vasos sanguneos, mediada
pelas integrinas-|1 e -|2 dos leuccitos e pelas molculas de adeso intercelular-1 (ICAM-
1) e vascular (VCAM-1) expressas nas clulas endoteliais (Calder, 2006; Selvatici et al,
2006). Aps a ligao firme, ocorre a migrao dos leuccitos, atravs das junes interce-
lulares das clulas endoteliais dos vasos, para o tecido (extravaso ou diapedese), mediada
pela molcula de adeso plaquetria-endotelial (PECAM-1) expressa nos leuccitos e no
endotlio, mas particularmente abundantes nas junes entre clulas, as passagens utili-
zadas pelos leuccitos durante a extravaso (Goldsby et al, 2003; Liu et al, 2004; Selvatici
et al, 2006;). Uma vez no tecido epitelial, os leuccitos migram para o local inflamatrio
(quimiotaxia), seguindo um gradiente de quimioatractores e estabelecendo interaces
protena-protena (Goldsby et al, 2003; Liu et al, 2004).
I Introduo

7

1.3 Fagocitose
Uma vez nos tecidos, os leuccitos iniciam a fagocitose. A fagocitose o processo atravs
do qual determinados materiais so ingeridos e digeridos por clulas especializadas
(Goldsby et al, 2003). Estes materiais podem ser antignios exgenos, como microorga-
nismos ou partculas insolveis, matria endgena, como clulas necrticas ou fragmentos
celulares, e ainda complexos imunes (Splettstoesser e Schuff-Werner, 2002; Goldsby et al,
2003). A fagocitose desencadeada pela interaco de opsoninas, que cobrem a partcula
a ser fagocitada, com receptores especficos da superfcie do fagcito (Garca-Garca e
Rolases, 2002).
Os leuccitos especializados na realizao de fagocitose so os neutrfilos, eosin-
filos e moncitos (em circulao) e macrfagos (nos tecidos), sendo os neutrfilos os mais
capacitados e os moncitos os menos capacitados. Este facto est obviamente relacionado
com as diferenas observadas na morfologia de cada tipo de clula (Goldsby et al, 2003),
como ser abordado na seco 2 deste captulo.
Na figura 6, representa-se o processo de fagocitose.

Figura 6. Fagocitose. Representao esquemtica dos acontecimentos durante a fagocitose: a ingesto da partcu-
la a fagocitar; b formao do fagossoma; c formao do fagolisossoma; d digesto da partcula; e exocitose
dos produtos da digesto. Adaptado de Goldsby et al, 2003.

Numa primeira fase, a membrana plasmtica expande-se em torno do material a fagocitar,
formando invaginaes denominadas pseudpodes (a). O material ento ingerido for-
mando-se um vacolo, denominado fagossoma (b), que avana para o interior da clula,
onde se funde com grnulos ricos em enzimas proteolticos e com lisossomas, formando o
fagolisossoma (c). Os lisossomas contm vrios enzimas hidrolticos, como o lisozima, que
digerem o material ingerido (d), sendo as partculas resultantes libertadas para o exterior
da clula por exocitose (e) (Goldsby et al, 2003). Todo este processo ocorre de uma forma
bastante rpida. Uma partcula razoavelmente opsonizada forma o vacolo fagoctico em
I Introduo
8

aproximadamente 20 segundos, sendo digerida quase imediatamente (Splettstoesser e
Schuff-Werner, 2002).
Para alm dos enzimas hidrolticos presentes nos lisossomas e dos enzimas proteo-
lticos existentes nos grnulos citoplasmticos, os fagcitos dispem de outras substncias
microbicidas, como as defensinas, os pptidos citotxicos e as espcies reactivas de oxig-
nio (ROS) e de azoto (RNS) (Goldsby et al, 2003).


1.4 Espcies reactivas de oxignio
Os fagcitos activados, durante a ingesto de partculas, produzem uma grande variedade
de molculas extremamente reactivas e com uma potente actividade microbicida, nomea-
damente as espcies reactivas de oxignio (Splettstoesser e Schuff-Werner, 2002; Goldsby
et al, 2003).
A produo de ROS iniciada pelo NADPH oxidase, um complexo enzimtico com
vrios componentes: flavocitocromo b
558
, p47
phox
, p67
phox
, p40
phox
e p21
rac
. No estado inac-
tivo, o flavocitocromo b
558
, componente principal, encontra-se associado membrana
plasmtica (que ir originar o fagossoma), estando os outros componentes solveis no
citosol (Segal, 2005; Calder, 2006; Halliwell, 2006). Aps a activao do fagcito, as subu-
nidades so reunidas na membrana do fagossoma, formando-se um complexo heterom-
rico (Lee et al, 2003). O enzima torna-se, assim, activo e inicia a reaco de reduo do
oxignio molecular, presente no vacolo fagoctico, a radical anio superxido (
-
2
O
-
), atra-
vs da transferncia de electres do NADPH (equao 1). Esta reaco leva a um consumo
abrupto de oxignio, que se designa por burst respiratrio (Goldsby et al, 2003; Fialkow et
al, 2007).
Equao 1
-
2
Oxidase NADPH
2
2O 2H NADP 2O H NADPH
- + + +
+ + + +

O anio superxido um radical pouco reactivo, na medida em que, apesar de
reagir muito rapidamente, s consegue interferir com um nmero reduzido de biomolcu-
las. Tem, por exemplo, a capacidade de inactivar enzimas bacterianos importantes, com
centros [Fe-S], mas apenas quando produzido intracelularmente nas bactrias. De facto,
no aparenta passar a parede celular ou membrana plasmtica dos microrganismos (Hal-
liwell, 2006).
I Introduo

9

Assim, a sua toxicidade no fagossoma conferida, principalmente, pela sua capaci-
dade de se combinar, rapidamente, com o radical cido ntrico (NO

), formando o peroxini-
trito, altamente txico (equao 2), e de ser rapidamente reduzido a perxido de hidrog-
nio (H
2
O
2
), espontnea ou enzimaticamente atravs do superxido dismutase, de acordo
com as equaes 3 e 4, respectivamente (Splettstoesser e Schuff-Werner, 2002; Halliwell,
2006).
Equao 2
- -
+ ONOO NO O
2

Equao 3
2. 2 2
-
2
O O H 2H 2O + +
+ -

Equao 4
2 2
Dismutase Superxido -
2
O H 2H O +
+ -



Desta reaco, advm uma outra vantagem para a capacidade de destruio do microor-
ganismo. medida que ies H
+
do interior do fagossoma so consumidos, d-se a entrada
de K
+
, a partir do citosol, levando tambm movimentao de ies Cl
-
. Estes movimentos
inicos, assim como a acumulao de produtos de degradao bacteriana, aumentam a
fora inica no fagossoma facilitando a libertao de proteases dos grnulos. , tambm,
providenciado um pH ptimo para o funcionamento das proteases, pelo aumento do pH
ocorrido devido diminuio de H
+
(Halliwell, 2006).
O H
2
O
2
, assim como o
-
2
O
-
, tem capacidade para reagir rapidamente, mas apenas
com um pequeno conjunto de molculas, como protenas hmicas. No entanto, ao contr-
rio do
-
2
O
-
, o H
2
O
2
consegue entrar rapidamente nos microrganismos, onde pode formar o
radical hidroxilo (OH

). Esta reaco ocorre na presena de um io metlico, por exemplo


Fe
2+
(reaco de Fenton), como representado na equao 5. O H
2
O
2
no dever formar
OH

no fagossoma, uma vez que existe lactoferrina que liga o ferro livre (Hampton et al,
1998; Halliwell, 2006).

Equao 5
+ - +
+ + +
3 2
2 2
Fe OH OH Fe O H

O OH

extremamente reactivo, reagindo rapidamente com a grande maioria das


biomolculas, causando modificaes no DNA, quebras nas duplas cadeias, inactivao
enzimtica e peroxidao lipdica. Por ser to reactivo, no muito eficiente, j que tem
um raio de aco reduzido, sendo provvel que reaja com outros alvos antes de alcanar o
microrganismo (Hampton et al, 1998).
I Introduo
10

Quando os lisossomas se fundem com o fagossoma inicia-se, tambm, a actividade
da mieloperoxidase (Halliwell, 2006). Este enzima tem uma estrutura di-hmica e apresen-
ta propriedades espectrais que lhe conferem uma colorao verde (responsvel pela cor
do pus) (Segal, 2005). Na presena de H
2
O
2
, catalisa a oxidao de ies de halognios (Cl
-
,
Br
-
, I
-
), formando cidos hipo-halososos (Babior, 2000). Devido elevada concentrao de
Cl
-
no organismo, produz-se principalmente hipoclorito (OCl
-
) (equao 6), que se converte
em cido hipocloroso (equao 7). A pH elevado, o equilbrio da reaco 7 encontra-se
deslocado para a formao de OCl
-
(Hampton et al, 1998; Babior, 2000; Halliwell, 2006).
Equao 6 O H OCl Cl O H
2
idase Mieloperox
2 2
+ +



Equao 7 HOCl H OCl +
+


Esta reaco responsvel pelo desaparecimento da grande maioria do H
2
O
2
formado
(Hampton et al, 1998).
O HOCl encontra-se, tambm, em equilbrio com o cloro na forma gasosa (Cl
2
) (a
pH baixo) (Hampton et al, 1998; Halliwell, 2006):
Equao 8
2 2
Cl O H Cl H HOCl + + +
+


O HOCl um oxidante forte, conseguindo entrar nos microorganismos e reagir com uma
vasta gama de compostos biolgicos (directamente ou via Cl
2
, uma vez que este tambm
apresenta propriedades bactericidas e fungicidas e entra facilmente nos microrganismos),
sendo considerado o oxidante mais bactericida produzido pelos fagcitos (Hampton et al,
1998; Halliwell, 2006). Os seus substratos so tiis e tiosteres (substratos preferenciais),
fenis, compostos com ligaes insaturadas e enzimas com centros Fe (Hampton et al,
1998).
Pode ainda formar cloraminas, ao reagir com grupos NH
2
do DNA, protenas e lpi-
dos (Hampton et al, 1998). Uma das cloraminas formadas em maior a clorotaurina, uma
vez que a taurina o aminocido livre mais abundante, no citosol dos leuccitos, princi-
palmente dos neutrfilos, existindo em concentraes de 10 a 30 mM (Marcinkiewicz et al,
1998). As cloraminas formadas so, tambm, bons agentes microbicidas, embora mais
fracos e tm menor capacidade para reagir com biomolculas do hospedeiro do que o
HOCl, fazendo com que possuam um tempo de vida superior (Hampton et al, 1998; Halli-
well, 2006). Reagem com tiis, tiosteres e centros [Fe]. A sua toxicidade depende da pola-
I Introduo

11

ridade e permeabilidade na membrana, sendo as cloraminas de protenas as menos txi-
cas e as monocloraminas as mais permeveis (Hampton et al, 1998).
No entanto, o fagossoma apresenta vrias protenas e agentes que podem reagir
tanto com o HOCl como com as cloraminas, o que indica que estes compostos podem no
conseguir actuar contra a partcula a fagocitar (Halliwell, 2006). Outro aspecto a considerar
o facto de a deficincia em mieloperoxidase ser, tipicamente, assintomtica. 1 em cada
2000 pessoas tm deficincia em mieloperoxidase e no apresentam qualquer predisposi-
o para infeces, com excepo de alguns casos de susceptibilidade a infeces por
Candida (Segal, 2005; Halliwell, 2006). Uma possvel explicao para este facto poder ser
o envolvimento de outros mecanismos oxidativos. Um controlo eficiente dos microorga-
nismos apresenta uma importncia extrema para a sobrevivncia das clulas, pelo que
estas no podem basear a sua defesa apenas num mecanismo microbicida. De facto, em
neutrfilos sem actividade de mieloperoxidase, h um consumo superior de oxignio, uma
maior produo de superxido e perxido de hidrognio e ocorre mais fagocitose e des-
granulao. (Hampton et al, 1998; Halliwell e Gutteridge 1999)
O HOCl tem outro mecanismo de aco na proteco do hospedeiro contra os
microoganismos que consiste na inactivao de molculas com sensibilidade de qurum
secretadas por algumas bactrias. Quando os nveis destas molculas atingem o patamar
indicativo de uma determinada densidade celular dessa populao, so activadas vias
reguladoras que levam alterao da expresso gentica das bactrias de modo a causar
um aumento da virulncia. (Madigan et al, 2003; Halliwell, 2006)
O HOCl pode, tambm, gerar OH

, reagindo quer com o


-
2
O
-
(equao 9), quer com
o Fe
2+
(equao 10) (Halliwell, 2006).
Equao 9
- -
+ + + Cl OH O O HOCl
2 2

Equao 10
- + +
+ + + Cl OH Fe Fe HOCl
3 2

O HOCl pode, ainda, reagir com o H
2
O
2
, formando oxignio singuleto (
1
O
2
) (Halli-
well, 2006).
Equao 11
2
1
2 2 2
O O H O H OCl + +


O
1
O
2
apresenta alguma toxicidade, conseguindo reagir com os lpidos de membra-
na, no entanto, no uma espcie muito produzida pelos fagcitos (Hampton et al, 1998;
Halliwell, 2006).
Na figura 7, encontra-se esquematizada a produo de ROS pelos fagcitos.
I Introduo
12


Figura 7. Produo de ROS. Possvel mecanismo para a produo de ROS num fagcito activado.

As ROS, para alm da importncia que desempenham na defesa do hospedeiro, como
agentes microbicidas, tm um papel importante como molculas sinalizadoras. A maioria
das ROS produzidas no burst respiratrio libertada para o espao extracelular. Como
algumas so permeveis membrana, podem influenciar vias de sinalizao de outros
leuccitos ou outros tipos de clulas presentes na regio inflamada, como o endotlio vas-
cular, modulando cinases e fosfatases proteicas e lipdicas, receptores de membrana,
canais inicos e factores de transcrio (Fialkow et al, 2007). H fortes evidncias de que
um destes factores seja o NF-B. Observaram-se vrias situaes onde as ROS esto envol-
vidas na activao do NF-B e regulao de genes, induzidas por citocinas. H, no entanto,
vias de activao independentes de ROS, observadas em determinadas clulas e condies
experimentais, nas quais estas espcies no esto envolvidas na via principal de activao
do NF-B. Estes mecanismos de sensibilidade varivel da via de activao do NF-B s ROS
no so, ainda, completamente compreendidos (Clark e Valente, 2004).

1.5 Factor de transcrio NF-B
O factor nuclear B (NF-B) um dos reguladores centrais da sobrevivncia celular, imu-
nidade inata e adaptativa e respostas inflamatrias, sendo expresso de forma ubqua
(Skaug et al, 2009; Vallabhapurapu e Karin, 2009). um factor de transcrio de resposta
imediata, levando transcrio de genes envolvidos na sobrevivncia e proliferao celula-
res, como factores de crescimento, e respostas imunitrias, como citocinas, receptores de
citocinas e molculas de adeso (Naumann, 2000; Roman-Blas, e Jimenez, 2006).
A famlia do NF-B nos mamferos constituda por cinco membros: p65 (ou RelA),
RelB, c-rel (ou REL), NFB1 (p50 e o seu precursor p105) e NFB2 (p52 e o seu precursor
p100). Estas protenas so estruturalmente homlogas, apresentando um domnio de
I Introduo

13

homologia Rel (RHD), responsvel pela formao de homo e heterodmeros, ligao ao
DNA, translocao nuclear e interaco com as protenas inibidoras de NF-B (IB) (Sun e
Ley, 2008; Uwe, 2008; Skaug et al, 2009; Vallabhapurapu e Karin, 2009).
O complexo dimrico NFB, em clulas no-estimuladas, est tipicamente retido
no citoplasma, ligado a um membro da famlia das IB. Existem trs tipos de protenas IB:
as IB clssicas (IBo, IB| e IB), os precursores de NFB (p100 ou IB e p105 ou IB)
e as IB no-usuais (Bcl-3, IB e IBNS) (Uwe, 2008; Vallabhapurapu e Karin, 2009). Estas
protenas so caracterizadas pela presena de mltiplas repeties de anquirina, que
medeiam a ligao aos dmeros de NF-B, mascarando a sequncia de localizao nuclear
(NLS) no RHD, impedindo a sua exposio.
Apesar de serem semelhantes em estrutura, estas protenas apresentam diferen-
as funcionais, nomeadamente nos dmeros aos quais se ligam, e diferenas nas cinticas
de degradao e ressntese. Por exemplo, considerando as IB clssicas, a IB liga-se pre-
ferencialmente ao heterodmero p65:p50 e degradada muito rapidamente, aps estmu-
lao com LPS ou TNF-; a IB tambm se liga preferencialmente a p65:p50 mas degra-
dada e ressintetizada mais lentamente; a IB regula preferencialmente c-Rel:p50 e apre-
senta cinticas de degradao e ressntese semelhantes a IB. (Vallabhapurapu e Karin,
2009)
A estimulao celular com um de vrios agonistas leva a uma rpida cascata de fos-
forilao, poliubiquitinao e degradao proteassomal das IB. Este processo liberta as
subunidades NFB, que se translocam para o ncleo, onde regulam a transcrio de
genes alvo. (Uwe, 2008; Skaug et al, 2009)
A fosforilao das IB efectuada pelo complexo cinase das IB (IKK). Os comple-
xos IKK so constitudos por duas subunidades cataliticamente activas, a IKKo (IKK-1) e a
IKK| (IKK-2), e uma subunidade estrutural e reguladora, a IKK (ou modulador essencial de
NFB NEMO) (Uwe, 2008).
A activao do NFB tipicamente mediada pela degradao da IBo,
IB IB, ligados a heterodmeros p65:p50 e c-rel:p50. Esta via, denominada cannica,
estimulada por vrios receptores imunes, como TLR, receptores de IL-1, de TNF e de anti-
gnios. Quando o ligando se liga ao receptor, iniciada uma transduo de sinal que cul-
mina na activao do complexo IKK. Uma vez activado, este complexo fosforila a IB,
levando sua poliubiquitinao e consequente degradao proteassomal (Sun e Ley, 2008;
Skaug et al, 2009). Este processo liberta as subunidades NFB, que se translocam para o
I Introduo
14

ncleo, onde regulam a transcrio de genes que codificam para quimiocinas, citocinas,
molculas de adeso, enzimas associados inflamao e inibidores de apoptose. Desta
forma, a via clssica est muito relacionada com respostas inflamatrias e sobrevivncia
de clulas imunitrias profissionais (Uwe, 2008). Outro gene regulado pelo NF-B o da
IB, que desta forma pode entrar no ncleo, deslocar o NF-B do DNA e transport-lo de
novo para o citoplasma, formando um loop de feedback negativo. Assim, sem um estmulo
activador persistente, o NF-B rapidamente sequestrado pela IB (Skaug et al, 2009).

