2002 Jorge Guillermo Gmez Gutirrez / Luis G. Bermdez Humarn / Reyes Tamez Guerra / Juan Manuel Adame Rodrguez / Roberto Montes de Oca Luna PRODUCCIN Y PURIFICACIN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE Ciencia UANL, julio-septiembre, ao/vol. V, nmero 003 Universidad Autnoma de Nuevo Len Monterrey, Mxico pp. 316-321
||||^ |^|| / \O| \, |o `, !|||O||'||`||| .00. `c Produccin y puriIicacin de la Taq 0NA polimerasa a partir de - ?E recombinante !o .||o o !., |. |J |, |y ' ,
! `| ^J |oJ|, |o|!o `o! J O. | L o DN/ polimoroso do Thonus ouo||cus (To DN/ polimoroso} os lo orzimo Jsodo or ol procodimioro dol PCP (rooccir or codoro do lo polimoroso}. Eso os Jr moodo oxroor- dirorio poro lo sirosis do cido dosoxirriLorJcloico (DN/} |o ||o. El PCP pJodo ompliicor Jr por o Jr ropmoro ospociico do DN/ or vorios milloros do vocos or moros do dos loros. SJs vosos oplicocio- ros dioror lJpor o Jr ovorco voricol or ol roo do los ciorcios Liolpicos. Dorro do olpJros do los oplicocioros dol PCP so orcJorror ol dioprsico molocJlor do orormododos poroicos lJmoros, do iroccioros virolos y Locorioros, or osJdios do ovo- lJcir molocJlor, clorocir y oxprosir do poros, idoriicocir do irdividJos, oc. El PCP os Jro rooccir do vorios ciclos or codo- ro, dordo codo ciclo so comporo do ros oopos Jo sor. (o} dosroJrolizocir dol DN/, (L} liLrido- cir do oliporJcloidos y (c} sirosis do DN/. Er ol primor poso so soporor los codoros do DN/ o om- poroJros do oproximodomoro 4 o C, oso pormio Jo or ol sopJrdo poso so liLridor los oliporJclo- idos o lo ropir do DN/ Jo so dosoo ompliicor y, irolmoro, or ol orcor poso lo orzimo To DN/ polimoroso llovo o coLo lo sirosis do DN/ o Jro omporoJro do 72 o C. Esos ros posos so ropior or Jr promodio do 3C vocos. Es docir, Jo dJroro codo ciclo los compororos do lo rooccir posor por om- poroJros mJy olovodos o los cJolos so irocivor lo moyorio do los orzimos. Cripirolmoro ol procodi- mioro dol PCP so osoLloci Jsordo lo DN/ poli- moroso l do Escho|ch|o co||. 1 Eso orzimo ro os rosisoro o los omporoJros Jsodos or lo dosroJrolizocir dol DN/ y por ordo so odicioro- Lo rJovo orzimo dospJos dol primor poso or codo ciclo do rooccir. Eso proLlomo so rosolvi ol sJsi- Jir lo DN/ polimoroso l do Escho|ch|o co|| por Jro orzimo ormoosoLlo Jo ro pordio sJ ocividod o diclos omporoJros. Eso orzimo os lo To DN/ polimoroso prodJcido por lo Locorio ormilo Thonus ouo||cus. 2 Lo To DN/ polimoroso sim- pliic or pror modido lo rooccir do PCP ol pros- cirdir do odicioror orzimo or codo Jro do los 3C ciclos Jo so ropio lo rooccir. Lo impororcio Jo coLr oso orzimo doormi- r Jo so osoLlocioror procodimioros poro ocili- or sJ pJriicocir, o porir do lo Locorio prodJco- ro do oso orzimo, Thonus ouo||cus. Posoriormor- o, cor ol Jso do lo ocrolopio dol DN/ rocomLi- *LoLoroorio do lrmJrolopio y \irolopio. **LoLoroorio do Micolopio Modico, FocJlod do Ciorcios Eiolpi- cos, U/NL, |odomo_ccr.dsi.Jorl.mx Poprosorocir ridimorsiorol do lo To DN/ polimoroso. ||||^ |^|| / \O|\, |o `, !