Universidad Nacional del Santa Laboratorio de Bioprocesos

E.A.P. Ing. Agroindustrial Pre Informe N 0

FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL TITULO:
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

PROFESOR: AU!US"# $AS"ILL# $AL%E&#N

GRUPO: $'( CURSO: LAB#&A"#&I# %E BI#P&#$ES#S ALUMNOS: $AB&E&A $AL%E&#N )ILA!&I"#S *I)ENES A!UI&&E NES"#& SAN$+E, ,A)U%I# )ELISSA SA)$+E, )E%INA PA"&I$IA S#"# !UE-A&A *#SE

NVO CHIMBOTE, NOVIEMBRE 2009

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PRE INFORME DE EXPERIMENTO

TITULO: .DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

POR LOTES

I. OBJETIVOS: 1.1 Objetivos e!e"#$es:

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 Determinaci!n de los par"metros cin#ticos de la cepa Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 1.%. Objetivos Es&e'()i'os: Disear el medio l$%uido de cultivo Activaci!n celular y desarrollo del in!culo Determinar la cin#tica de crecimiento de la &iomasa Determinar de la cin#tica de consumo de la 'uente de car&ono Determinar la cin#tica de (eneraci!n de )tanol Determinaci!n del M y k s * los rendimientos del nutriente limitante en c#lulas y en etanol adem"s de las respectivas productividades en c#lulas y en etanol )valuar el valor del p+ del caldo de cultivo al inicio y 'inal de la cin#tica

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II. *ETODOLO IA E+PERI*ENTAL: ,ara la 'ormulaci!n del diseo de cultivo se tiene en cuenta los si(uientes re%uerimentos nutricionales para el cultivo Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 P#"# e$ Dise,o -e$ .e-io -e '/$tivo. -acronutrientes p+ Est#-o: -edio l$%uido Re0/e"i.ie!tos !/t"i'io!#$es: ,ara ello utilizamos un -edio de cultivo m$nimo 1uente de car&ono y ener($a . 1uente de / 1uente de -( y S 1uente de 0 1uente de , . . . . Sacarosa Sul'ato de amonio Sul'ato de ma(nesio heptahidratado 1os'ato di"cido de ,otasio 1os'ato di"cido de ,otasio *e-io $(0/i-o -e *#!te!'i1!: preparaci!n para 23 ml T#b$# N2 31 N/t"ie!te )xtracto de levadura ,eptona )xtracto de malta A(ar 4lucosa C#!ti-#3 12 (r 3 22 (r 3 12 (r 1 33 (r 3 2 (r . . C, /, -(, 0 y , 42

*e-io A'tiv#'i1!: preparaci!n para 53ml

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T#b$# N2 3% N/t"ie!te Sacarosa )xtracto de levadura )xtracto de malta Soluci!n de sales C#!ti-#3 6 (r 3 6 (r 3 12 (r 3 12 ml

*e-io 4e".e!t#'i1!: preparaci!n para 533 ml T#b$# N2 35 N/t"ie!te Sacarosa )xtracto de levadura 8/+492,:4 0+2,:4 -(S:4 7+2: Soluci!n de sales Tamp!n citrato p+ 4,2 C#!ti-#1 371 (r 3 6 (r 3 5;2 (r 3 37; (r 3 356 (r 5 ml

So$/'i1! -e s#$es: T#b$# N2 36

N/t"ie!te CaCl2 2+2: <nS:4 7+2: Co!'e!t"#'i1! 789$: 1 12 3 11

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-o:5 CuS:4 2+2: CoCl2 6+2: -nCl2 6+2: 1eS:4 7+2: /aCl

3 3332 3 32 3 31 3 327 3 36 3 2;

P"e&#"#'i1! -e $os .#te"i#$es &#"# e$ .e-io -e '/$tivo 1 =avar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar 2 =ue(o colocarlos en la estu'a en posici!n vertical los vasos precipitados, matracez y tu&os de ensayo 5 =as pipetas a utilizar de&er ser puestas en la estu'a previamente recu&ierta de papel aluminio 4 )sterilizar a 121 >C por 12 minutos 2 ,esar la sacarosa re%uerida y los dem"s 'uentes de nutrientes 6 )n un matraces de 122ml diluir las sales con 23ml de a(ua destilada nitr!(eno con a(ua destilada 7 )n un matraces de 122ml diluir la sacarosa con 23 ml de a(ua destilada ; )n un matraces de 122ml diluir el nitr!(eno con 23 ml de a(ua destilada 6 Colocar los matraces previamente recu&ierto con papel aluminio en la estu'a 13 )sterilizar a 121 >C por 12 minutos 11 )n un matraz de 1 = a(re(ar las 5 disoluciones antes hechas 12 )la&orar la curva de cali&raci!n para la determinaci!n de azucares reductores por el m#todo del D/S I!o'/$#'i1!: Se tuvo el lu(ar &ien desin'ectado, se colocaron los

mecheros se prosi(ue de la si(uiente manera. 1. =a aza &acteriol!(ica se expone al 'ue(o del mechero hasta alcanzar el ro?o vivo %. De?amos en'riar por unos se(undos para lue(o introducirlo en el tu&o de ensayo %ue conten$a las c#lulas desarrolladas en medio rico li%uido 8sin a(ar9, se extra?o una (ota y se coloc! y@o sem&r! en un
1

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tu&o de ensayo con medio rico s!lido 8con a(ar9 8 la azada se realiz! en el tu&o desde adentro hacia 'uera en estr$as9 5. )l procedimiento de inoculaci!n se har" por duplicado es decir 2 azadas 6. Se lleva a incu&aci!n por 6h