Vias de activao do NFB atpicas, envolvendo o p105 e o p100, tambm tm importn-
cia para as funes imunitrias. A via mediada pelo p100, denominada via no-cannica,
desencadeada por um conjunto de membros da famlia do TNF e leva activao da cinase
indutora do NFB (NIK) que activa a IKK-1. A IKK-1, por sua vez, fosforila o p100, desen-
cadeando a sua poliubiquitinao e subsequente protelise parcial pelo proteassoma,
produzindo-se o p52 (Sun e Ley, 2008; Skaug et al, 2009). Este transloca-se para o ncleo,
em associao ao RelB, onde leva transcrio de genes importantes para a maturao de
clulas B e formao de rgos linfides (Sun e Ley, 2008; Uwe, 2008).
Ao contrrio da via no-cannica, o processamento proteassomal do p105 no
regulado pela estimulao com agonistas. O p105 fosforilado pelo IKK, marcando-o para
degradao completa pelo proteassoma ou processamento para formar p50, libertando as
subunidades de NFB. (Sun e Ley, 2008). A prevalncia de cada tipo de processamento,
assim como o papel da ubiquitinao no processo, tem sido controverso.
Na figura 8, encontram-se resumidas as vias cannica e no-cannica de activao
do NFB.
Existe muita especulao quanto aos locais em que as ROS podem actuar, na via de
activao do NF-B. Entre os mecanismos propostos, esto a activao de cinases sinaliza-
doras, sensveis a estados redox, a montante do passo de activao do NF-B, a induo de
tioredoxina, que afecta a actividade de ligao das protenas de NF-B, e modificaes
oxidativas directas de componentes do complexo NF-B/IB (Clark e Valente, 2004).
I Introduo

15


Figura 8. Vias de activao do NF-B. Esquema resumo das vias de activao do NF-B, cannica e no-cannica. A
ligao dos ligandos aos receptores induz a activao das IKK, que fosforilam as IB (IB e p100), marcando-as para
degradao (IBo) ou processamento (p100), pelo proteassoma. Este processo resulta na libertao dos dmeros de
NF-B, que so translocados para o ncleo onde vo induzir a transcrio de genes envolvidos em vrios mecanis-
mos imunitrios. Adaptado de Skaug et al, 2009.

Como foi referido anteriormente, a sinalizao por LPS/TLR4 pode levar activao
de uma de duas vias, a dependente e a independente de MyD88.
Aps o estmulo com LPS e activao do TLR4, a MyD88 recruta e activa membros
da famlia de protenas cinases associadas ao receptor de IL-1 (IRAK). Inicialmente, acti-
vada a IRAK4, que, por sua vez, fosforila e activa a IRAK1. Em seguida, ambas se dissociam
da MyD88 e interagem com o factor 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6). O TRAF6
promove a poliubiquitinao dele prprio e do NEMO, e ambos recrutam, de seguida, a
protena cinase1 activada pelo factor de crescimento transformador (TAK1), que depois
activa duas vias distintas, envolvendo a IKK e a cinase de MAP (MAPK) (Kawai e Akira,
2007). A activao da IKK, como j foi referido, leva activao do NF-B. A activao da
via da MAPK induz outro factor de transcrio, o AP-1, que tambm apresenta um papel
na expresso de citocinas pr-inflamatrias (Lu et al, 2008).
O NF-B pode ser activado pela via independente de MyD88 (e dependente de
TRIF, uma protena adaptadora indutora de interfero- contendo TIR). O TRIF liga o
TRAF6, que activa a TAK1 de maneira semelhante da via dependente de MyD88. A RIP1
poliubiquitinada para formar um complexo com o TRAF6 e a TAK1, o que resulta na activa-
o do NF-B (Kawai e Akira, 2007). Esta via leva tambm activao de IRF3, que, junta-
I Introduo
16

mente com o NF-B, activa a transcrio de genes alvo, como interferes tipo I (Lu et al,
2008).


Figura 9. Transduo de sinal para a activao do NF-B, atravs da ligao LPS/TLR4. Vias dependente e indepen-
dente de MyD88 levam activao do NF-B. Adaptado de Lu et al, 2008

A activao do NF-B leva produo de citocinas pr-inflamatrias, como j foi
referido. Entre estas esto o TNF-, a IL-1 e a IL-6, sendo que as duas primeiras so activa-
doras da via do NF-B. Atravs destas, ou de outros factores de cujos genes leva transcri-
o, o NF-B est implicado em vrias doenas inflamatrias e no cancro, induzindo proli-
ferao, invaso e metstase, angiognese e quimioresistncia (Aggarwal et al, 2008).


I Introduo

17

2 Fagcitos
Os leuccitos so as clulas sanguneas que medeiam as respostas imunitrias. Podem ser
agrupados em granulcitos e clulas mononucleares. Os granulcitos tm esta denomina-
o porque contm grnulos com diferentes substncias qumicas e so classificados de
acordo com a sua morfologia celular e caractersticas citoplasmticas de colorao. Divi-
dem-se em trs classes destas clulas: neutrfilos, eosinfilos e basfilos. As clulas
mononucleares (PBMC clulas mononucleares do sangue perifrico) incluem os linfci-
tos, moncitos e macrfagos (Goldsby et al, 2003).
Destes tipos de clulas, como j foi referido, apenas os neutrfilos, os eosinfilos e
os moncitos (em circulao) e macrfagos (nos tecidos) so capazes de realizar fagocito-
se. Atendendo aos tipos de clulas utilizados neste trabalho, apenas sero considerados os
neutrfilos e os moncitos.

2.1 Neutrfilos
Os neutrfilos representam 50 a 70% dos leuccitos em circulao, constituindo a primeira
linha de defesa contra agentes infecciosos e substncias exgenas que penetram as barrei-
ras fsicas do organismo (Selvatici et al, 2006).
Os neutrfilos so produzidos na medula ssea, por hematopoiese e apresentam
linhagem mielide. So libertados para a corrente sangunea, onde circulam durante 7 a
10 horas. Aps a sua migrao para os tecidos, o seu tempo mdio de vida de alguns dias
(Goldsby et al, 2003).
Os neutrfilos so clulas fagocticas, caracterizadas pela presena de grnulos
citoplasmticos e um ncleo multilobado, razo pela qual so tambm denominados leu-
ccitos polimorfonucleares (PMN) (Goldsby et al, 2003).

Figura 10. Morfologia do neutrfilo. 1 Ncleo multilobado; 2 Fagossoma; 3 Grnulo primrio; 4 Grnulo
secundrio. Adaptado de Goldsby et al, 2003

I Introduo
18

A actividade microbicida dos neutrfilos conferida pelos enzimas lticos e com-
postos bactericidas que esto presentes nos grnulos e lisossomas (Goldsby et al, 2003;
Selvatici et al, 2006). Com base na funo e contedo enzimtico, os grnulos dos neutrfi-
los podem ser divididos em trs tipos principais: azurfilos (ou primrios), especficos (ou
secundrios) e de gelatinase (ou tercirios). Pode ser feita outra classificao, com base na
colorao histoqumica, na presena ou ausncia de peroxidase (Selvatici et al, 2006).
O neutrfilo possui, ainda, no citoplasma vesculas secretoras que so as estruturas
intracelulares mobilizadas mais rapidamente. A sua importncia conferida pela sua
membrana, particularmente rica em receptores e protenas que, aquando da exocitose,
so integradas na membrana do neutrfilo. Estas vesculas so mobilizadas quando o neu-
trfilo estabelece o primeiro contacto, de rolamento, com o endotlio activado, transfor-
mando o neutrfilo numa clula com expresso de |-integrina possibilitando, assim, a
diapedese do neutrfilo para os tecidos (Borregaard e Cowland, 1997). Contm, tambm,
na sua matriz, protenas importantes para a extravaso de outros neutrfilos e moncitos.
As protenas azurocidina e proteinase-3 so fortes activadoras de clulas endoteliais. A
activao das clulas endoteliais pode levar no s ao aumento da expresso de molcula
de adeso vascular (VCAM-1) e intercelular (ICAM-1) mas tambm ao aumento da liberta-
o de quimiocinas. Por exemplo, a proteinase-3 aumenta a secreo de CCL2 das clulas
endoteliais, cujo receptor, CCR2, expresso nos moncitos (Soehlein et al, 2009).
Os grnulos tercirios so libertados em seguida e contm enzimas, como gelatina-
se e lisozima, e algumas protenas de membrana. O colagnio IV e V, os principais compo-
nentes das membranas basais e tecidos intersticiais, respectivamente, so substratos da
gelatinase. Assim, a exocitose destes grnulos permite a migrao dos neutrfilos atravs
da membrana basal que separa o endotlio do tecido extravascular (Borregaard e Cow-
land, 1997).
Os grnulos especficos tm a funo de recolocar componentes de membrana e
limitar as reaces das espcies reactivas de oxignio e azoto. Estes grnulos contm lac-
toferrina, colagenase e quase dois teros do lisozima total. Existem tambm protenas de
membrana, como o flavocitocromo b558 (componente do NADPH oxidase) e o receptor do
fMLP. A exocitose destes grnulos, mobilizados depois dos tercirios, contribui tambm
para a migrao do neutrfilo pelos tecidos (Borregaard e Cowland, 1997; Segal, 2005).
Os grnulos primrios, maiores e mais densos, so libertados apenas quando o
neutrfilo chega ao tecido extravascular, fundindo-se com o fagossoma nascente e liber-
I Introduo

19

tando o seu contedo para o fagossoma. O microorganismo ingerido fica, assim, exposto a
uma gama de agentes txicos com actividades aparentemente redundantes (Segal, 2005;
Nauseef, 2007; Soehlein et al, 2009). Contm, para alm de enzimas que ajudam na sua
migrao pelo tecido, protenas e pptidos direccionados para a morte e digesto do
microrganismo. Contm MPO, protena que leva ao aumento da permeabilidade da mem-
brana bacteriana e trs proteinases neutras predominantes: catepsina G, elastase e pro-
teinase 3 (Segal, 2005). A proteinase-3 e catepsina G clivam a IL-8 e o pptido-78 epitelial
activador de neutrfilos (ENA-78), respectivamente, libertando as formas truncadas das
quimiocinas, que tm maior actividade quimioatractora do que as formas originais (Soeh-
lein et al, 2009). Estes grnulos tm tambm cerca de um tero de toda a lisozima da clu-
la. A matriz destes grnulos carregada negativamente e apresenta um pH acdico, o que
leva imobilizao de todos as protenas e pptidos (com excepo do lisozima) e sua
manuteno num estado inactivo (Segal, 2005). Este tipo de grnulos pode ser subdividido
em duas subcategorias, consoante a presena ou ausncia de defensinas (Borregaard e
Cowland, 1997).

2.2 Moncitos
Os moncitos so clulas fagocticas mononucleares e representam 1 a 6% dos leuccitos
em circulao. Como os neutrfilos, so produzidos na medula ssea, por hematopoiese, e
apresentam linhagem mielide. (Goldsby et al, 2003) Circulam na corrente sangunea
durante 1-2 dias, aps os quais migram para os tecidos onde se diferenciam em macrfa-
gos residentes (Murdoch et al, 2005). Quando se diferenciam em macrfagos, o tamanho
das clulas aumenta de cinco a dez vezes, os seus organitos tornam-se mais numerosos e
complexos e a sua capacidade fagoctica aumenta (Goldsby et al, 2003).

Figura 11. Morfologia do moncito e do macrfago. Esquema da estrutura do moncitos (a) e dos macrfagos (b).
1 Ncleo, 2 lisossoma, 3 fagossoma, 4 grnulo, 5 fagolisossoma, 6 pseudpode. Adaptado de Goldsby et
al, 2003.

I Introduo
20

Os moncitos apresentam, de facto, uma menor capacidade fagoctica, comparati-
vamente aos neutrfilos e aos macrfagos (Garca-Garca e Rolases, 2002). No entanto, a
sua capacidade de matar microorganismos mais diversificada do que a dos neutrfilos
(Dale et al, 2008). Os moncitos (assim como os macrfagos) expressam todos os recepto-
res de Fc (FcR), que se ligam a esta regio nas imunoglobulinas (Ig), e apresentam um
papel muito importante na fagocitose, atravs da opsonizao (Garca-Garca e Rolases,
2002). Pelo contrrio, os neutrfilos s expressam uma isoforma de FcR e apenas em res-
posta a estmulos inflamatrios. Tambm a expresso de receptores TLR muito mais ele-
vada em moncitos do que em neutrfilos (Dale et al, 2008).
Tanto os moncitos como os macrfagos apresentam duas populaes distintas de
grnulos, os grnulos sem peroxidase e os grnulos com peroxidase. Os primeiros contm
MPO, elastase e catepsina G (Calafat et al, 1997). As protenas granulares so, portanto,
semelhantes s dos neutrfilos. No entanto, os moncitos preservam a capacidade de
aumentar a produo de novas protenas granulares, atravs de sntese proteica, uma
caracterstica perdida pelos neutrfilos maduros. Esta capacidade de produzir novas pro-
tenas inclui tambm uma variedade de citocinas associadas com o aumento da resposta
inflamatria (Dale et al, 2008).
Existem ainda diferenas ao nvel da resposta quimiotctica e do burst respiratrio,
durante a fagocitose (Dale et al, 2008). Num local de inflamao, os moncitos acumulam-
se mais lentamente, uma vez que a sua migrao para o local inflamatrio, como j foi
referido, depende em parte da desgranulao dos neutrfilos, mas persistem durante mais
tempo, uma vez que tm uma maior capacidade de sobrevivncia (Dale et al, 2008; Soehn-
lein et al, 2009). O seu burst respiratrio no to intenso como o dos neutrfilos (Dale et
al, 2008).


I Introduo

21

3 Consequncias da inflamao
A inflamao e a resposta inflamatria fazem parte da imunidade inata, constituindo uma
resposta normal. Apesar disto, quando ocorre de uma forma descontrolada ou inapropria-
da, pode resultar numa leso excessiva dos tecidos. Esta resposta descontrolada ou ina-
propriada caracterizada por uma hiper-expresso de molculas de adeso em leuccitos
e clulas endoteliais, aparecimento de formas solveis de molculas de adeso, sequestro
de leuccitos para locais onde estes no so normalmente encontrados e excesso de pro-
duo de mediadores inflamatrios (Calder, 2006). Estes factores podem contribuir para
um excesso de oxidantes que, apesar de serem muito reactivos, devido s quantidades em
que so produzidos (normalmente na gama do milimolar) podem conseguir difundir-se
para fora do local inflamatrio, podendo sobrecarregar a capacidade dos sistemas de
defesa antioxidante de clulas no afectadas inicialmente (DAlessandro et al, 2003). A
condio de stress oxidativo subsequente pode provocar leses nos lpidos, membranas,
protenas e DNA da clula (Madamanchi et al, 2005). As doenas inflamatrias crnicas,
como a artrite reumatide, hepatite, colite ulcerativa, pancreatite e doena de Crohn,
esto relacionadas com uma leso grave dos tecidos e apresentam um aumento na oxida-
o e clorao de protenas, lpidos e DNA, consistente com uma produo exacerbada de
espcies reactivas de oxignio (Halliwell, 2006). A MPO libertada pelos fagcitos pode
levar formao extracelular de HOCl e de cloraminas que podem, por sua vez, inactivar o
inibidor de proteases, o
1
-antiprotease, normalmente presente no plasma e lquidos
extracelulares (Babior, 2000; Halliwell, 2006). Considerando que, muitas vezes, o contedo
dos grnulos azurfilos libertado antes da formao completa do fagossoma, parte des-
te, includo as proteases neutras, vertido para os tecidos vizinhos (Babior, 2000). Assim, a
referida inibio do o
1
-antiprotease por parte do HOCl e das cloraminas pode levar a uma
aco proteoltica, potencialmente lesiva. O mesmo pode ocorrer aquando da morte das
clulas fagocticas por necrose (Halliwell, 2006).
Nveis elevados de TNF-, IL-1 and IL-6, citocinas produzidas atravs da activao
do NF-B, so particularmente destrutivos e esto implicados na origem de algumas res-
postas patolgicas que ocorrem no choque endotxico e doenas inflamatrias crnicas,
como a artrite reumatide. A produo excessiva de TNF-o e IL-1 pode causar perda mus-
cular e ssea e pode ser responsvel pelas alteraes na composio corporal e perda
tecidual, observadas nas doenas inflamatrias (Calder, 2006).
I Introduo
22

Para alm das doenas inflamatrias clssicas, vrias outras patologias tm asso-
ciada uma componente inflamatria. o caso das doenas cardiovasculares e do cancro,
onde as ROS desempenham um papel preponderante no seu desenvolvimento (Calder,
2006).
Por todas estas razes, tem-se constatado um interesse crescente em avaliar a
capacidade de compostos naturais para diminuir os efeitos secundrios de situaes de
inflamao, como por exemplo, os flavonides.