|||O||'||`||| .00. ` roro ol por do lo To DN/ polimoroso so clor o porir do T. ouo||cus y so oxpros or Escho|ch|o co||. 3 Lo oxprosir do oso por or E. co|| ocili sJ prodJccir y pJriicocir. 4 Er ol prosoro roLo|o so doscriLo lo odopocir do Jr procodimioro poro lo prodJccir y pJriico- cir do oso orzimo To DN/ polimoroso, o porir do Jro copo rocomLiroro do E. co||. MetodoIogo Cepo recombinonte de -?E y plsmido pTkC-Toq So irrodJ|o por olocroporocir or Jro copo DH5 do E.co|| (Srooporo} ol plsmido pTPC-To (ipJ- ro1}, ol cJol poro ol por do lo To DN/ polimoroso Lo|o lo ropJlocir dol promoor |oc. Poro domos- ror lo prosorcio dol por do lo To DN/ polimoroso so oisl ol DN/ plosmidico, sopr lo ocrico doscri- o por EirrLoim ord Doly (17}, 5 so dipiri cor lo orzimo do rosriccir \hol por 2l o 37`C y so oro- liz or Jr pol do oporoso ol C.8, orido cor Lro- mJro do oidio. Froduccin de lo Toq en medio L8 LAHIKI T8 El modio TE os Jr modio ms orriJocido y so olcor- zor dorsidodos colJloros do Locorios moyoros Jo los Jo so oLioror cor LE. Por ol moivo docidimos proLor si or ol modio TE so oLorio Jr moyor prodJc- cir do To DN/ polimoroso Jo or ol modio LE. Poro oso propsio so propor Jr proircJlo do 5 ml do lo Locorio rocomLiroro y so Jsoror 2.5 ml, poro irocJlor 25 ml do omLos ipos do modio. LE (poporo do cosoiro 1, NoCl 1, y oxroco do lovodJro C.5} y TE (poporo do cosoiro 1.2, ox- roco do lovodJro 2.4 y plicorol C.1ml}. So ircJ- Loror los Locorios loso Jro dorsidod pico, DC 55C ~ C.25C y so orodioror 2Cmp/ml do lPTC (lsopropyl E D liopolocopyrorosido}, poro irdJcir lo oxpro- sir dol por To DN/ polimoroso y so ircJL odo lo roclo o 37C cor opiocir. Posoriormoro, los cJlivos so corriJporor y lo posillo so rosJspordi or EJor / (Tris 5CmM pH 7., plJcoso 5CmM y EDT/ 1mM } y so lisoror los colJlos por soricocir. NJovomoro so corriJporor los colJlos y so rocJ- por ol soLrorodoro dol cJol so propororor dilJ- cioros (1.2, 1.4, 1.8, 1.1}. Lo ocividod do To DN/ polimoroso so doormir por PCP, ompliicor- do ol rorspor p53 lJmoro, o porir do poromo mJriro. Lo ororior so lizo poro los colJlos provo- rioros do codo modio, LE y TE. nduccin de lo expresin del gen Toq Poro doormiror ol iompo pimo do prodJccir do To DN/ polimoroso, Lsicomoro so lizo lo mis- mo Jo or ol procodimioro ororiormoro doscrio, cor lo diororcio Jo solomoro so crocioror los Loc- orios or ol modio LE, yo Jo como so vor ms odoloro (rosJlodos} or oso so oLJvo moyor oci- vidod orzimico Jo or ol modio TE. So omoror mJosros do 1ml dol cJlivo colJlor codo dos loros dJroro 18l, o porir do lo irdJccir cor lPTC. So propororor oxrocos colJloros, modioro soricocir, y so los doormir lo ocividod do To DN/ polimo- roso, do ocJordo o lo doscrio or ol pJro ororior. Furificocin de Toq DNA polimeroso