Dete".i!#'i1! -e $os "e!-i.ie!tos -e$ !/t"ie!te $i.it#!te e! ';$/$#s. 1uente de car&ono y ener($a. Sacarosa 8C 12+22 :119, -A 542 ( BC@S A D de C en el nutriente @ D de C en la c#lula D de C en el nutriente A 8128129 x 1339@ 542 A 42 D D de C en la c#lula A 42 D BC@S A 842@429 x 3 6 8este 'actor por ser aireado9 BC@S A 3 ;;@ x 3 6 A 3 26 (@( III. *ATERIALES< INSTRU*ENTOS Y REACTIVOS: 5.1 *#te"i#$es ,ipetas Tu&os de ensayo Earilla de vidrio -atraz )rlenmeyer 4uantes )sp"tula ,ro&eta (raduada Capachos de papel Easo de precipitados 223ml Al(od!n 4asa Alcohol ,apel aluminio A(ua destilada

5.% E0/i&os Falanza anal$tica Falanza de dos platos :lla a presi!n ShaGer p+metro )stu'a Hncu&adora )spectro'ot!metro Centri'u(a

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5.5 Re#'tivos Sustrato. Sacarosa -uestra. Saccharomyces cerevisiae. )xtracto de levadura ,eptona )xtracto de malta A(ar

CRONO RA*A DE ACTIVIDADES: 1.= PRO RA*ACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES: >ORARIO INICIO TER*INO

ACTIVIDAD D(# Vie"!es 3?91193@

3

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,reparaci!n de reactivos D/S, soluci!n de sales, etc D(# J/eves 1%91193@ ,reparaci!n del medio de mantenci!n a(ar nutriente y esterilizaci!n D(# Vie"!es 1591193@ Iesem&rado de c#lulas en el medio de mantenci!n a(ar s!lido D(# J/eves 1@91193@ ,reparaci!n y esterilizaci!n del medio rico li%uido para inoculo Hnoculaci!n con aza &acteriol!(ica y esterilizaci!n de materiales de vidrio ,reparaci!n del medio li%uido para la cin#tica de crecimiento micro&iano D(# Vie"!es %391193@ Se(uimiento de la cin#tica micro&iana

6 53 a m

5 33 pm

2.33 pm

6.33 pm

6.53am

1.33pm

2.33 pm

6.33 pm

13.33pm

6.53 a m

6.33 pm

RE4ERENCIAS BIBLIO RA4ICAS: 1 http.@@JJJ micro&iolo(ia com ar@&acteriolo(ia@'isiolo(ia phpK -ostrarA%uimicos 2 http.@@JJJ mono(ra'ias com@tra&a?os12@lacto&acilos@lacto&acilos shtml

V. ANE+OS:
ANEXOS I:

Dise,o -e$ .e-io -e #'tiv#'i1! A -e 4e".e!t#'i1!:

PARA LA SACAROSA %C nut !"nt" # $2% %C& "n '!()*+*# $,%

Y X C =

X 4C.ennutriente = 0.2 S 4C.enbiomasa

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Y XC =

0/4 0.2 = 0.12 g g 014

Si6

X = /g

X = Y XS S

( S f S ) Y X C = X
/g X l = X Y C 0.12 g

Si:

Sf =0

S C =

S C = (.13 g

PARA -H2PO$:

Y X P =

X 4 P.ennutriente = S 4 P.enbiomasa
( 00 = //.3704 (2

4 P.ennutriente =

Y XP =
X S p = = Y Xp

//.3704 = .(73 g /4 g
/g
l g

.(73 g

= 0. 31 g .1 = 0./2/1 g
l

S p = 0./2/0 g
l

Y X K =

4 K .ennutriente 4 K .enbiomasa

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/5.232 g 0.1

= 13.(1/ g

Y X K = 13.(1/ g
g

SK

/g X l = = Y X K 13.(1/ g

S K = 0.0(1 g .1
l g

S K = 0.01/1 g

PARA .NH$/2SO$:

Y XN =

4 N .ennutriente 4 N .enbiomasa
0/ 00 = / ./ 4 (/

4 N .ennutriente =

Y XN =

/ ./ 4 = /.(122 g 74 g
S N = 0.5053 g .1
l

SN

/g X l = = X Y N /.(122 g

S N = ./3(

PARA M0SO$&1H2O:

YXS =

4Mg.ennutriente 4Mg.enbiomasa
/0 00 = 7.312 4 /02 0

4 Mg.ennutriente =

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YXS =

7.312 4 = /0.(70( g 8 g 0.04

S S = 0.05 g .1
l

/g X l S S = = Y X S /0.(70( g

S S = 0. ( g
TABLA DE RESULTADOS: Fu"nt" $ /+//# :+/P#0 :+/P#0 <N+0=/S#0 )gS#0.3+/# E7")"nt( $ P : N )g

g Y X S g
0.12 .(73 13.(1/ /.(122 /0.(70(

g S l
(.13 0./2/0 0.01/1 ./3( 0. (

P* * un )"2!( 2" 3" )"nt*4!5n 2" 600)7 8* * un* 8 (2u44!5n 2" 2097 9uente $ /+//# :+/P#0 E;tracto de Levadura <N+0=/S#0 )gS#0.3+/#

g S l
(.13 0./2/0 ( ./3( 0. (

S ( g )
.03 0.035 0.7 0.(5/ 0.0(7