I Introduo

23

4 Flavonides
Os flavonides so compostos polifenlicos, presentes em todas as plantas vasculares. Os
cerca de 4000 compostos identificados derivam do mesmo precursor, a 2-hidroxicalcona
(Gomes et al, 2008).
Os flavonides possuem uma estrutura comum, consistindo em dois anis arom-
ticos (A e B) ligados entre si por um anel heterocclico (anel C). Com base no estado de
oxidao, nos grupos funcionais ligados ao anel C e da ligao dos anis B e C, os flavoni-
des podem ser divididos em sete classes: catequinas, antocianidinas, flavonis, flavonas,
flavanonas, isoflavonas e neoflavonides. (Gomes et al, 2008)
Neste trabalho estudaram-se quatro flavonides: a quercetina e a fisetina, que
pertencem classe dos flavonis, e a naringenina e a naringina, pertencentes classe das
flavanonas.

Figura 12. Estrutura dos flavonis, incluindo quercetina e fisetina.


Figura 13. Estrutura das flavanonas, incluindo naringenina e naringina.

H muito que so reconhecidas, nos flavonides, propriedades anti-hepatotxicas,
anti-inflamatrias, anti-aterognicas e anti-cancergenas, propriedades que tm sido atri-
budas ao poder antioxidante destes compostos. Como foi referido anteriormente, as ROS
contribuem para o envelhecimento celular, mutagnese, carcinognese e doenas carda-
cas, possivelmente atravs da destabilizao de membranas, leso do DNA e oxidao das
lipoprotenas LDL. (Gomes et al, 2008 e Heim et al, 2002).
De facto, os flavonides apresentam as caractersticas necessrias a um bom cap-
tador de espcies oxidativas, como radicais e HOCl: reage com vrios tipos de oxidantes, a
I Introduo
24

estequiometria da reaco elevada e o produto resultante tem uma elevada estabilida-
de. Existem, por isso, vrios estudos que descrevem os flavonides como captadores espe-
cficos de radicais como HO

e o O
2
-
e HOCl, estabelecendo relaes de estrutura-
actividade de captao destas espcies. (Gomes et al, 2008)
A distribuio espacial dos substituintes talvez o maior determinante para a acti-
vidade antioxidante. A observao de que tanto a configurao como o nmero total de
grupos hidroxilo influenciam substancialmente vrios mecanismos de actividade antioxi-
dante consistente na maioria dos compostos polifenlicos. (Heim et al, 2002)
Para a captao de radicais, a caracterstica estrutural mais importante o grupo
orto-catecol no anel B, que confere ao flavonide a sua actividade antioxidante. Outras
estruturas que tambm influenciam a captao de radicais so, por exemplo, a dupla liga-
o C2=C3 e o grupo 3-OH, embora sejam mais preponderantes na ausncia do referido
grupo orto-cartecol. (Gomes et al, 2008). A capacidade de captao de radicais princi-
palmente atribuda elevada reactividade dos grupos OH, que participam na reaco evi-
denciada na equao 12.

Equao 12 FOH + R

FO

+ RH

Os grupos OH do anel B doam hidrognio e electro aos radicais, formando-se uma
radical de flavonide, relativamente estvel.

Figura 14. Esquema das caractersticas dos flavonides que conferem poder de captao de radicais. As caracters-
ticas estruturais importantes na captao de radicais encontram-se evidenciadas a negrito. Gomes et al, 2008.

Para a captao de cido hipocloroso, o grupo orto-catecol no aparenta ter muita
importncia, ao contrrio dos grupos 3-, 5- e 7-OH. De facto, em estudos realizados por
Boesma et al (1999) foi observado que compostos hidroxilados nas posies 5 e 7, do anel
A, eram clorados em C6 e C8, atravs de uma reaco de substituio electroflica arom-
tica em que os grupos 5 e 7 OH (activadores e directores orto e para) promovem a clora-
o. Estes estudos indicam tambm que a hidroxilao em C3 apresenta um efeito poten-
I Introduo

25

ciador na captao de HOCl (Gomes et al, 2008), assim como a ligao dupla C2=C3, uma
vez que conferem coplanaridade aos anis B e C, permitindo a redistribuio dos electres
provenientes de grupos ricos em electres (Cl) ligados ao anel A (Justino et al, 2009).

Figura 15. Esquema das caractersticas dos flavonides que conferem poder de captao de HOCl. As caractersti-
cas estruturais importantes na captao de HOCl encontram-se evidenciadas a negrito.

No entanto, a actividade anti-inflamatria destes compostos tambm resultante
da sua capacidade de interaco com vrios enzimas chave, cascatas de activao, envol-
vendo citocinas e factores de transcrio reguladores, e sistemas antioxidantes. H vrios
estudos que indicam um papel inibidor dos flavonides na via do NF-B, ainda que no se
saiba o local exacto onde actuam, nem esto determinadas relaes estrutura actividade.
(Gomes et al, 2008)












II Objectivo

II Objectivo

28

A resposta inflamatria um mecanismo da imunidade inata, importante para a elimina-
o de microorganismos invasores. No entanto, quando se torna persistente ou ocorre de
forma exacerbada pode ter consequncias graves para o organismo, levando leso de
tecidos e ao desenvolvimento de doenas inflamatrias, como a artrite reumatide, ou
cancro. O facto de os medicamentos anti-inflamatrios apresentarem numerosos e graves
efeitos secundrios, levou a um crescente interesse na pesquisa de teraputicas alternati-
vas com especial incidncia nos compostos de origem natural como os flavonides, aos
quais so atribudas, desde h muito tempo, propriedades anti-inflamatrias.
O objectivo deste trabalho foi estudar, in vitro, as potenciais propriedades anti-
inflamatrias de flavonides, tais como quercetina, fisetina, naringenina e naringina.
Assim, numa primeira fase, foi avaliada a eficincia relativa dos flavonides em
estudo para reagirem com o HOCl produzido por sntese qumica e por neutrfilos huma-
nos, activados ex vivo. A actividade antioxidante, em relao captao de HOCl, foi ava-
liada atravs de ensaios de competio: inibio da oxidao do vermelho de pirogalol
(PGR), inibio da clorao da taurina (mtodos espectrofotomtricos), e inibio da oxi-
dao duma sonda fluorescente, a 3-aminofenilfluorescena (APF), por espectrofluorime-
tria e citometria de fluxo.
Na segunda fase do trabalho foram avaliados os efeitos, a nvel celular, na modula-
o de genes pr-inflamatrios, nomeadamente atravs do factor de transcrio NF-B.
Para tal, foram analisados extractos celulares de clulas monocticas incubadas com flavo-
nides e activadas com LPS, atravs de Western blot.
















III Materiais e Mtodos

III Materiais e Mtodos

30

1 Reagentes
O acetato miristato de forbol (PMA), a acrilamida, a albumina de soro bovino (BSA), o anti-
corpo anti-|-actina (A5060), o azul de bromofenol, o azul de Coomassie, o azul de tripano,
a benzamidina, a catalase, o dextrano, o ditiotreitol (DTT), o fenilmetanosulfonilfluorido
(PMSF), o HEPES, o hipoclorito de sdio, a leupeptina, o lipopolissacrido (LPS), o |-
mercaptoetanol, a N,N-metileno-bisacrilamida, a naringenina, a naringina, o nonidet P40,
a pepstatina, o percoll, o piruvato de sdio, o Ponceau S, a quercetina, o reagente de Brad-
ford, os reagentes revelador e fixador, a resina Amberlite Dowex MR-3, a soluo salina
tamponada em fosfato de Dulbecco (D-PBS), o sulfato de magnsio, a taurina, o N,N,N',N'-
tetrametiletilenodiamina (TEMED) e o vermelho de pirogalol (PGR) foram adquiridos
Sigma Chemical Co. (Madrid, Espanha). O acetato de sdio, o cido actico, o cido sulfri-
co, o cloreto de amnia, o cloreto de clcio, o cloreto de sdio, o dihidrogenofosfato de
potssio, o dihidrogenofosfato de sdio, a dimetilformamida (DMF), o cido etilenodiami-
no tetra-actico (EDTA), o glicerol, a glicina, a D-glucose, o hidrogenofosfato de potssio, o
hidrxido de potssio, o hidrxido de sdio, o metanol, a sacarose, o Tris e o tween 20
foram adquiridos Merck (Darmstadt, Alemanha). A fisetina e a 3,3,5,5-
tetrametilbenzidina (TMB) foram adquiridas Aldrich (Steinheim, Alemanha). A acrilamida
e o cloreto de potssio foram adquiridos Fluka (Buchs, Sua). O alamarBlue e a sonda
3'-p-aminofenil fluorescena (APF) foram aquiridos Invitrogen (Carlsbad, Estados Unidos
da Amrica). O etanol e o iodeto de potssio foram obtidos Riedel de Haen. A glutamina,
a penincilina/estreptomicina, RPMI 1640 e o soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos
Lonza (Verviers, Blgica). Os anticorpos anti-p65 (sc-372), anti-iBo (sc-371) e anti-rabbit
(sc-2004) foram adquiridos Santa Cruz Biotechnology (Bergheimer, Alemanha), o ficoll-
paque foi adquirido GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido), o persulfureto de
amnia (PSA) foi adquirido Promega (Madrid, Espanha), o hidrogenofosfato de sdio foi
adquirido Panreac (Barcelona, Espanha) e o dodecil sulfato de sdio (SDS) foi adquirido
GIBCO-BRL (Carlsbad, Estados Unidos da Amrica). O marcador de pesos moleculares de
protenas foi adquirido Bio-Rad (Hemel Hempstead, Reino Unido).



III Materiais e Mtodos

31

2 Material Biolgico
Utilizaram-se diferentes tipos de clulas neste projecto: neutrfilos e clulas mononuclea-
res (especificamente moncitos), extrados a partir de sangue humano, bem como uma
linha celular, THP-1, obtida a partir de sangue perifrico humano com leucemia monoctica
aguda (ECACC European Collection of Cell Cultures, UK), adquirida atravs da Sigma Che-
mical Co. (Madrid, Espanha).
O manuseamento das clulas monocticas (THP-1 e moncitos) era realizado numa
cmara de fluxo laminar Class II Biohazard Safety Cabinet, da ESCO, usando tubos e caixas
de cultura da BD Falcon.
A linha celular THP-1 foi mantida num meio de cultura apropriado, consistindo em
RPMI-1640 suplementado com os antibiticos penicilina e estreptomicina (100 U/mL),
glutamina (2 mM) e 10% (v/v) de soro FBS inactivado. As clulas THP-1 eram mantidas
numa estufa a 37 C e 5% CO
2
SL ShelLab CO
2
Series, da Sheldon Mfg. Inc., onde eram
tambm realizados os perodos de incubao inerentes aos ensaios efectuados com ambos
os tipos de clulas monocticas.
A contagem e a avaliao da viabilidade das clulas (neutrfilos, THP-1 e monci-
tos) foram realizadas num hemacitmetro (cmara de Neubauer) da Albert Sass (profun-
didade - 0,1mm; 1/400 mm
2
), utilizando um microscpio AE21, da Motic.


III Materiais e Mtodos

32

3 Estudo da captao de HOCl por flavonides
Como foi referido, o HOCl considerado a espcie reactiva de oxignio mais microbicida e,
ao mesmo tempo, com maior capacidade de lesar o organismo do hospedeiro. Desta for-
ma, considerou-se pertinente a avaliao do poder de captao desta espcie por flavo-
nides.
Nos mtodos usados, era calculado o valor de IC
50
, ou seja, a concentrao de fla-
vonide necessria para inibir em 50% a oxidao dos substratos usados nos ensaios, pelo
HOCl. Este clculo foi efectuado com recurso ao programa OriginPro, no qual se ajustava
uma equao (linear, exponencial ou sigmide) aos pontos obtidos no tratamento dos
valores de absorvncia ou fluorescncia lidos nos ensaios. A partir da equao fornecida
pelo programa, era calculado o IC
50
e o seu erro associado. O erro foi calculado com base
no teorema de propagao de erros (Atkinson, 1988).

3.1 Captao de HOCl produzido quimicamente
Na primeira fase do trabalho, foi usado HOCl produzido quimicamente.
A soluo stock foi preparada a partir de NaOCl e o pH foi ajustado para 6,2 com
H
2
SO
4
0,5 M, usando um medidor de pH 3310, da Jenway.
Uma vez que o OCl
-
muito instvel e reactivo, a sua concentrao em soluo era
determinada diariamente, atravs de leituras espectrofotomtricas, a 235 nm, em gua
destilada (
235nm
= 100 M
-1
cm
-1
) (espectrofotmetro UV/Vis UV2, da Unicam).
Para estudar a capacidade de captao dos flavonides de HOCl produzido quimi-
camente, foram realizados dois mtodos: a oxidao do vermelho de Pirogalol (PGR) e a
clorao da taurina. Estes mtodos so ambos competitivos, ou seja, h uma competio
entre o flavonide e um substrato para o HOCl, avaliando-se a proteco conferida pelo
flavonide oxidao ou clorao desse substrato, por exposio ao HOCl (Lpez-Alarcn
e Lissi, 2005).
Neste ponto, foram estudados os flavonides quercetina, fisetina, naringenina, e
naringina.

3.1.1 Oxidao do PGR
Foi seguido o protocolo descrito por Balavoine e Geletii, 1999, com algumas alteraes. O
mtodo baseia-se na oxidao irreversvel do PGR pelo HOCl. O PGR um composto fen-
lico que apresenta uma colorao rosa, tendo, assim, um mximo de absoro aos 542 nm.
III Materiais e Mtodos

33


Figura 16. Estrutura do vermelho de pirogalol

Ao ser oxidado, o PGR perde a colorao, o que permite seguir a sua oxidao, espectrofo-
tometricamente, pela diminuio de absorvncia no referido comprimento de onda.
Este mtodo tem a vantagem de, para alm de ser econmico, ser rpido e simples
e a reaco ser seguida a 542 nm, no interferindo com a absoro dos flavonides, que se
situa entre 300 e 400 nm.
Preparou-se uma soluo stock de PGR 1 mg/mL em tampo de fosfatos 50 mM
(pH 7.4) e manteve-se a 4
o
C e ao abrigo da luz. Registou-se, nos dias da experincia, a con-
centrao exacta de PGR, a 542 nm, em tampo de fosfatos 50 mM (pH 7.4) (
542 nm
= 2.4
10
4
M
-1
. cm
-1
).
Foram feitas, previamente, duas curvas de calibrao, com concentraes crescen-
tes de PGR (0 40 M) e para os dois volumes finais na microplaca (Orange Scientific),
resultantes no procedimento adoptado (200 L e 220 L). Atravs do declive da recta
obtida no grfico da Abs
542 nm
em funo da concentrao de PGR reduzido, foi possvel
determinar o .l (produto da absortividade molar do PGR na forma reduzida pelo percurso
ptico da mistura reaccional no poo da microplaca) para ambos os volumes finais. Reali-
zou-se, tambm, um controlo, onde se observou que, durante a realizao do ensaio, no
ocorria oxidao espontnea do PGR.
Os ensaios foram realizados em tampo fosfatos 50 mM (pH 7,4), com PGR 30 M,
concentraes crescentes de flavonide (0 37,5 M) e HOCl 100 M. As concentraes
dos flavonides fisetina, naringenina e naringina foram aumentadas para 90 M, 50 M e
150 M, respectivamente, de modo a ser possvel uma anlise completa dos seus compor-
tamentos.
Eram realizadas duas leituras espectrofotomtricas, a 542 nm, uma anterior e
outra posterior adio de HOCl e incubao de 1 hora (leitor Sunrise Tecan, com soft-
ware Rdole Shell).
III Materiais e Mtodos

34

A partir de cada valor de absorvncia, foi calculado o valor de concentrao de PGR
reduzido correspondente, que depois foi convertido em percentagem de oxidao do PGR,
de acordo com a equao 13.