Uro voz Jo so domosr Jo ol modio LE propor- cioroLo moyor ocividod orzimico y Jo o los dioz loros do ircJLocir so oLorio lo moyor prodJc- cir do To (vor rosJlodos}. So irocJl 1 liro do LE//mp (4Cmp/ml} y so irdJ|o lo oxprosir do lo To cor lPTC, como so doscriLi ororiormoro. So cosocloror los Locorios por corriJpocir y so lo- voror cor EJor /, posoriormoro los Locorios so rosJspordioror rJovomoro or EJor /, cororior- do lisozimo o 4 mp/ml, so ircJL o omporoJro omLioro por 15 mirJos (mir} y so lo odicior Jr volJmor do EJor E (1CmM Tris pH 7., 1mM EDT/, 1mM PMSF, C.5 Twoor2C, C.5 lCEP/L}. El lisodo colJlor so corriJp o 25,CCC rpm por 45 mir or Jr roor S\ 28. /l soLrorodoro oLorido so lo o|Js- lo corcorrocir do KCl o 2CC mM, so pos por Jro colJmro do DE52 (8|C-P^D}, proviomoro pro- porodo y oJiliLrodo cor LJor E. So colocoror roccioros do 5 ml y so comLiroror oJollos Jo or orsoyos do PCP prosororor ocividod do To. Los roccioros so diolizoror odo lo roclo corro ros volmoros do EJor C (HEPES 2CmM, pH 7., EDT/ 1mM, PMSF C.5mM, Twor2C C.5 o lCEP/L C.5}. El diolizodo so pos por Jro colJmro do rosiro Eio Pox 7C (8|C-P^D}, oJiliLrodo cor EJor C, y lo To DN/ polimoroso so olJy cor ol mismo LJor, cororiordo KCl o 2CC mM. So colocoror roccio- ros do 1ml y so los doormir lo ocividod do lo or- zimo modioro Jr orsoyo do PCP. Medicin de lo octividod de Toq purificodo Lo ocividod do lo To pJriicodo so doormir mo- dioro lo ompliicocir dol rorspor lJmoro 53 o 1CPCE CUlLLEPMC CCMEZ C., LUlS C. EEPMDEZ H., PEYES T/MEZ C., 1U/N M/NUEL /D/ME P., PCEEPTC MCNTES DE C. ||||^ |^|| / \O| \, |o `, !|||O||'||`||| .00. `S PPCDUCClCN Y PUPlFlC/ClCN DE L/ T/C DN/ PCLlMEP/S/ / P/PTlP DE E. CCL| PECCMElN/NTE porir do Jr poromo mJriro. Los rooccioros do PCP so roolizoror or volmoros do 25 l, cororiordo 1CC rp do codo oliporJcloido, dosoxiriLorJclo- idos do riosoo o Jro corcorrocir irol do 25C mM, 1CC rp do DN/ pormico y 1 l, yo soo do oxrocos colJloros o roccioros do los colJmros. Los cordicioros dol PCP Joror (C/mir}. Jr ciclo iri- ciol do 4/4, 3C ciclos do 4/1, 5/1, 72/3 y Jr ciclo irol o 72/7. Poro modir lo ocividod do lo or- zimo pJriicodo, osi como sJ colidod, so roolizoror diororos ipos do ompliicocioros (sorcillos y mli- plos} y so Jsoror diororos ipos do omplodos do diororos ospocios. Cororolmoro so Jsoror 1CC rp do DN/ pormico. Almocenomiento de lo Toq DNA polimeroso PJoso Jo so oLJvo Jro orzimo To DN/ polimo- roso cor ocividod Liolpico, os rocomordoLlo olmocororlo y morororlo osoLlo por Jr poriodo lorpo. Por lo oro, docidimos proLor dos diororos EJors do olmocoromioro y morioroor o rovos dol iompo sJ ocividod Liolpico. Lo orzimo pJrii- codo so olmocor or dos diororos ipos do LJor. Eso so llov o coLo cor lo dilisis do lo orzimo pJ- riicodo corro 1CC volmoros do EJor l (HEPES 2CmM, KCl 1CCmM, EDT/ C.1mM, PMSF C.5mM, DTT 1 mM y Clicorol ol 5C} o EJor ll (Tris 1M