Equao 13 100 x
] PGR [ ] PGR [
] PGR [ [PGR]
(%) PGR Oxidao
HOCl
HOCl F F

=
+


Para cada concentrao de flavonide, foi feita a razo entre as variaes da concentrao
de PGR reduzido na presena e ausncia do flavonide, sendo estas variaes as diferen-
as entre a concentrao de PGR na ausncia e presena de HOCl. Assim, temos [PGR]
F
,
[PGR]
F+HOCl
, como a concentrao de PGR reduzido na presena de flavonide, na ausncia
e presena de HOCl, respectivamente, e [PGR] e [PGR]
HOCl
, como a concentrao de PGR
reduzido na ausncia de flavonide, na ausncia e presena de HOCl, respectivamente.
Os valores de percentagem de oxidao do PGR foram representados graficamen-
te, em relao concentrao de flavonide, e foi feito o ajuste de uma equao aos pon-
tos obtidos. A equao referente ao ajuste efectuado foi usada para calcular o valor de
IC
50
, ou seja, a concentrao de flavonide necessria para que se observasse uma redu-
o de 50% na oxidao do PGR.

3.1.2 Clorao da Taurina
Foi seguido o protocolo descrito por Dypbukt (2005). O mtodo consiste na clorao da
taurina pelo cido hipocloroso, o que origina clorotaurina, uma cloramina estvel. Na pre-
sena do io iodeto, a clorotaurina oxida a 3,3,5,5-tetrametilbenzidina (TMB), que adqui-
re uma colorao azul, permitindo seguir a sua formao espectrofometricamente, pelo
aumento de absorvncia a 655 nm.

Figura 17. Estrutura da taurina

Uma vez que a formao de clorotaurina ocorre in vivo, este ensaio pode ser con-
siderado mais fisiolgico que a oxidao do PGR.
Este ensaio foi realizado em PBS [tampo fosfatos 10 mM (pH 7,4), contendo NaCl
140 mM e KCl 10mM] com taurina 5 mM, qual era adicionado o HOCl. Aps 5 minutos de
III Materiais e Mtodos

35

incubao, era adicionado o reagente revelador [TMB 2 mM, DMF 30 % (v/v) e KI 100 M
em tampo acetato 400 mM (pH 4,5)] e aps uma incubao de 5 minutos, era feita a lei-
tura a 655 mn (leitor Sunrise Tecan, com software Rdole Shell).
Inicialmente, foi feita uma curva de calibrao, em que foram usadas concentra-
es crescentes de HOCl (0 80 M) e foi traado um grfico da Abs
655 nm
em funo da
concentrao de clorotaurina (ou TMB oxidada). Cada concentrao de cido pode ser
igualada a uma concentrao de clorotaurina e TMB oxidada, uma vez que a taurina estava
em excesso; desta forma todo o HOCl origina clorotaurina, que, na sua totalidade, oxida
TMB. Atravs do declive da recta obtida, foi possvel determinar o .l (produto da absorti-
vidade molar da TMB na forma oxidada pelo percurso ptico da mistura reaccional no
poo da microplaca).
Nos ensaios de captao do HOCl, eram adicionados, taurina, o flavonide (0 37
M) e o HOCl 50 M. Posteriormente, a concentrao de naringina teve de ser aumentada
at 100 M de modo a ser possvel uma anlise correcta do seu comportamento.
A partir dos valores de absorvncia a 655 nm, foi calculado o valor correspondente
de concentrao de clorotaurina e depois foi determinada a percentagem de inibio da
clorao, para cada concentrao de flavonide. A percentagem foi calculada consideran-
do-se o mximo (100%) a concentrao de clorotaurina formada na ausncia de flavoni-
de. Relacionando a percentagem de clorao da taurina com a concentrao de flavonide
correspondente, e encontrando a equao que mais se ajustasse aos valores obtidos, foi
possvel determinar o IC
50
concentrao de flavonide necessria para a diminuio da
clorao da taurina em 50%.


3.2 Captao de HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo
De seguida, foi estudado o poder de captao de cido hipocloroso produzido por neutr-
filos isolados do sangue, activados ex-vivo por PMA. Como referido na seco 1.1.1 da
Introduo, a NADPH oxidase, que leva formao dos ROS, activada pela PKC, que, por
sua vez, pode ser activada por steres de forbol, como o PMA.
de referir que o procedimento utilizado na obteno dos neutrfilos no permite
isolar estas clulas dos restantes leuccitos. No entanto, dos leuccitos totais, apenas os
neutrfilos, moncitos e eosinfilos so clulas fagocticas e, logo, apenas estas tm a
capacidade de produzir HOCl. Como em indivduos saudveis os moncitos e eosinfilos
III Materiais e Mtodos

36

representam um mximo de 9% dos leuccitos totais, considerou-se o mtodo que em
seguida se descreve apropriado para a obteno dos neutrfilos.

3.2.1 Isolamento dos leuccitos
O isolamento dos leuccitos foi realizado seguindo o protocolo descrito por Coelho (2004).
O sangue era recolhido de dadores saudveis para tubos estreis com anticoagulante
(K
3
EDTA) (Vacutest). Era adicionada ao sangue uma soluo de dextrano a 6% (m/v) com
NaCl 154 mM e tampo fosfatos 10 mM (pH 7,4), na proporo de 5:1 (v:v). Os eritrcitos
sedimentam no dextrano, permitindo obter um sobrenadante com os restantes constituin-
tes do sangue. Aps uma incubao de 90 minutos, este sobrenadante era recolhido e
misturado com NH
4
Cl 0,87% (m/v), na proporo de 1:2 (v:v), de modo a lisar os eritrcitos
ainda presentes em soluo. Aps uma incubao de 5 minutos, era feita uma centrifuga-
o a 250 g (centrfuga Rotofix 32, da Hettich), durante 5 minutos. Em seguida, eram feitas
trs centrifugaes iguais anterior, em tampo KRS [Soluo Krebs-Ringer [NaCl 122 mM,
KCl 4,89 mM, MgSO
4
1,22 mM e D-glucose monohidratada 1 mg/mL em tampo fosfatos
16 mM, (pH 7,4)] suplementada com EDTA 0,03% (m/v)] para a lavagem dos leuccitos e
para os separar das plaquetas. No final deste passo, as clulas eram ressuspendidas em
tampo KRC (Soluo Krebs-Ringer suplementada com CaCl
2
0,6 mM). Em seguida, proce-
dia-se contagem das clulas e avaliao da sua viabilidade, com azul de tripano 0,05%
(v/v) em D-PBS. Consideravam-se no viveis as clulas coradas de azul e que, ao mesmo
tempo, tivessem aparncia unidimensional. Os leuccitos isolados eram mantidos em gelo
durante toda a manipulao, a qual no excedia 3 horas e 30 minutos aps o isolamento.

3.2.2 Clorao da taurina
Foi seguido o protocolo descrito por Dypbukt (2005). As clulas (2 x 10
6
clulas/mL) eram
incubadas durante 30 minutos, em tampo KRC e a 37
o
C, na presena de taurina 5 mM,
flavonide (0 20 M) e PMA 100 ng/mL (em microplacas Orange Scientific). A concentra-
o de naringina teve de ser, novamente, aumentada para 40 M para se fazer uma anli-
se correcta do seu comportamento. Era adicionada catalase 20 g/ml mistura, para parar
a reaco de formao de HOCl (ver equao 6), e esta era colocada em gelo durante 10
minutos. Em seguida, era feita uma centrifugao a 14000 g (centrfuga Minispin, da
Eppendorf), durante 5 minutos, de modo a precipitar as clulas. O sobrenadante resultan-
te era retirado e adicionado a reagente revelador [TMB 2 mM, DMF 30 % (v/v) e KI 100 M
III Materiais e Mtodos

37

em tampo acetato 400 mM (pH 4,5)]. Aps uma incubao de 5 minutos, era medida a
absorvncia a 655 nm (leitor Sunrise Tecan, com software Rdole Shell).
A partir dos valores de absorvncia a 655 nm, e usando a curva de calibrao feita
anteriormente (seco 3.1.2 deste captulo), foi calculado o valor da concentrao de clo-
rotaurina, que foi convertido em percentagem de clorao da taurina, para cada concen-
trao de flavonide. Em seguida foi feito o ajuste de uma equao aos pontos obtidos, a
partir da qual se calculou o IC
50
.
Neste ponto, foram estudados os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e
naringina.

3.2.3 Oxidao da sonda APF
A APF uma sonda fluorescente que, na presena de espcies reactivas de oxignio com
poder oxidante suficiente para hidrolisar directamente anis aromticos (hROS), como o
OCl
-
e o OH

, forma fluorescena, originando um aumento de rendimento quntico de fluo-


rescncia (
fl
) de 0,008 para 0,85. Outra caracterstica importante desta sonda a sua
grande resistncia a autoxidao.

Figura 18. Esquema da reaco da sonda APF com hROS. Na presena de hROS (highly reactive oxigen species),
como OCl
-
e o OH

, a APF (
fl
= 0,008) sofre uma desarilao, formando fluorescena (
fl
= 0,85), onde
fl
representa
o rendimento quntico de fluorescncia.

A reaco da sonda com hROS pode ser seguida, usando um comprimento de onda de
excitao de 490 nm e de emisso de 530 nm, observando-se um grande aumento de fluo-
rescncia. Este aumento de fluorescncia trs vezes maior na presena de OCl
-
do que na
presena de OH

, e atendendo ao facto de que os neutrfilos produzem HOCl em maior


quantidade do que OH

, considera-se que a fluorescncia referente ao radical pode ser


desprezada (Halliwell, 1999 e Setsukinai, 2003). Assim, este mtodo extremamente sens-
vel adequado ao estudo da produo de HOCl pelos neutrfilos. Outra das vantagens
III Materiais e Mtodos

38

deste mtodo possibilitar o estudo cintico da formao de HOCl, isto , observar a pro-
duo de HOCl medida que este produzido pelos neutrfilos activados.
Este mtodo foi usado em duas tcnicas, espectrofluorimetria e citometria de flu-
xo. Em ambas, foram estudados os flavonides quercetina, fisetina e naringenina.

3.2.2.1 Deteco da oxidao da APF por espectrofluorimetria
Foi seguido o protocolo descrito por Setsukinai (2003), com algumas alteraes.
As clulas (0,5 x 10
6
clulas/mL) eram incubadas com a sonda APF (2,5 M), em
tampo KRC, durante 15 minutos (em microplacas de fluorescncia BD Falcon). Aps a
incubao, eram adicionados o flavonide (0 7 M) e o PMA (100 ng/mL) e era feita a
leitura da fluorescncia, a cada 7 segundos, durante 15 minutos e a 37
o
C (leitor Spectra
Max Gemini EM com software SoftMax Pro 4.7.1).
Do grfico obtido, era determinado o declive, na regio mais linear, que corres-
pondia velocidade de formao de fluorescena. Para cada concentrao de flavonide,
era feita a razo entre a velocidade de formao de fluorescena na presena e ausncia
de flavonide. Esta razo era convertida em percentagem de formao de fluorescena,
sendo o mximo obtido na ausncia de flavonide. Em seguida, era traado um grfico da
percentagem de formao de fluorescena em funo da concentrao de flavonide e
feito o ajuste de uma equao aos pontos, a partir da qual se calculava o valor de IC
50

concentrao de flavonide para o qual de obtm 50% de inibio da oxidao da APF.

3.2.2.2 Deteco da oxidao da APF por citometria de fluxo
A citometria de fluxo uma tcnica que permite a medio e anlise de mltiplas caracte-
rsticas fsicas de cada clula, individualmente, medida que estas se deslocam atravs de
um feixe de luz. Entre as caractersticas passveis de serem analisadas, esto o tamanho, a
granulosidade ou complexidade interna e a intensidade de fluorescncia. O tamanho
inversamente proporcional disperso frontal de luz (FS) e a granulosidade directamen-
te proporcional disperso lateral de luz (SS), como mostra a figura 19 (OConnor et al,
2001).
III Materiais e Mtodos

39


Figura 19. Propriedades de disperso de luz de uma clula. Medio do tamanho e granulosidade de uma clula
por citometria. 1 Feixe de luz; 2 Detector de disperso frontal de luz (FS); 3 - Detector de disperso lateral de luz
(SS).

Depois de medidos estes parmetros, traado um grfico que os relaciona. Como dife-
rentes clulas tm tamanhos e granulosidades diferentes, cada populao de clulas surge
em regies especficas, como se exemplifica na figura 20, em que leuccitos so separados
num grfico de FS em funo de SS.


Figura 20. Subpopulaes de leuccitos num grfico FS vs SS. A separao dos leuccitos com base no tamanho e
granulosidade permite a identificao das populaes: A linfcitos, B moncitos, C granulcitos (neutrfilos,
eosinfilos e basfilos).

Seleccionando-se zonas especficas do grfico, podem-se obter as medidas subsequentes
(como por exemplo, a intensidade de fluorescncia) apenas para a subpopulao de clu-
las que se pretende estudar (OConnor et al, 2001).

Na realizao dos ensaios, as clulas (0,5 x 10
6
clulas/ml) eram incubadas com a sonda
APF (2,5 M), em tampo KRC, durante 15 minutos. Era adicionado o flavonide (0 5
M) e a incubao prosseguia mais 5 minutos. Durante esta incubao, era feita uma leitu-
ra inicial, de modo a analisar a fluorescncia basal. Findos os 5 minutos, era adicionado o
III Materiais e Mtodos

40

PMA (100 ng/mL) e iniciadas imediatamente as leituras, de 5 em 5 minutos, durante cerca
de 20 minutos e mantendo-se as clulas sempre a 37
o
C. Todas as leituras foram realizadas
com a durao de 4000 eventos (ou seja, anlise de 4000 clulas) e para a regio do grfi-
co FS versus SS (figura 19) referente aos granulcitos (citmetro Coulter Epics XL, da
Beckman, com software System II).
Os resultados eram obtidos em termos de valores de fluorescncia de cada clula
analisada, ao longo do tempo. Calculando uma mdia de fluorescncia, para cada leitura
de 4000 eventos, convertendo os valores para percentagem de formao de fluorescena e
fazendo o ajuste de uma equao aos pontos, foi possvel determinar, para cada composto
estudado, a concentrao de flavonide necessria para reduzir em 50% a formao de
fluorescena IC
50
.


III Materiais e Mtodos

41

4 Inibio da activao do factor de transcrio NF-B
Estudou-se, em seguida, o efeito dos flavonides em intermedirios inflamatrios. Foi
escolhido o factor de transcrio NF-B, dada a sua importncia em doenas inflamatrias
e no cancro. Os estudos foram baseados no trabalho descrito por Takashiba et al, 1999.
Neste ponto, foram estudados os flavonides quercetina, fisetina e naringenina.

4.1 Linha Celular THP-1
Nesta parte do trabalho, foi utilizada uma linha celular de leucemia monoctica aguda de
humanos THP-1. Para induzir o estado de inflamao nestas clulas, era adicionado LPS,
um componente da parede celular de bactrias gram negativas (ver Introduo, seco
1.1.2).
Numa primeira fase, foi analisada a citotoxicidade dos flavonides, de modo a
determinar a concentrao dos mesmos que se podia utilizar nos ensaios, sem que fosse
afectada a viabilidade celular. Neste ponto, foi utilizado o ensaio com alamarBlue.
De seguida, foi testado o tempo de incubao das clulas com LPS, de modo a
determinar qual destes permitia obter uma resposta mxima por parte das clulas, em
termos de activao de NF-B. Para a avaliao dos nveis proteicos de p65 e IB, foi usada
a tcnica de Western Blot.
Finalmente, foram realizados os ensaios em que se pretendia avaliar o efeito dos
flavonides na activao do NF-B. Tambm neste ponto se recorreu a Western Blot para
quantificar o efeito dos compostos nos nveis de p65 e IB.

4.1.1 Citotoxicidade dos flavonides
Inicialmente, foram feitos ensaios de toxicidade celular com concentraes crescentes de
flavonide, a fim de determinar qual a concentrao a usar nos ensaios. Foram estudadas
concentraes crescentes dos flavonides: 0, 5, 10 e 20 M. Para a quercetina estudou-se
ainda a concentrao de 15 M. Era tambm adicionado LPS 100 ng/mL, a fim de replicar
as condies do ensaio. As clulas eram incubadas durante 16 horas com as concentraes
de flavonide a estudar, na estufa, a 37
o
C e 5% CO
2
. Foi tambm realizado um branco,
para cada concentrao de flavonide, ao qual no eram adicionadas clulas. Aps a incu-
bao, iniciava-se o ensaio com alamarBlue, um mtodo rpido, simples, sensvel, preci-
so e no txico para as clulas.
III Materiais e Mtodos

42

O alamarBlue um corante usado para a avaliao da proliferao celular e cito-
toxicidade de compostos. Na sua forma oxidada, o alamarBlue consiste em resazurina,
que apresenta uma cor azul e no fluorescente. Ao ser reduzido, convertido a resorufina,
um composto cor-de-rosa e fluorescente. (OBrien et al, 2000)


Figura 21. Esquema da converso resazurina a resorufina. A resazurina, no fluorescente, convertida em resoru-
fina, muito fluorescente, ao ser reduzida.

A reduo do alamarBlue ocorre no interior das clulas, talvez devido aco de reduta-
ses como a NADH desidrogenase, e de uma forma proporcional ao nmero de clulas,
sendo a forma reduzida excretada para o exterior da clula, onde se acumula durante
vrias horas. (OBrien et al, 2000)
Aps o perodo de incubao com o composto do qual se pretendia avaliar a cito-
toxicidade, era adicionado alamarBlue 1/10 (v/v). Em seguida eram feitas leituras de
fluorescncia, usando comprimento de onda de excitao de 550 nm e de emisso de 600
nm, aos tempos t = 0, t = 1, t = 2 e t = 3 horas, contadas depois da adio do alamarBlue.
Entre as leituras, as clulas eram mantidas na estufa, a 37
o
C e 5% CO
2
.
Os ensaios foram realizados em microplacas de fluorescncia BD Falcon, tendo-se
usado um leitor Spectra Max Gemini EM com software SoftMax Pro 4.7.1 para a realizao
das leituras.
Depois de realizadas as leituras, era traado um grfico da fluorescncia ao longo
do tempo, para cada concentrao de flavonide. Como a fluorescncia gerada de uma
forma proporcional ao nmero de clulas, a comparao entre os grficos na ausncia e
presena de flavonide permite determinar se este txico e, se for, a partir de que con-
centrao.

4.1.2 Escolha do tempo de incubao com LPS
Em seguida foram estudados vrios tempos de incubao das clulas com LPS, a fim de
determinar qual o tempo a que correspondia um mximo de activao da via do NF-B.
Como est descrito na seco 1.5 da Introduo, quando o NF-B activado pela via clssi-
III Materiais e Mtodos

43

ca, ocorre a degradao das protenas IB, que assim libertam o p65, dando-se a translo-
cao deste do citoplasma para o ncleo. Assim, uma resposta maximizada traduz-se num
mximo de p65 no ncleo e num mnimo de p65 e de IB no citoplasma.

4.1.2.1 Realizao do ensaio
Os ensaios foram realizados com 1 x 10
6
clulas/mL, v
f
= 5 mL, com [LPS] = 10 g/mL.
Foram estudados quatro tempos de incubao, 30 minutos e 1, 2 e 5 horas, que decorriam
na estufa de CO
2
. Para cada tempo de incubao, foi feito um controlo, em que no era
adicionado LPS.

4.1.2.2 Preparao dos extractos celulares
Aps o perodo de incubao, era iniciado o procedimento de extraco das protenas
celulares, tendo-se adaptado o protocolo descrito por Abmayer e Workman (1990). Todo o
procedimento era efectuado mantendo-se as amostras em gelo. O volume total dos
ensaios era recolhido e centrifugado a 137 g (centrfuga Rotofix 32, da Hettich), durante 4
minutos, de modo a precipitar as clulas. O meio era desprezado e as clulas eram lavadas
duas vezes em PBS [Na
2
HPO
4
8 mM, KH
2
PO
4
1,5 mM, NaCl 137 mM, KCl 3 mM, (pH 7,4)],
repetindo-se a centrifugao anterior. De seguida, eram adicionados 300 L de soluo de
lise da membrana citoplasmtica [Hepes KOH 50 mM (pH 7,2), EDTA 2 mM, NaCl 10 mM e
sacarose 250 mM e suplementado no dia do ensaio com nonidet 0,1 % (v/v), DTT 2 mM e
os inibidores de proteases benzamidina 1,5 g/mL, leupeptina 10 g/mL, pepstatina 1
g/mL e PMSF 1 mM]. Aps se aguardar 10 minutos, eram recolhidas as protenas cito-
plasmticas, atravs de uma centrifugao a 3000 g (centrfuga 5804 R, da Eppendorf),
durante 4 minutos e a 4
o
C. Depois de se lavar o pellet obtido em PBS, eram adicionados 30
L da soluo de lise da membrana nuclear [Hepes KOH 50 mM (pH 7,2), EDTA 2 mM, NaCl
400 mM e glicerol 20% (v/v) e suplementado no dia do ensaio com DTT 2 mM e os inibido-
res de proteases benzamidina 1,5 g/mL, leupeptina 10 g/mL, pepstatina 1 g/mL e
PMSF 1 mM]. Eram aguardados 30 minutos, agitando as amostras no vrtex esporadica-
mente, para garantir a lise completa. As protenas nucleares eram obtidas aps uma cen-
trifugao a 10000 g (centrfuga 5804 R, da Eppendorf), durante 10 minutos e a 4
o
C.
Recolhidas as protenas, procedia-se sua quantificao pelo mtodo de Bradford
modificado (Bradford, 1976). As amostras eram quantificadas em reagente de Bradford, na
razo 5:1000 (v:v), para as amostras citoplasmticas, e 2,5:1000 (v:v), para as amostras
III Materiais e Mtodos

44

nucleares. Era feita uma curva de calibrao com BSA (0 80 g/mL), de modo a determi-
nar o .l *produto da absortividade molar do complexo Brilliant Blue G, o corante do rea-
gente de Bradford, com protena pelo percurso ptico da mistura reaccional no poo da
microplaca (Orange Scientific)]. As leituras eram feitas a 595 nm, num leitor Sunrise Tecan,
com software Rdole Shell.

4.1.2.3 Preparao das protenas celulares
Em seguida, as protenas das amostras a estudar eram separadas por SDS-PAGE em gis de
poliacrilamida a 10% (m/v), recorrendo-se a um sistema de mini-gis (suporte da Bio-Rad).
O procedimento adoptado o descrito por Laemmli (1970). O gel de resoluo era consti-
tudo por acrilamida 10% (m/v), bisacrilamida 0,25% (m/v) e SDS 0,1% (m/v), em Tris-HCl
0,4 M (pH 8,8); foram usados, como agentes polimerizantes, TEMED 0,05% (v/v) e PSA
0,05% (m/v), este ltimo preparado no dia. O gel de concentrao era constitudo por acri-
lamida 5% (m/v), bisacrilamida 0,14% (m/v) e SDS 0,1% (m/v) em Tris-HCl 0,6 M (pH 6,8);
utilizaram-se como agentes polimerizantes TEMED 0,1% (v/v) e PSA 0,1% (m/v). Eram apli-
cados 20 g de protena em cada poo, em soluo de amostra [SDS 5% (m/v), glicerol 25%
(v/v), azul de bromofenol 0,01% (m/v) e -mercaptoetanol 25% (v/v), em Tris 0,4 M, (pH
6,8)], na proporo de 4:1 (v:v), e previamente fervidas durante 5 minutos. A soluo de
electroforese usada era composta por Tris 25 mM, glicina 192 mM (pH 8,3). A corrente
aplicada ao sistema de electroforese foi ajustada para 25 mA/gel (fonte Electrophoresis
Power Supply 601, da Amersham Pharmacia Biotech).
As protenas eram depois transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose
com 0,45 m de poro (Protran BA 85, da Whatman), atravs de um electroblotting em
condies semi-secas (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, da Bio-Rad). Foi seguido o
protocolo descrito por Bjerrum e Schafer-Nielse (1986). A soluo de transferncia era
composta por Tris 48 mM, glicina 39 mM, metanol 20% (v/v) e SDS 0,0375% (m/v) (pH 9,2).
A transferncia decorria durante 1 hora, com uma intensidade de corrente ajustada a 5,5
mA/cm
2
de gel (fonte Electrophoresis Power Supply 601, da Amersham Pharmacia Bio-
tech).

4.1.2.4 Anlise das protenas celulares
Em seguida, iniciava-se o procedimento de immunoblotting. As membranas de nitrocelulo-
se eram bloqueadas numa soluo de leite magro desnatado 5% (m/v) em PBS, com agita-
III Materiais e Mtodos

45

o, durante 1 hora. De seguida era feita a incubao com o anticorpo primrio anti-p65
(1:1000), anti-IB (1:800) e anti--actina (1:500), no caso das amostras citoplasmticas, e
anti-p65 (1:1000), no caso das amostras nucleares. A incubao era realizada numa cma-
ra hmida, durante 1 hora. O excesso de anticorpo era retirado atravs de lavagens com
Tween 0,1% (v/v) em PBS, sob agitao (duas lavagens de 10 minutos, seguidas de duas
lavagens de 5 minutos). Os vestgios de Tween eram retirados com duas passagens na
soluo de leite 5% (m/v) em PBS. Depois, era feita a incubao com o anticorpo secund-
rio anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rbano (1:4000), tambm em cmara
hmida e durante 1 hora. O excesso de anticorpo era retirado com lavagens com PBS
(duas lavagens de 10 minutos, seguidas de duas lavagens de 5 minutos). Em seguida, as
membranas eram incubadas com o kit ECL (Amersham), de acordo com as indicaes do
fabricante, e reveladas na cmara escura, em chapas autoradiogrficas (GE Healthcare).
As chapas obtidas eram analisadas com recurso ao programa Image J (Rasband,
1997), usado para a quantificao das bandas, tendo o controlo de loading sido feito pelas
bandas da protena -actina [protena com expresso constitutiva no citoplasma e no
alterada pelo tratamento com LPS (Sumbayev, 2008)], para as amostras citoplasmticas, e
atravs da colorao das membranas de nitrocelulose com Ponceau S, para as amostras
nucleares. O controlo de loading foi realizado determinado a relao entre as vrias ban-
das controlo (-actina e membrana de nitrocelulose), de modo a anular as diferenas nos
vrios poos, e multiplicando a relao calculada pela banda de ensaio correspondente.

4.1.3 Efeito dos flavonides na activao do NF-B
Depois de avaliados todos os parmetros, foi estudado o efeito dos flavonides na activa-
o do NF-B, pela variao dos nveis de p65 e de IB no citoplasma e de p65 no ncleo.

4.1.3.1 Realizao do ensaio
Foram adicionados, s clulas (1 x 10
6
/mL), os flavonides nas concentraes a estudar
(quercetina 10 e 15 M, fisetina 10 M e naringenina 20 M), fazendo-se dois controlos,
sem adio de flavonide. Aps 1 hora, era adicionado o LPS 100 ng/mL, a todos os
ensaios, com excepo de um dos controlos, completando o volume final de 5 mL. Era
depois feita uma incubao de 1 hora.

III Materiais e Mtodos

46

4.1.3.2 Preparao dos extractos celulares
Foi seguido o procedimento descrito na seco 4.1.2.2 deste captulo.

4.1.3.3 Preparao das protenas celulares
Foi seguido o procedimento descrito na seco 4.1.2.3 deste captulo.

4.1.3.4 Anlise das protenas celulares
Foi seguido o procedimento descrito na seco 4.1.2.4 deste captulo.


4.2 Clulas mononucleares do sangue perifrico - PBMC
De seguida, foram iniciados os estudos em clulas mononucleares isoladas do sangue, ou
PBMC. Foi apenas estudada a citotoxicidade dos flavonides nestas clulas, devido s limi-
taes inerentes ao procedimento. Os moncitos, como referido na Introduo, represen-
tam apenas 1 a 6% dos leuccitos em circulao, logo o seu isolamento apresenta um ren-
dimento extremamente baixo. De facto, apenas 13 % das PBMC obtidas so moncitos
(Repnik et al, 2003). Uma outra agravante a quantidade de protena necessria para os
ensaios de anlise da activao do NF-B. Desta forma, considerou-se que a utilizao des-
tas clulas, apesar de representar uma abordagem importante no que respeita com-
preenso do efeito dos flavonides in vivo, no era exequvel.

4.2.1 Isolamento das PBMC
Foi seguido o mtodo Ficoll/Percoll, descrito por Repnik et al, 2003, com algumas altera-
es.
Todo o procedimento de isolamento era efectuado sob condies estreis, na
cmara de fluxo laminar, utilizando-se material esterilizado. O sangue era recolhido de
dadores saudveis para tubos estreis com anticoagulante (K
3
EDTA) (Vacutest), sendo, de
seguida, diludo 1:1 (v:v) em D-PBS. A diluio resultante era adicionada a uma soluo de
Ficoll, na proporo 2:1 (v:v). A soluo resultante era centrifugada a 950 g, durante 15
minutos, obtendo-se a separao dos vrios constituintes do sangue e Ficoll em 4 camadas
distintas (plasma e plaquetas, PBMCs, Ficoll e eritrcitos). A camada correspondente aos
PBMCs era cuidadosamente retirada e lavada duas vezes em D-PBS + 2 % soro FBS, em
centrifugaes a 350 g, durante 7 minutos. No final das lavagens, as clulas eram ressus-
III Materiais e Mtodos

47

pendidas em D-PBS + 2 % soro FBS (v/v) e a suspenso obtida era adicionada a uma solu-
o iso-osmtica de Percoll [Percoll 41,5% (v/v) e NaCl 0,15 M], na proporo 1:3,5 (v:v),
de modo a retirar plaquetas restantes. Era feita uma centrifugao a 350 g, durante 25
minutos e as clulas eram depois lavadas em D-PBS + 2 % soro FBS, com uma centrifuga-
o a 350 g, durante 15 minutos. As clulas obtidas eram ressuspendidas em meio de cul-
tura [RPMI-1640, penincilina/estreptomicina 100 U/mL, piruvato de sdio 1 mM e soro
FBS 10 % (v/v)] e eram mantidas em gelo. A concentrao das clulas era determinada
atravs de contagem num hemacitmetro, com uma soluo de azul de tripano a 0,05 %
(m/v) em D-PBS, como o descrito para os leuccitos (ver seco 3.2.1).

4.2.2 Citotoxicidade dos flavonides
A avaliao da citotoxicidade dos flavonides nas PBMC foi realizada tal como o descrito
para as clulas THP-1 (seco 4.1.1). Foram testados os flavonides quercetina, fisetina e
naringenina, nas concentraes de 5, 10 e 20 M.










IV Apresentao dos Resultados
IV Apresentao dos Resultados
50

1 Estudo da captao, por flavonides, de HOCl produzido quimicamente
O estudo da captao de HOCl gerado quimicamente foi feito atravs de ensaios de com-
petio com base na oxidao do vermelho de pirogalol (PGR) e na clorao da taurina.
Estes ensaios qumicos permitem avaliar o poder de captao dos flavonides, exclusiva-
mente em relao ao HOCl e sem a interferncia de outros factores, tendo apenas como
base a estrutura dos compostos.

1.1 Oxidao do PGR
A capacidade antioxidante dos flavonides estudados (quercetina, fisetina, naringenina e
naringina) foi avaliada e comparada atravs da determinao dos seus valores de IC
50
, ou
seja, a concentrao de flavonide necessria para que haja 50% de inibio da oxidao
do PGR.
Estes ensaios foram realizados como o descrito na seco 3.1.1 dos Materiais e
Mtodos. Como foi referido, foram feitas, previamente, duas curvas de calibrao, de
modo a determinar o .l (produto da absortividade molar do PGR na forma reduzida pelo
percurso ptico da mistura reaccional no poo da microplaca) para ambos os volumes
finais na microplaca, durante o ensaio. Foram obtidos os valores
542 nm
. l = 11258 M
-1
(v
f
=
200 l) e
542 nm
. l = 12941 M
-1
(v
f
= 220 l).
Os resultados do estudo da capacidade antioxidante dos flavonides estudados,
em relao captao do HOCl produzido quimicamente, esto expressos em percenta-
gem de oxidao do PGR e apresentam-se na figura 22. Nesta figura apresenta-se, tam-
bm, as curvas resultantes do ajuste de uma equao sigmide aos valores experimentais,
atravs do software OriginPro.




IV Apresentao dos Resultados

51


0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
o

P
G
R

(
%
)
[Quercetina] (M)
0 15 30 45 60 75 90
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
o

P
G
R

(
%
)
[Fisetina] (M)

0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
o

P
G
R

(
%
)
[Naringenina] (M)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
o

P
G
R

(
%
)
[Naringina] ( M)

Figura 22. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na oxidao do PGR mediada
pelo HOCl produzido quimicamente representao grfica dos valores obtidos e das curvas resultantes do ajus-
te de uma equao sigmide aos valores experimentais. O ajuste foi feito atravs do software OriginPro. Os
ensaios foram realizados de acordo com o descrito na seco 3.1.1 dos Materiais e Mtodos. Os valores apresenta-
dos representam a mdia de quatro experincias independentes, realizadas em quadruplicado.

Recorrendo aos parmetros das equaes ajustadas, foi possvel determinar os respectivos
valores de IC
50
, apresentados no quadro 1.

Quadro 1. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e naringina no mtodo da
oxidao do PGR, mediada pelo HOCl produzido quimicamente. Valores calculados a partir da equao ajustada
aos pontos experimentais. desvio padro associado ao valor de IC
50
, calculado segundo o teorema de propaga-
o dos erros.