pH 8, DTT 1mM, EDT/ C.1mM, KCl 1CCmM, Twoor 2C ol C.5, lCEP/L ol C.5 y Clicorol 5C}. Lo orzimo diolizodo so olmocor o -2C`C y so lo do- ormir sJ ocividod do To DN/ polimoroso, o ro- vos dol iompo, o irorvolos do ros mosos. ketuItodot Aislomiento y corocterizocin del gen de lo Toq DNA polimeroso Poro corroLoror Jo rJosro copo rocomLiroro do E.co|| poro ol plsmido pTPC-To so rooliz Jr ois- lomioro do DN/ plosmidico por lo ocrico do miri- prop (vor moodolopio} y so dipiri cor lo orzimo do rosriccir \hol. Yo Jo ol por To posoo ros siios \hol or los posicioros 41 ,154C y 2487 pL, lo diposir dol plsmido cor oso orzimo doLo do pororor lo liLorocir do dos ropmoros do 1C7 y 47pL (ipJros 1 y 2 }. Froduccin de Toq DNA polimeroso en dos di- ferentes medios de cultivo Lo Locorio rocomLiroro so croci or los dos mo- Fip.1. Mopo dol plsmido pTPC-To. M 1 2 1 KK 1 Kb 107 pb 47 pb dios do cJlivo, LE y TE (moodolopio}, so irdJ|o lo oxprosir dol por cor lPTC y so compor lo ocivi- dod do lo orzimo prodJcido or oxrocos colJloros proporodos por soricocir. So proLoror dilJcioros do los oxrocos colJloros (1.2, 1.4, 1.8, 1.1}. Los rosJlodos so mJosror or lo ipJro 3, dordo so oL- sorvo Jo los prodJcos dol orsoyo do PCP sor ms irorsos or los oxrocos colJloros do los Locorios crocidos or LE (corrilos 1 ol 4}, or comporocir cor los oxrocos oLoridos dol crocimioro or TE (corri- los 5 ol 8}. Eso rosJlodo ros irdico Jo oxiso Jro moyor coridod do ocividod orzimico do To DN/ polimoroso or los Locorios crocidos or LE. Cintico del tiempo ptimo de produccin de Toq DoLido o Jo or lo Locorio rocomLiroro ol por do lo To DN/ polimoroso os Lo|o lo ropJlocir dol promoor |oc, ol cJol os irdJciLlo cor lPTC, oro rocosorio doirir ol iompo pimo poro cosoclor los Locorios, dospJos do lo irdJccir cor diclo ir- Fip. 2. Corocorizocir dol plsmido Jo poro ol por do lo To DN/ polimoroso. El plsmido so oisl do lo Locorio rocomLiroro y so dipiri cor lo orzimo /lol. Corril 1 plsmido sir diporir, corril 2 plsmido diporido, y M os ol morcodor do poso molocJlor 1 KL. ||||^ |^|| / \O|\, |o `, !|||O||'||`||| .00. `
1.6 kb 1 kb 0.5 kb Tg p53 M 1 2 3 4 5 6 7 8 LB TB Fip. 3. Doormirocir do lo prodJcividod do To DN/ poli- moroso or dos modios do cJlivo. LE y TE. So ompliic ol rorspor p53 lJmoro (Tpp53}. Los corrilos dol 1 ol 4 corros- pordor o dilJcioros (1.2,1.4,1.8,1.1} dol oxroco colJlor oLorido dol modio LE, los corrilos dol 5 ol 8 sor los dilJcio- ros (1.2,1.4,1.8,1.1} dol oxroco colJlor oLorido dol mo- dio TE. dJcor. DospJos do doormiror lo ocividod do To oLorido do mJosros do cJlivo omodos codo 2 l, o porir do lo irdJccir loso Jr mximo do 18 l, orcorromos Jo lo ocividod do To comiorzo o doocorso o los 4 l, ircromorrdoso proprosivo- moro loso los 1C l do crocimioro y dismirJyor- do o porir do los 12 l (ipJro 4}. Esos rosJlodos irdicor Jo o los 1C l so oLsorvo moyor ocividod do To DN/ polimoroso.