Flavonide IC
50
(M)
Quercetina 21,35 0,31
Fisetina 44,08 3,32
Naringenina 40,11 1,02
Naringina 88,5 17
IV Apresentao dos Resultados
52

Os resultados apresentados mostram claramente que a oxidao do PGR diminui com o
aumento da concentrao de flavonide, evidenciando o seu efeito protector. Pode-se
observar que a quercetina foi o flavonide mais eficiente na captao do HOCl (menor
valor de IC
50
) e o menos eficiente foi a naringina. Os flavonides fisetina e naringenina
apresentam um comportamento intermdio.

1.2 Clorao da Taurina
A reaco do HOCl com a taurina origina clorotaurina, uma cloramina estvel que pode ser
detectada por reaco com a TMB, originando um cromforo azul detectvel a 655 nm.
Uma vez que a formao de clorotaurina ocorre in vivo, este ensaio pode ser considerado
mais fisiolgico. Este mtodo foi efectuado como descrito na seco 3.1.2 dos Materiais e
Mtodos.
Como foi referido no captulo de Materiais e Mtodos, foi feita uma curva de cali-
brao, de modo a determinar o .l (produto da absortividade molar da TMB na forma
oxidada pelo percurso ptico da mistura reaccional no poo da microplaca), tendo sido
obtido o valor
655 nm
. l = 10600 M
-1
.
Os resultados do estudo da capacidade antioxidante dos flavonides estudados
(quercetina, fisetina, naringenina e naringina) em relao captao do HOCl, produzido
quimicamente, esto expressos graficamente em percentagem da clorao da taurina e
apresentam-se na figura 23. Nesta figura apresentam-se, tambm, as curvas resultantes
do ajuste de uma equao sigmide (para a quercetina) e exponencial (para a fisetina, a
naringenina e a naringina) aos valores experimentais, atravs do programa OriginPro.
IV Apresentao dos Resultados

53


0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Quercetina] (M)

0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Fisetina] (M)

0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Naringenina] (M)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Naringina] (M)

Figura 23. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na clorao da taurina, media-
da pelo HOCl produzido quimicamente representao grfica das curvas resultantes do ajuste de uma equao
sigmide ou exponencial aos valores experimentais. O ajuste foi feito atravs do software OriginPro. Os ensaios
foram realizados de acordo com o descrito na seco 3.1.2 dos Materiais e Mtodos Os valores apresentados repre-
sentam a mdia de quatro experincias independentes, realizadas em quadruplicado.

Recorrendo aos parmetros das equaes ajustadas, foi possvel determinar os res-
pectivos valores de IC
50
, apresentados no quadro 2.
Quadro 2. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e naringina no mtodo da
clorao da taurina, mediada pelo HOCl produzido quimicamente. Valores calculados a partir da equao ajustada
aos pontos experimentais. desvio padro associado ao valor de IC
50
, calculado segundo o teorema de propaga-
o dos erros.






Flavonide IC
50
(M)
Quercetina 5,46 0,28
Fisetina 12,3 1,57
Naringenina 24,1 1,83
Naringina 99 10,98
IV Apresentao dos Resultados
54

Pode observar-se o efeito protector dos flavonides em relao clorao da taurina, pois
esta diminui com o aumento da concentrao de flavonide. Os valores de IC
50
obtidos
para cada um dos flavonides estudados demonstram que a quercetina foi o flavonide
mais eficiente na captao do HOCl (menor valor de IC
50
), seguida da fisetina e da naringe-
nina e que o menos eficiente foi a naringina.


IV Apresentao dos Resultados

55

2 Estudo da captao, por flavonides, de HOCl produzido por neutrfilos acti-
vados quimicamente
O estudo da capacidade antioxidante dos flavonides tambm foi feito em relao ao HOCl
produzido por neutrfilos activados ex vivo com PMA. Esta abordagem apresenta a vanta-
gem de se estudarem os efeitos dos flavonides numa aproximao mais fisiolgica.
Como j foi referido no captulo de Materiais e Mtodos, as clulas resultantes do
procedimento de isolamento efectuado no so apenas neutrfilos, ainda que estes repre-
sentem no mnimo 85% dos fagcitos obtidos. Assim, apesar de ser referido doravante que
os resultados obtidos so resultantes da produo de HOCl pelos neutrfilos activados,
dever haver a contribuio de HOCl produzido por moncitos e por eosinfilos. Os resul-
tados obtidos em citometria so a excepo, uma vez que, nesta tcnica, so analisados
apenas os granulcitos. Assim, apenas os eosinfilos (1 a 3% dos leuccitos totais) podero
interferir com os resultados obtidos.
Este estudo foi feito utilizando mais uma vez dois ensaios de competio, a clora-
o da taurina e a oxidao da sonda fluorescente APF. A oxidao desta sonda foi detec-
tada por espectrofluorimetria e citometria de fluxo.
A clorao da taurina permite avaliar a captao de HOCl no exterior das clulas,
uma vez que apenas analisado o sobrenadante da mistura reaccional, ao contrrio do
mtodo da oxidao da sonda APF, em que analisado tambm o interior das clulas.
Assim, e como a sonda APF consegue entrar nas clulas, a utilizao de espectrofluorime-
tria, no mtodo da oxidao desta sonda, permite a medio da fluorescncia total (ou
seja, no interior e exterior das clulas). Por outro lado, e uma vez que a citometria analisa
clula a clula, os resultados fornecidos por esta tcnica so apenas referentes fluores-
cncia no interior das clulas. Desta forma, os mtodos usados complementam-se e a an-
lise conjunta dos resultados permite avaliar a capacidade intrnseca dos flavonides para
captarem HOCl e, tambm, analisar os efeitos resultantes da sua interaco com a mem-
brana das clulas.
Para a realizao destes ensaios eram isolados neutrfilos a partir do sangue de
indivduos saudveis, seguindo o protocolo descrito na seco 3.2.1 dos Materiais e Mto-
dos.
IV Apresentao dos Resultados
56

2.1 Clorao da Taurina
Para quantificar a clorao da taurina, utilizou-se a curva de calibrao para o HOCl produ-
zido quimicamente, como descrito na seco 3.2.2 dos Materiais e Mtodos.
Os resultados do estudo da capacidade antioxidante dos flavonides estudados em
relao captao do HOCl, produzido por neutrfilos activados ex vivo com PMA esto
expressos em percentagem da clorao da taurina, na figura 24. Nesta figura, apresentam-
se, tambm, as curvas resultantes dos ajustes de uma equao exponencial (para a quer-
cetina, naringenina e naringina) e de uma equao linear (para a fisetina) aos valores
experimentais, atravs do programa OriginPro.
0 2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Quercetina] (M)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Fisetina] (M)

0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Naringenina] (M)
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
C
l
o
r
a

o

d
a

t
a
u
r
i
n
a

(
%
)
[Naringina] (M)

Figura 24. Efeito da concentrao de quercetina, fisetina, naringenina e naringina na clorao da taurina, media-
da pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA - representao grfica das curvas resultantes
do ajuste de uma equao exponencial ou linear aos valores experimentais. O ajuste foi feito atravs do software
OriginPro. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na seco 3.2.2 dos Materiais e Mtodos Os valo-
res apresentados representam a mdia de cinco experincias independentes, realizadas em duplicado.

IV Apresentao dos Resultados

57

A partir das equaes ajustadas aos pontos, calcularam-se os respectivos valores de IC
50

para cada flavonide (quadro 3).

Quadro 3. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina, naringenina e naringina no mtodo da
clorao da taurina, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA. Valores calculados a
partir da equao ajustada aos pontos experimentais. desvio padro associado ao valor de IC
50
, calculado
segundo o teorema de propagao dos erros.






Os resultados obtidos mostram, claramente, um efeito protector dos flavonides em
relao clorao da taurina, uma vez que h uma diminuio da clorao com o aumento
da concentrao de flavonide. Analisando os valores de IC
50
obtidos para cada um dos
flavonides, observa-se que a quercetina e naringenina (menor valor de IC
50
) foram os
flavonides mais eficientes logo seguidos da fisetina e da naringina.

2.2 Oxidao da sonda APF
O facto da sonda APF fluorescer quando oxidada e de poder, neste caso, ser considerada
especfica para o HOCl, tornam este mtodo extremamente sensvel e adequado ao estudo
da produo de HOCl pelos neutrfilos. Outra das vantagens deste mtodo possibilitar o
estudo cintico da formao de HOCl, isto , observar a produo de HOCl medida que
este produzido pelos neutrfilos activados. A oxidao APF foi seguida por espectrofluo-
rimetria e por citometria de fluxo.

2.2.1 Deteco da oxidao da sonda APF por espectrofluorimetria
Como j foi referido, esta tcnica permite a deteco da fluorescncia total emitida pelas
clulas, ou seja, a fluorescncia no interior e no exterior das mesmas.
Este ponto do trabalho foi realizado como descrito na seco 3.2.2.1 dos Materiais
e Mtodos. Os valores de fluorescncia ao longo do tempo, obtidos para os flavonides
estudados (quercetina, fisetina e naringenina), encontram-se na figura 25.
Flavonide IC
50
(M)
Quercetina 3,78 1,09
Fisetina 7,13 0,52
Naringenina 3,81 0,46
Naringina 9,51 1,48
IV Apresentao dos Resultados
58

0 150 300 450 600 750 900
50
100
150
200
250
300
350
400
450
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (s)
0 150 300 450 600 750 900
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (s)

0 150 300 450 600 750 900
0
100
200
300
400
500
600
700
800
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (s)


Pode observar-se que, para todos os flavonides estudados, medida que a concentrao
deste aumentava, o valor da fluorescncia emitido pela sonda ao longo do tempo era cada
vez menor.
A capacidade antioxidante de cada concentrao de flavonide foi avaliada atravs
da determinao dos declives na zona linear das curvas apresentadas nos grficos da figu-
ra anterior. Deste modo, calcularam-se os valores de percentagem de oxidao da sonda
APF em funo da concentrao de flavonide, que se apresentam na figura 26. Nesta
figura apresentam-se, tambm, as curvas resultantes do ajuste de uma equao exponen-
cial aos valores experimentais, atravs do programa OriginPro.
Figura 25. Oxidao da sonda APF ao longo do
tempo, detectada por espectrofluorimetria,
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA, na presena de quer-
cetina (A), fisetina (B) e naringenina (C). Efeito
das vrias concentraes de flavonide estudadas
(0 - ; 0,4 M - ; 0,5 M - ; 1 M - ; 2 M -
; 5 M - ; 7 M - ) na fluorescncia emitida
pelas clulas. Os ensaios foram realizados de
acordo com o descrito na seco 3.2.2.1 dos
Materiais e Mtodos. Os grficos apresentados
representam uma experincia representativa de
um conjunto de trs experincias independentes.

A
B
C
IV Apresentao dos Resultados

59


0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Quercetina] (M)
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Fisetina] (M)


0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Naringenina] (M)


No quadro 4, esto apresentados os valores de IC
50
para cada flavonide, calculados a par-
tir das equaes das curvas ajustadas aos pontos.

Quadro 4. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina e naringenina no mtodo da clorao
da oxidao da sonda APF, detectada por espectrofluorimetria, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA. Valores calculados a partir da equao ajustada aos pontos experimentais. desvio
padro associado ao valor de IC
50
, calculado segundo o teorema de propagao dos erros.






Pode observar-se o efeito protector dos flavonides, pela diminuio da oxidao
da sonda com o aumento de concentrao de flavonide, expresso nos grficos de fluores-
cncia ao longo do tempo. Os valores de IC
50
obtidos para cada um dos flavonides
Flavonide IC
50
(M)
Quercetina 0,21 0,03
Fisetina 3,65 1,57
Naringenina 1,99 0,19
Figura 26. Efeito da concentrao de querceti-
na, fisetina e naringenina na oxidao da sonda
APF, detectada por espectrofluorimetria,
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA representao
grfica da curva resultante do ajuste de uma
equao exponencial aos valores experimen-
tais. O ajuste foi feito atravs do software Ori-
ginPro. Os ensaios foram realizados de acordo
com o descrito na seco 3.2.2.1 dos Materiais e
Mtodos. Os valores apresentados representam
a mdia de quatro experincias independentes,
realizadas em duplicado.

IV Apresentao dos Resultados
60

demonstram que a quercetina muito eficiente na captao de HOCl, seguida da naringe-
nina e da fisetina.

2.2.2 Deteco da oxidao da sonda APF por citometria de fluxo
Como j foi referido, a citometria de fluxo permite a separao das clulas com base nas
suas caractersticas como tamanho e granulosidade. Assim, nestes ensaios, descritos na
seco 3.2.2.2 dos Materiais e Mtodos, foram analisados apenas os granulcitos.
Apresentam-se, primeiramente, os grficos que mostram a distribuio dos valores
de fluorescncia emitidos pelas clulas analisadas, obtidos na ausncia e presena da con-
centrao mxima dos flavonides estudada, ao longo do tempo da experincia, nas figu-
ras 27 (quercetina), 28 (fisetina) e 29 (naringenina).


Figura 27. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo e
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA, nas clulas analisadas nas leituras efec-
tuadas com quercetina 0 (A) e 5 M (B). A leitura inicial efectuada na ausncia de PMA, a fim de detectar a fluo-
rescncia basal. A leitura no tempo 0 (t=0) a primeira leitura efectuada depois da adio de PMA, tendo-se reali-
zado as leituras seguintes, de 5 em 5 minutos, com durao de 4000 eventos, como descrito na seco 3.2.2.2 dos
Materiais e Mtodos. Os grficos apresentados foram realizados com os resultados de uma experiencia representa-
tiva de um conjunto de quatro experiencias independentes.

possvel observar que, em ambos os casos, aps a adio de PMA se denota um ligeiro
aumento de fluorescncia, consistente com uma iniciao na activao dos neutrfilos,
B
A
IV Apresentao dos Resultados

61

que leva produo de HOCl, que, por sua vez, oxidada a sonda APF. possvel acompa-
nhar a activao progressiva da populao de clulas. A partir do tempo 5 (t=5 min) obser-
va-se a presena de dois picos distintos, referentes ao conjunto de clulas activadas e no
activadas. Com o passar do tempo, a quantidade de clulas no activadas (sem fluorescn-
cia) diminui, aumentando a quantidade de clulas activadas. A comparao dos dois grfi-
cos permite concluir que a presena de quercetina leva diminuio de fluorescncia. Por
exemplo, aos tempos 10 e 15 (t=10 e t=15 minutos) passa a estar presente um pico na
regio de baixa fluorescncia, que no existiam na ausncia de flavonide. Tambm o
mximo de fluorescncia obtido diminui, de aproximadamente 50 para 20 unidades.




Figura 28. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo e
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA, nas clulas analisadas nas leituras efec-
tuadas com fisetina 0 (A) e 2,5 M (B). A leitura inicial efectuada na ausncia de PMA, a fim de detectar a fluores-
cncia basal. A leitura no tempo 0 (t=0) a primeira leitura efectuada depois da adio de PMA, tendo-se realizado
as leituras seguintes, de 5 em 5 minutos, com durao de 4000 eventos, como descrito na seco 3.2.2.2 dos Mate-
riais e Mtodos. Os grficos apresentados foram realizados com os resultados de uma experiencia representativa de
um conjunto de quatro experiencias independentes.

possvel observar, tambm no caso dos ensaios realizados com fisetina, a activa-
o progressiva da populao de clulas, aps a adio de PMA. A partir do tempo 5 (t=5
B
A
IV Apresentao dos Resultados
62

min) observa-se a presena de dois picos distintos, referentes aos conjuntos de clulas
activadas e no activadas. Com o decorrer do tempo, a quantidade de clulas no activa-
das (sem fluorescncia) diminui, aumentando a quantidade de clulas activadas. A compa-
rao dos dois grficos permite concluir que a presena de fisetina leva diminuio de
fluorescncia. Os picos na regio de baixa fluorescncia, para os trs tempos (t=5, t=10 e
t=15 minutos), aumentam na presena de flavonide, comparativamente aos valores de
clulas obtidos na leitura de fluorescncia basal. Tambm o mximo de fluorescncia obti-
do diminui, de aproximadamente 40 unidades para 20.



Figura 29. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo e
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA, nas clulas analisadas nas leituras efec-
tuadas com naringenina 0 (A) e 5 M (B). A leitura inicial efectuada na ausncia de PMA, a fim de detectar a
fluorescncia basal. A leitura no tempo 0 (t=0) a primeira leitura efectuada depois da adio de PMA, seguindo-se
as leituras seguintes, de 5 em 5 minutos, com durao de 4000 eventos, como descrito na seco 3.2.2.2 dos Mate-
riais e Mtodos. Os grficos apresentados foram realizados com os resultados de uma experiencia representativa de
um conjunto de quatro experiencias independentes.

Mais uma vez, possvel observar que, em ambos os casos, se denota um aumento
crescente de fluorescncia, aps a adio de PMA, resultante da activao progressiva da
populao de clulas. A comparao dos dois grficos permite concluir que a naringenina
leva diminuio de fluorescncia, notando-se uma deslocao dos picos referentes aos
B
A
IV Apresentao dos Resultados

63

tempos 10 e 15 (t=10 e t=15 minutos), passando os valores mximos de 30 e 60 unidades
de fluorescncia para 20 e 30, respectivamente.

Apresenta-se de seguida, a distribuio de fluorescncia nas clulas analisadas, na presen-
a das vrias concentraes de flavonide usadas (Figura 30), valores referentes ltima
leitura realizada em cada ensaio.



Figura 30. Distribuio da fluorescncia resultante da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo e
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos activados ex vivo por PMA, nas clulas analisadas na ltima leitura
efectuada para as vrias concentraes de quercetina, fisetina e naringenina estudadas. A leitura inicial efec-
tuada na ausncia de PMA, a fim de detectar a fluorescncia basal. Os valores de fluorescncia seguintes so refe-
rentes leitura efectuada aos 15 minutos, para as vrias concentraes de quercetina (Que), fisetina (Fis) e narin-
genina (Nar) estudadas. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na seco 3.2.2.2 dos Materiais e
Mtodos. Os grficos apresentados foram realizados com os resultados de uma de quatro experiencias representa-
tivas.
IV Apresentao dos Resultados
64

Tambm na figura anterior se pode observar a diminuio de fluorescncia emitida
pelas clulas, com o aumento da concentrao dos flavonides estudados.
A partir dos valores mdios de fluorescncia dos grficos apresentados na figura
anterior, calcularam-se os valores de percentagem de oxidao da sonda APF em funo
da concentrao de flavonide, que se apresentam na figura 31. Nesta figura, apresentam-
se, tambm, as curvas resultantes do ajuste de uma equao linear (no caso da querceti-
na) e exponencial (no caso da fisetina e naringenina) aos valores experimentais, efectuado
atravs do programa OriginPro.
0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Quercetina] (M)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Fisetina] (M)

0 1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
O
x
i
d
a

o

d
a

A
P
F

(
%
)
[Naringenina] (M)



A partir das equaes ajustadas aos valores experimentais obtidos, foram calculados os
valores de IC
50
, que so apresentados no quadro 5.



Figura 31. Efeito da concentrao de querce-
tina, fisetina e naringenina na oxidao da
sonda APF, detectada por citometria de fluxo,
mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos
activados ex vivo por PMA representao
grfica da curva resultante do ajuste de uma
equao linear aos valores experimentais. O
ajuste foi feito atravs do software OriginPro.
Os ensaios foram realizados de acordo com o
descrito na seco 3.2.2.2 dos Materiais e
Mtodos. Os valores apresentados represen-
tam a mdia de quatro experincias indepen-
dentes.

IV Apresentao dos Resultados

65

Quadro 5. Valores de IC
50
obtidos para os flavonides quercetina, fisetina e naringenina no mtodo da clorao
da oxidao da sonda APF, detectada por citometria de fluxo, mediada pelo HOCl produzido por neutrfilos acti-
vados ex vivo por PMA. Valores calculados a partir da equao ajustada aos pontos experimentais. desvio
padro associado ao valor de IC
50
, calculado segundo o teorema de propagao dos erros.






Todos os flavonides estudados apresentaram um efeito protector na oxidao da sonda
APF. Os flavonides fisetina e naringenina tiveram o maior poder de captao e a querce-
tina o menor.

Flavonide IC
50
(M)
Quercetina 2,89 0,3
Fisetina 1,31 0,3
Naringenina 1,37 0,21
IV Apresentao dos Resultados
66

3 Estudo do efeito de flavonides na activao do factor de transcrio NF-B
em clulas THP-1 activadas por LPS
Estudou-se, em seguida, o efeito dos flavonides na activao do factor de transcrio NF-
B, dada a sua importncia em doenas inflamatrias e no cancro. Antes da realizao dos
ensaios, foram optimizadas as condies a utilizar, como a concentrao de flavonides a
estudar, atendendo sua possvel citotoxicidade, e o tempo de incubao das clulas com
LPS, usado para induzir o estado de inflamao.


3.1.1 Citotoxicidade dos flavonides
Como foi referido anteriormente, foi necessrio efectuar um estudo preliminar para ava-
liar a toxicidade dos flavonides para as clulas THP-1, de forma a garantir que a viabilida-
de das clulas no era afectada pelas concentraes de flavonide.
Como referido na seco 4.1.1 dos Materiais e Mtodos, estes ensaios foram reali-
zados com o composto alamarBlue, que emite fluorescncia ao ser reduzido por enzimas
celulares, resultando num aumento de fluorescncia proporcional ao nmero de clulas
viveis presentes no ensaio.
Assim, foram realizadas incubaes de 16 horas das clulas com o flavonide, na
estufa de CO
2
. Na Figura 32 podem observar-se as leituras de fluorescncia, feitas de hora
a hora durante 3 horas (aps a adio do alamarBlue), obtidas para as concentraes de
5, 10, 15 e 20 M, para a quercetina, e 5, 10 e 20 M para a fisetina e naringenina.
IV Apresentao dos Resultados

67

0 1 2 3
0
2000
4000
6000
8000
10000
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)
0 1 2 3
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)


0 1 2 3
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)



Como se pode observar, das concentraes de flavonides estudadas, apenas a de 20 M
de quercetina e de fisetina se mostrou txica. Considerou-se desprezvel a ligeira diminui-
o de fluorescncia observada para a concentrao de 10 M de fisetina. No caso da
naringenina, nenhuma das concentraes estudadas apresentou toxicidade.
Assim, nos ensaios subsequentes no se ultrapassou a concentrao de 15 M de
quercetina, 10 M de fisetina e 20 M de naringenina.

3.1.2 Escolha do tempo de incubao das clulas com LPS
Em seguida, pretendeu-se determinar qual a durao da incubao das clulas com LPS
mais indicada, ou seja, qual o tempo que permitiria maximizar a resposta obtida, quer em
termos de uma maior diminuio de p65 e IB no citoplasma, quer em termos de um
aumento mais vincado de p65 no ncleo. O procedimento adoptado encontra-se descrito
na seco 4.1.2 dos Materiais e Mtodos.
Figura 32. Avaliao da toxicidade da querce-
tina, fisetina e naringenina, aps 16h de
incubao com as clulas THP-1, atravs de
medidas de fluorescncia obtidas no ensaio
com o alamarBlue. Grfico da evoluo da
fluorescncia do alamarBlue ao longo do
tempo, para cada concentrao de flavonide
testada (0 M - ; 5 M - ; 10 M - ; 15
M - ; 20 M - ). Este ensaio foi efectuado
tal como descrito em 4.1.1 da seco de
Materiais e Mtodos. Resultados referentes a
uma experincia representativa, de um con-
junto de trs experincias independentes,
realizadas em duplicado.

A
B
C
IV Apresentao dos Resultados
68

Foram testados quatro tempos de incubao, 0,5, 1, 2 e 5 horas. Nas figuras 33 e
34 pode observar-se o padro de bandas obtido aps o Western Blot para as protenas p65
e IBo as fraco citoplasmtica e para a protena p65 na fraco nuclear, respectivamen-
te, aps os tempos de incubao estudados.


Figura 33. Variao da quantidade de p65 e IB, no citoplasma, nos diferentes tempos de incubao testados. As
bandas apresentadas referem-se s protenas p65, IB e -actina (controlo de loading), para os quatro tempos
estudados (0,5, 1, 2 e 5 horas), sem e com adio de LPS (- e +), no citoplasma. Os ensaios foram realizados de acor-
do com o descrito na seco 4.1.2 dos Materiais e Mtodos. Experincia representativa de um conjunto de seis
experincias independentes.


Figura 34. Variao da quantidade de p65, no ncleo, nos diferentes tempos de incubao testados. As bandas
apresentadas referem-se protena p65 e ao padro de bandas obtido na membrana de nitrocelulose, corada com
Ponceau S (controlo de loading), para os quatro tempos estudados (0,5, 1, 2 e 5 horas), sem e com adio de LPS (-
e +), no ncleo. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na seco 4.1.2 dos Materiais e Mtodos.
Experincia representativa de um conjunto de quatro experincias independentes.


Aps a quantificao das vrias bandas obtidas, com recurso ao programa Image J, calcu-
lou-se o efeito do tratamento das clulas com LPS na translocao de p65 do citoplasma
para o ncleo e na degradao da IB no citoplasma. Para os vrios tempos de incubao,
foi feita uma razo entre o valor corrigido da banda na presena de LPS pela banda na
ausncia do mesmo (controlo). Assim, valores de 1 indicam uma manuteno dos nveis da
protena e valores superiores e inferiores a 1 indicam, respectivamente, um aumento e
uma diminuio. Os valores obtidos encontram-se resumidos no quadro 6.


p65
IB

-actina
0,5 0,5 + 1 1 + 2 2 + 5 5 +
p65

Membrana
0,5 0,5 + 1 1 + 2 2 + 5 5 +
IV Apresentao dos Resultados

69

Quadro 6. Efeito do tempo de incubao com LPS nos nveis de p65 e IB no citoplasma e no nvel de p65 no
ncleo. Os valores apresentados correspondem razo entre os valores das vrias bandas em relao ao controlo,
nos vrios tempos de incubao estudados. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na seco 4.1.2
dos Materiais e Mtodos. Os resultados apresentados correspondem mdia e respectivos desvios-padro de seis
experincias independentes.
Localizao Protena
Tempo de incubao com LPS (h)
0,5 1 2 5
Citoplasma
p65 1,05 0,36 0,7 0,13 1,24 0,05 0,77 0,12
IB 0,66 0,16 0,25 0,03 1,07 0,04 1,63 0,45
Ncleo p65 2,06 2,14 3,64 0,58 1,37 0,45 1,14 0,66

Da anlise do quadro anterior, pode-se constatar que o tempo de incubao que permitiu
obter, de uma forma mais marcada, as variaes que se esperavam (diminuio de p65 e
IB no citoplasma e aumento de p65 no ncleo) foi o de 1 hora. Este tempo de incubao
, de facto, o nico para o qual se conseguiu detectar, simultaneamente, uma diminuio
dos nveis proteicos no citoplasma e aumento no ncleo. Desta forma, foi este o tempo
escolhido para o estudo da aco dos flavonides da activao do NF-B.

3.1.3 Aco dos flavonides na activao do NF-B
Aps a optimizao das condies a usar, iniciaram-se os ensaios com os flavonides, a fim
de avaliar o seu efeito na activao do NF-B. Os ensaios foram realizados com quercetina
10 e 15 M, fisetina 10 M e naringenina 20 M e as clulas incubadas durante 1 hora
com LPS 100 ng/mL e procedeu-se anlise, por Western Blot, das protenas p65 e IBo
nos extractos citoplasmticos (figura 35) e da protena p65 no extracto nuclear (figura 36).


Figura 35. Efeito dos flavonides nos nveis citoplasmticos de p65 e IB. Bandas referentes a p65, IB e actina
(controlo de loading), no citoplasma. C e C + referem-se aos controlos, sem flavonide, tratados sem e com LPS,
respectivamente. Q 10 ensaio com quercetina 10 M; Q 15 ensaio com quercetina 15 M; F 10 ensaio com
fisetina 10 M; N 20 ensaio com naringenina 20 M. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na
seco 4.1.3 dos Materiais e Mtodos. Resultados referentes a uma experincia representativa de um conjunto de
duas experincias independentes.

p65

IB

-actina
C C + Q 10 Q 15 F 10 N20
IV Apresentao dos Resultados
70



Figura 36. Efeito dos flavonides nos nveis de p65 no ncleo. Bandas referentes a p65 e membrana corada com
Ponceau S (controlo de loading), no ncleo. C e C + referem-se aos controlos, sem flavonide, tratados sem e com
LPS, respectivamente. Q 10 ensaio com quercetina 10 M; Q 15 ensaio com quercetina 15 M; F 10 ensaio
com fisetina 10 M; N 20 ensaio com naringenina 20 M. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito
na seco 4.1.3 dos Materiais e Mtodos. Resultados referentes a uma experincia representativa de um conjunto
de duas experincias independentes.

Aps a quantificao das vrias bandas obtidas, no programa Image J, calculou-se o efeito
dos flavonides na deslocao de p65 do citoplasma para o ncleo e na degradao da
IB no citoplasma, nas clulas tratadas com LPS. Calculou-se a razo entre o valor corrigi-
do de cada banda referente aos ensaios com flavonide pela banda do controlo C + (trata-
do com LPS, na ausncia de flavonide). Assim, valores de 1 indicam uma manuteno dos
nveis da protena, relativamente ao controlo, e valores superiores e inferiores a 1 indicam,
respectivamente, um aumento e uma diminuio da protena na presena de flavonide.
Os valores obtidos encontram-se resumidos no Quadro 7.

Quadro 7. Efeito da presena de flavonides na variao dos nveis de p65 e IB no citoplasma e de p65 no
ncleo. Os valores apresentados correspondem razo entre os valores obtidos na presena dos flavonides e o
controlo positivo; Q 10 ensaio com quercetina 10 M; Q 15 ensaio com quercetina 15 M; F 10 ensaio com
fisetina 10 M; N 20 ensaio com naringenina 20 M. Os ensaios foram realizados de acordo com o descrito na
seco 4.1.3 dos Materiais e Mtodos. Resultados referentes a uma experincia representativa de um conjunto de
duas experincias independentes.
Localizao Protena
Ensaio
Q 10 Q 15 F 10 N 20
Citoplasma
p65 3,33 3,48 1,97 3,28
IB 1,21 1,9 0,99 2,83
Ncleo p65 0,58 0,45 0,41 0,29

Os resultados obtidos, permitem observar que os 3 flavonides testados inibem a translo-
cao do NF-B para o ncleo (valores de p65 < 1), retendo-o no citoplasma (valores de
p65 > 1) e inibem a degradao de IB (valores de IB > 1), com excepo da fisetina. O
flavonide mais eficaz foi a naringina 20 M. tambm de referir, que o aumento de con-
centrao de quercetina se reflectiu num aumento da inibio.


C C + Q 10 Q 15 F 10 N20
p65

Membrana
IV Apresentao dos Resultados

71

4. Estudo da toxicidade dos flavonides para as clulas mononucleares do sangue
perifrico (PBMC)

Como j foi referido, um dos objectivos principais deste trabalho era estudar o efeito dos
flavonides na activao do NF-kB em PBMC estimulados por LPS. No entanto, devido ao
baixo rendimento na obteno de PBMC e quantidade elevada de protena necessria
para a anlise das protenas citosplasmticas e nucleares, por Western Blot, foi apenas
estudada a toxicidade dos flavonides em relao aos PBMC.
A avaliao da toxicidade dos flavonides para as PBMC foi feita realizando o teste
de actividade metablica com o alamarBlue, aps 16 horas de incubao com os flavo-
nides, como descrito na seco 4.2.2 dos Materiais e Mtodos. Foram testados os flavo-
nides quercetina, fisetina e naringenina, nas concentraes 5, 10 e 20 M.

0 1 2 3
0
100
200
300
400
500
600
700
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)
0 1 2 3
0
100
200
300
400
500
600
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)

0 1 2 3
0
100
200
300
400
U
n
i
d
a
d
e
s

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c

n
c
i
a
tempo (h)

Como se pode observar nos resultados obtidos, apenas a fisetina apresentou toxicidade
para as concentraes de 10 M, embora de uma forma ligeira, e 20 M.
Figura 37. Actividade metablica de PBMC, aps
16h de incubao na presena de quercetina (A),
fisetina (B) e naringenina (C). Valores de fluores-
cncia obtidos atravs do mtodo do alamar-
Blue, medidos ao fim de 1, 2 e 3 horas, para cada
concentrao de flavonide testada (0 M - ; 5
M - ; 10 M - ; 20 M - ). Os ensaios foram
realizados de acordo com o descrito na seco
4.2.2 dos Materiais e Mtodos. Resultado referen-
te a uma experincia representativa, de um con-
junto de trs experincias independentes, realiza-
das em duplicado.

A
B
C






























V Discusso

V Discusso
74

Este trabalho teve como objectivo contribuir para a identificao de propriedades anti-
inflamatrias que, em geral, so atribudas aos flavonides sem que se conhea muito
bem a sua base cientfica. Assim, foi avaliada a capacidade de alguns flavonides (querce-
tina, fisetina, naringenina e naringina) para captar HOCl, um oxidante forte produzido
pelos neutrfilos, e os seus efeitos na activao do celular do factor de transcrio NF-kB.

O estudo da captao do HOCl, produzido por sntese qumica e por neutrfilos activados,
foi feito atravs de ensaios de competio, com base na oxidao do vermelho de piroga-
lol (PGR), na clorao da taurina e na oxidao da sonda 3-aminofenilfluorescena (APF)
que foi avaliada por fluorimetria e por citometria de fluxo. De um modo geral, estabele-
ceu-se, para os diferentes mtodos, uma relao entre a percentagem de inibio da oxi-
dao ou clorao pelo HOCl e a concentrao de flavonide, permitindo determinar os
respectivos valores de IC
50
. Para facilitar a discusso resume-se no quadro seguinte os
resultados obtidos para os flavonides estudados nas vrias condies ensaiadas.