1.6 kb 1 kb 0.5 kb Tg p53 Hrs de crecimiento Post-induccin M 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Fip. 4. Doormirocir dol iompo pimo do irdJccir do To DN/ polimoroso. /cividod do lo orzimo or oxrocos colJloros oLoridos o los iompos irdicodos (2 o 18 lrs} pos- orior o lo irdJccir cor lPTC. Lo ocividod so doormir modioro lo ompliicocir dol rorspor Tp p53. M os ol mor- codor do poso molocJlor 1 kL. Comporocin de lo Toq DNA polimeroso purifi- codo y uno Toq comerciol Lo ipJro 5 so mJosro lo comporocir do lo ocivi- dod orzimico do lo To DN/ polimoroso pJriico- do or comporocir cor Jro orzimo comorciol (EioSoloc}. Poro oso propsio so rooliz Jr orsoyo do PCP poro ompliicor Jr por p53 mJriro or oso- do loorocipoo y Jsordo ros dilJcioros diororos (1.2, 1.4 y 1.8} do omLos orzimos. Los prodJcos do PCP, dol ololo silvosro y dol ololo mJodo, irdi- cor Jo lo To DN/ polimoroso pJriicodo (corrilos 1, 4 y 7} prosor moyor ocividod Jo lo orzimo comorciol (corrilos 2, 5 y 8}. /doms, ol olmocoro- mioro do lo orzimo or Jr LJor diororo ol l (EJ- or ll, moodolopio} ro mo|or lo osoLilidod do lo To DN/ polimoroso pJriicodo (corrilos 3, y }, oso, doLido o Jo rJosro orzimo pJriicodo mos- r oror ipJol o moyor ocividod Jo lo comorciol (5 U/l}.
AM 0.5 Kb 1 Kb P C BII P C BII P C BII M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fip. 5. Comporocir do lo ocividod do lo To pJriicodo (P} y do Jro orzimo comorciol (C}. So ompliic por PCP ol por p53 mJriro, or osodo loorocipoo. /M, ololo mJoro, /S, ololo silvosro. Corrilos 1, 4 y 7 orzimo pJriicodo, corrilos 2, 5 y 8 orzimo comorciol, y corrilos 3, y corrospordor o lo orzimo pJriicodo olmocorodo or EJor ll (Ell}. M os ol mor- codor do poso molocJlor 1KL. Funcionolidod de lo Toq DNA polimeroso / lo orzimo pJriicodo so lo proL sJ loLilidod do ompliicor DN/, o porir do poromos do diororos orporismos y cordicioros do rooccir. Primoro so doormir lo Jrciorolidod do rJosro orzimo poro lo ompliicocir simJlroo do vorios ropioros dol poromo lJmoro (PCP mliplo, ipJro }.
400 pb 100 pb 50 pb M 1 2 3 4 Fip. . PCP mliplo dol Lrozo lorpo dol cromosomo Y Jsor- do lo To DN/ polimoroso pJriicodo. M morcodor do poso molocJlor 5C pL, corrilos 1 ol 4 prodJcos do PCP osporo- dos do ocJordo ol osJclo comorciol. AS 1CPCE CUlLLEPMC CCMEZ C., LUlS C. EEPMDEZ H., PEYES T/MEZ C., 1U/N M/NUEL /D/ME P., PCEEPTC MCNTES DE C. ||||^ |^|| / \O| \, |o `, !|||O||'||`||| .00. `.0 Er oso oxporimoro so Jsoror odos los rooci- vos do Jr osJclo do ompliicocir do diororos ropioros dol Lrozo lorpo dol cromosomo Y, sJsiJ- yordo lo To dol osJclo por rJosro orzimo. El rosJlodo oLorido Jo ol mismo porr do Lordos osporodos, do ocJordo cor ol osJclo comorciol. Por oro lodo, so proL lo loLilidod do lo orzi- mo pJriicodo poro ompliicor DN/ do ovos. Er lo ipJro 7 so mJosro ol rosJlodo Jo corrospordo o Jr procodimioro do soxodo molocJlor do ovos moromricos, or dordo so ompliicoror ropioros ospociicos do los cromosomos soxJolos Z y \. Los moclos posoor dos cromosomos Z y ompliicor Jro solo Lordo (corrilos 1, 2, 4, 5, 7 y } y los lomLros posoor Jr cromosomo Z y Jr \, y ompliicor dos Lordos (corrilos 3, y 8}.