Quadro 8. Valores de IC
50
obtidos nos ensaios de captao de HOCl

Flavonide
HOCl qumico HOCl neutrfilos activados
Oxidao
PGR
Clorao
taurina
Clorao
taurina
Oxidao APF
Fluorimetria Citometria
Quercetina

21,35 0,51 5,46 0,28 3,78 1,09 0,21 0,03 2,89 0,3
Fisetina

44,08 3,32 12,3 1,57 7,13 0,52 3,65 1,57 1,31 0,3
Naringenina

40,11 1,02 24,1 1,83 3,81 0,46 1,99 0,19 1,37 0,21
Naringina

88,5 17 99 10,98 9,51 1,48 - -

V Discusso

75

Como j foi referido, os estudos, sem clulas, de captao realizados com HOCl produzido
quimicamente, por flavonides, permitem avaliar a capacidade antioxidante dos compos-
tos que conferida pela sua estrutura. Mais concretamente, como foi mencionado na
Introduo, as caractersticas estruturais importantes para uma eficiente captao de
HOCl so a existncia da dupla ligao C2=C3 e o grupo 3-OH e a presena de grupos OH
nas posies 5 e 7 do anel A.
Nos resultados obtidos para a oxidao do PGR, pode observar-se que a querceti-
na, todas as caractersticas atrs referidas, apresenta o melhor poder de captao (menor
valor de IC
50
), em contraste com a fisetina e naringenina, que possuem apenas algumas
daquelas caractersticas, e com a naringina que no possui nenhuma. Confirmam-se,
assim, as relaes estrutura-actividade estabelecidas, com uma gama mais alargada de
flavonides (Justino et al, 2009).
No mtodo da clorao da taurina, esta relao mantm-se, embora se consiga
notar uma diferenciao entre os flavonides fisetina e naringenina, sendo o primeiro
mais eficiente. Comparando a estrutura destes dois compostos, parece concluir-se que a
existncia da dupla ligao C2=C3 e do grupo 3-OH (fisetina) so caractersticas mais
importantes do que a presena dos grupos OH nas posies 5 e 7 do anel A, na ausncia
da dupla ligao C2=C3 e do grupo 3-OH (naringenina).
Como foi referido na Introduo, a captao de HOCl pelos flavonides ocorre
atravs da clorao dos carbonos nas posies 8 e 6, no anel A, e corresponde a uma reac-
o de substituio electroflica aromtica em que os grupos 5 e 7 OH (activadores e
directores orto e para) promovem a clorao. Por outro lado a ligao dupla C2=C3 e o
grupo 3-OH conferem coplanaridade aos anis B e C permitindo a redistribuio dos elec-
tres provenientes de grupos ricos em electres (Cl) ligados ao anel A (Justino et al, 2009).
As diferenas observadas entre os resultados obtidos para a oxidao do PGR e clo-
rao da taurina devem-se s caractersticas ao mtodo em si.

Os ensaios efectuados para determinar a capacidade dos flavonide para captar HOCl pro-
duzido por neutrfilos activados, ao contrrio dos mtodos qumicos, so influenciados
por outros factores, que tm a ver com a produo de HOCl atravs duma reaco enzim-
tica e da interaco dos flavonides com as clulas. Uma das principais diferenas nos
resultados obtidos, comparativamente aos mtodos qumicos, a gama mas apertada de
valores de IC
50
obtidos. Uma explicao para este facto resulta do modo de libertao do
V Discusso
76

HOCl. Enquanto que nos mtodos qumicos, o HOCl adicionado em bolus, isto , a sua
concentrao final atingida imediatamente, nos mtodos com neutrfilos activados, o
HOCl libertado de forma gradual, atravs de uma reaco enzimtica que despoletada
pelo PMA, ainda que de uma forma mais abrupta do que em situaes fisiolgicas (Spletts-
toesser e Schuff-Werner, 2002). Desta forma, neste segundo caso, a concentrao
momentnea de HOCl menor, facto que favorece a eficcia de captao do HOCl pelos
flavonides que se tinham mostrado menos eficazes na captao do HOCl adicionado em
bolus.
A clorao da taurina permite avaliar a captao de HOCl no exterior das clulas,
ou seja, o HOCl libertado dentro das clulas mas que vem para o exterior, uma vez que
apenas analisado o sobrenadante da mistura reaccional. possvel, no entanto, que se
forme clorotaurina no interior dos neutrfilos, que depois atravessa a membrana e reage
com o reagente revelador adicionado ao meio. De facto, a taurina o aminocido livre
mais abundante no citosol dos leuccitos, especialmente dos neutrfilos, existindo em
concentraes 10 30 mM e o HOCl reage rapidamente com este aminocido (Marcinkie-
wicz et al, 1998). Como uma molcula aninica pequena, a clorotaurina consegue movi-
mentar-se atravs da membrana, por troca aninica (Cantin, 1994).
Nos ensaios de clorao da taurina por neutrfilos activados, os valores de IC
50

mais baixos foram obtidos para os flavonides quercetina e naringenina, seguidos pelos da
fisetina e naringina. Como o HOCl libertado pela clula, para alm da estrutura do flavo-
nide, dever ser importante a sua interaco com a membrana do neutrfilo, que ser
tanto maior quanto mais apolar for a molcula (Oteiza et al, 2005). Assim, como j foi ana-
lisado, a quercetina, devido sua estrutura, um bom captador, apresentando um IC
50

baixo. A naringenina no to bom captador, como se observou neste mtodo aplicado
captao de HOCl produzido quimicamente, mas sendo o flavonide mais apolar, o que
melhor interage com a membrana, tornando-se to bom captador de HOCl produzido
pelos neutrfilos quanto a quercetina. A fisetina tem uma capacidade de captao e pola-
ridade intermdias, apresentando um valor ligeiramente superior. A naringina apresenta
um IC
50
superior, que se justifica pela sua estrutura no favorvel aliada dificuldade de
interaco com a membrana, devido presena do grupo sido na posio 7.
Utilizou-se, ainda, um outro ensaio de competio, para estudar a capacidade
antioxidante dos flavonides em relao ao HOCl, que se baseou na oxidao da sonda
APF que origina um produto fluorescente. A fluorescncia foi avaliada por espectrofluori-
V Discusso

77

metria e por citometria de fluxo. A sonda APF apresenta a vantagem de permitir avaliar a
captao intracelular de HOCl, uma vez que esta sonda consegue entrar nas clulas, permi-
tindo, por isso, medir a fluorescncia total (no interior e exterior das clulas). Por outro
lado, e uma vez que por citometria se faz a anlise clula a clula, os resultados reportam-
se fluorescncia emitida pelas das clulas e no no seu meio envolvente. Desta forma, os
mtodos usados complementam-se e a anlise conjunta dos resultados permite avaliar a
capacidade dos flavonides para captarem o HOCl, tendo em conta as suas estruturas mas,
tambm, as suas interaces com a membrana das clulas.
No mtodo espectrofluorimtrico, a hierarquia da eficincia dos flavonides para
captao do HOCl manteve-se, relativamente ao mtodo da clorao da taurina, embora
tivesse ocorrido uma diferenciao entre a quercetina e naringenina, ambos melhores
captadores que a fisetina. Analisando estes dados isoladamente, e considerando que neste
mtodo tambm se mede a captao de HOCl intracelular, poder-se-ia pensar que a quer-
cetina conseguiria entrar nas clulas, ao contrrio da naringenina, que apenas interagiria
com a membrana. No entanto, os resultados obtidos por citometria de fluxo que, como foi
referido, fornece dados apenas das clulas, indicam que tanto a naringenina como a fiseti-
na, com menores valores de IC
50
que a quercetina, tm maior capacidade para entrar nas
clulas que esta. A quercetina um flavonide bastante polar, logo interage apenas com a
superfcie da membrana (Oteiza et al, 2005). Os flavonides fisetina e naringenina, sendo
mais apolares, conseguem ligar-se ao interior hidrfobo da membrana, sendo, por isso,
mais fcil a sua entrada na clula (Oteiza et al, 2005). Desta forma, o bom resultado obtido
para a quercetina por espectrofluorimetria poder ser devido distribuio da sonda APF.
De facto, esta sonda tem uma localizao predominantemente intracelular (Freitas et al,
2009). No entanto, a sonda adicionada em excesso ao ensaio, ficando parte desta no
exterior das clulas. Desta forma, e como parte do HOCl produzido libertado para o exte-
rior da clula (Halliwell, 2006), a fluorescncia total lida dever ter uma componente
extracelular mais forte.
As diferenas de gamas de valores de IC
50
obtidos nos dois mtodos usados para os
ensaios com neutrfilos activados, clorao da taurina e oxidao APF, podem dever-se
quantidade de clulas usadas em cada um dos mtodos, 2x10
6
clulas/mL e 0,5x10
6
clu-
las/mL, respectivamente. Considerando que se usou a mesma quantidade de PMA (100
ng/mL), ser de esperar que a quantidade de HOCl produzido pela estimulao tenha sido
superior do mtodo da clorao da taurina. Assim, haver mais cido disponvel para clo-
V Discusso
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rar a taurina do que para oxidar a sonda, o que deve justificar os valores de IC
50
superiores
no mtodo da clorao da taurina.

Na segunda parte do trabalho estudou-se os efeitos dos flavonides na activao celular
do factor de transcrio NF-kB.
Como foi dito na Introduo, a activao da via clssica do NF-B leva degradao
da protena inibidora do NF-B, a IB. Assim, o NF-B, ficando livre, desloca-se para o
ncleo onde promove a transcrio de vrios genes.
Os ensaios de para o estudo dos efeitos dos flavonides na activao do NF-B
foram iniciados pela escolha do tempo de incubao das clulas com LPS. Como j foi refe-
rido, pretendia-se determinar qual o tempo que permitia que a resposta ao LPS fosse
maximizada. Os resultados obtidos foram, em geral, consistentes, para cada tempo de
incubao.
Para os 30 minutos, os resultados no so muito esclarecedores. Por um lado,
poderia considerar-se uma manuteno dos nveis de p65. O valor obtido para o citoplas-
ma muito prximo de 1, consistente com esta justificao. O valor de p65 no ncleo
poderia manter-se tambm, uma vez que o valor obtido apresenta um erro demasiado
elevado para se poderem tirar quaisquer concluses. Outra interpretao possvel estar
a ocorrer uma translocao de p65 para o ncleo, consistente com a diminuio observada
para a IB. De facto, Takashiba et al (1999) observaram em clulas THP-1 que o estimulo
com LPS 100 ng/mL levou deteco de NF-B no ncleo, a partir da meia hora, e a degra-
dao da IB ocorre de forma bastante rpida (revisto por Sun e Andersson, 2002 e Skaug
et al, 2009), havendo dados que indicam que, em clulas THP-1 estimuladas com LPS 10
g/mL, a degradao iniciada cerca de 15 minutos aps o estmulo (OConnell et al,
1998).
Ao fim de 1 hora de incubao, observa-se uma diminuio das protenas p65 e
IB no citoplasma e um aumento de p65 no ncleo. No entanto, a diminuio de p65 no
citoplasma no to evidente como o aumento no ncleo. Esta observao pode ser devi-
da ao tamanho do pool de p65 nos dois locais. Enquanto que no citoplasma esta protena
existe constantemente, no ncleo s existe mediante activao celular. Deste modo, a
translocao de uma determinada quantidade de p65 do citoplasma para o ncleo reflec-
tir-se- mais no ncleo do que no citoplasma.
V Discusso

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Ao fim de 2 horas de incubao, nota-se um pequeno aumento de p65 no cito-
plasma e no ncleo o que no dever acontecer, devido translocao do p65 de um local
para o outro. Porm, os valores so ambos prximos de 1 e o aumento obtido no ncleo
tem um grande erro associado. Pode-se, por isso, considerar que h uma manuteno dos
valores ou um ligeiro aumento no citoplasma, com uma diminuio concomitante no
ncleo. Dados na literatura indicam que em clulas THP-1 estimuladas com LPS 10 g/mL
(OConnell et al, 1998), em macrfagos peritoneais estimulados com LPS (Tran et al, 1997)
e em clulas pr-B estimuladas com IL-1 (May e Ghosh, 1998) a ressntese de IB inicia-
da 2 a 3 horas depois do inicio do estmulo. Assim, este resultado indicativo de uma inter-
rupo na activao poder ser devido ao efeito de feedback negativo, exercido pela IB,
que ao ser ressintetizada se dirige para o ncleo, onde recruta o NF-B, transportando-o
para o citoplasma (revisto por Skaug et al, 2009).
Para as 5 horas, observa-se um aumento nos nveis de IB no citoplasma e uma
ligeira translocao do p65 do citoplasma para o ncleo. Esta observao pode ser devida
aco da IB. Apesar de haver um aumento de IB, a translocao de p65 para o
ncleo pode ser devida degradao de IB, que ocorre de forma lenta inicialmente
(revisto por Skaug et al, 2009), atingindo um mximo a partir das 2 horas, aps o estmulo.
Este efeito foi observado em macrfagos peritoneais estimulados com LPS (Tran et al,
1997) e em clulas pr-B estimuladas com IL-1 (May e Ghosh, 1998).
Pelo que se disse anteriormente, escolheu-se o tempo de 1 hora de incubao com
LPS, j que foi para este tempo que se obteve, no conjunto, uma maior diminuio de p65
e de IB no citoplasma e um maior aumento de p65 no ncleo. H uma grande contro-
vrsia sobre o tempo ao fim do qual ocorrer o mximo de activao. Por exemplo, os
resultados obtidos por OConnell et al (1998), com clulas THP-1 estimuladas com LPS 10
g/mL, e por Choi et al (2007), com clulas RAW (macrfagos) estimuladas com LPS 100
ng/mL, indicam que a activao mxima ser 30 minutos aps o inicio do estmulo. Cordle
et al (1993) observaram, em clulas THP-1, que a activao mxima ocorreria 2 horas aps
o estmulo com LPS (10 g/mL). H, tambm, dados da literatura concordantes com os
resultados obtidos no presente trabalho. Takashiba et al (1999), observaram que o nvel
mximo de NF-B no ncleo ocorria ao fim de 1 hora aps a adio de LPS (100 ng/mL).
Tambm no trabalho de OConnell et al (1998), j referido, com clulas THP-1 estimuladas
com LPS (10 g/mL), se observou que a degradao mxima da IB ocorria entre os 30 e
os 90 minutos.
V Discusso
80

Note-se, porm, que as diferenas nos resultados obtidos, relativamente aos dados
da literatura podem ser devidos a diferenas no tratamento das clulas, ou mesmo s
clulas em si. medida que vo envelhecendo, ou seja, medida que vo aumentando o
nmero de passagens, aumenta a probabilidade de as clulas sofrerem mutaes, o que
pode levar a diferenas no seu comportamento ou na resposta a estmulos externos.
Os resultados obtidos nos ensaios com flavonides indicam que estes podero ini-
bir a activao do NF-B, inibindo a sua translocao para o ncleo, aumentando a sua
reteno no citoplasma, e diminuindo a degradao da IB. O flavonide que demonstrou
maior efeito foi a naringenina 20 M, seguido da quercetina 15 M e quercetina 10 M; a
fisetina 10 M foi o que teve menos efeito. H, no entanto, que ter cuidado a tirar conclu-
ses, uma vez que foram feitas apenas duas experincias independentes. H, no entanto,
dados na literatura que apoiam os resultados obtidos no presente trabalho.
H resultados que sugerem que quercetina inibe a translocao de NF-B para o
ncleo de clulas da microglia (Chen et al, 2005) e a fosforilao de IB e de IB em
macrfagos (Comala et al, 2006) e em PBMCs (Nair et al, 2006).
Sobre a naringenina, Hmlinen et al (2007) observaram que este flavonide ini-
bia a translocao de NF-B do citoplasma para o ncleo, em macrfagos.
Estudos realizados com fisetina indicam que este flavonide inibe a translocao
do NF-B para o ncleo e degradao da IB em mastcitos (Park et al, 2007), em clulas
do adenocarcinoma de pulmo humanas, clulas de linfoma de Burkitt humanas e clulas
de rim embrionrias (Sung et al, 2007) e em clulas da microglia (Zheng et al, 2008).
O facto de a sinalizao do NF-B ser relativamente conservada nos vrios tipos de
clulas usadas nestes estudos (Vallabhapurapu e Karin, 2009) indicativo de que os dados
da literatura referidos, apesar de no ter sido realizado em clulas THP-1, podem corrobo-
rar os resultados obtidos neste trabalho.
Dos resultados deste trabalho pode afirmar-se que os flavonides estudados apre-
sentam um efeito protector na activao do NF-B, em clulas THP-1 estimuladas por LPS,
ainda que no seja possvel, dado o pequeno nmero de flavonides estudados, estabele-
cer qualquer relao estrutura-actividade.

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, possvel concluir que os flavonides estu-
dados, quercetina, fisetina, naringenina e naringina, possuem uma elevada capacidade
V Discusso

81

para reagir com o HOCl e inibem a activao do NF-B, demonstrando ter propriedades
que podem contribuir para uma aco anti-inflamatria.





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