400 pb 100 pb Z M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 W Fip. 7. /mpliicocir do los poros CHD-\ do lo lomLro y CHD-Z dol moclo. Corrilos dol 1 ol 5, ^nozooo |oucocoho||o y corrilos dol ol pororocor o Lo, sp. Estobilidod de lo enzimo purificodo Lo orzimo pJriicodo so olmocor o -2C C C or dos diororos LJors y so morioro sJ ocividod o ro- vos dol iompo, modioro lo ompliicocir por PCP dol Tp p53 lJmoro o porir do poromo mJriro. Er lo ipJro 8 so mJosro ol rosJlodo do lo ocividod do To DN/ polimoroso o los ros, sois y rJovo mo- sos do olmocoromioro (porol /, E y C, rospocivo- moro}. Er los dos primoros porolos so oprocio Jo lo irorsidod do los Lordos os comporoLlo or om- Los LJors, os docir Jo lo ocividod pormoroco similor loso los sois mosos. Por ol corrorio o los rJovo mosos do olmocoromioro (porol C} oxiso Jro ocividod liporomoro moyor or lo orzimo ol- mocorodo or ol EJor l. concIutin y ditcutin Er oso roLo|o so lopr implomoror Jr procodi- mioro poro lo pJriicocir do lo orzimo To DN/
Tg p53 (C) M BII BI M BII BI M BII BI (B) (A) Fip. 8. Morioroo do lo To DN/ polimoroso cor rospoco o sJ ocividod o rovos dol iompo or dos ipos do EJors do olmocoromioro (Ell y El}. Porol /, E y C, orzimo cor 3, y mosos do olmocoromioro. M os ol morcodor do poso molo- cJlor 1KL. polimoroso, o porir do Jro Locorio rocomLiroro do E.co||. Er pororol lo ocividod do lo orzimo pJri- icodo Jo similor o lo do Jro To DN/ polimoroso comorciol Lo|o cordicioros osrdor do rJosro lo- Loroorio. Lo coridod prodJcido o porir do 1L do cJlivo Jo 1CC,CCC U. Dos pJros impororos do rosolor do lo orzimo pJriicodo sor. (1} sJ ropro- dJciLilidod poro ompliicor los ololos dol por ordporo p53 mJriro (ipJro 5}, cor los cJolos ror- molmoro so prosoroLor proLlomos or rJosro lo- Loroorio cor lo orzimo comorciol y (2} lo orzimo pJriicodo ompliic socJorcios do DN/ Locorioro, o porir do DN/ oislodo do o|ido Loviro omLoLido or poroiro, rJovomoro cor moyor roprodJciLili- dod Jo lo orzimo comorciol Jsodo or oso roLo|o (doos ro mosrodos}. /simismo, lo orzimo pJriico- do so lo proLodo or dos osJclos comorciolos, Jro do PCP mliplo poro lo dooccir do microdolocio- ros dol cromosomo. Y, y oro poro rooccioros do PT-PCP or lo ompliicocir do DN/s complomoro- rios lJmoros y virolos (doos ro mosrodos}. Er om- Los cosos ol Jso do lo To DN/ polimoroso pJriico- do Jrcior or ipJol modido Jo lo orzimo To DN/ polimoroso prosoro or ol osJclo. Los comporocio- ros Joror loclos do mororo cJolioivo y ro cJor- ioivo. Firolmoro, lo vido modio do lo To Lo|o cordicioros do olmocoromioro or rJosro loLoro- orio lo sido sJporior o Jr oro. Er corclJsir so implomor Jr procodimioro poro lo prodJccir y pJriicocir do lo To DN/ polimoroso o porir do Jro copo rocomLiroro do Escho|ch|o co||. Agrodecimientot Eso proyoco CN 314-CC Jo opoyodo por ol pro- promo P/lCYT do lo Urivorsidod /Jromo do NJovo Lor. PPCDUCClCN Y PUPlFlC/ClCN DE L/ T/C DN/ PCLlMEP/S/ / P/PTlP DE E. CCL| PECCMElN/NTE ||||^ |^|| / \O|\, |o `, !|||O||'||`||| .00. `. ketumen Er ol prosoro roLo|o so implomor Jr moodo poro lo prodJccir y pJriicocir do lo orzimo To DN/ polimoroso, o porir do Jro copo rocomLiroro do Escho|ch|o co||. So doormir ol iompo do moyor prodJccir or cJlivo, so proLoror dos diororos modios poro ol crocimioro do diclo Locorio y dos diororos LJors do olmocoromioro poro lo orzi- mo pJriicodo. / porir do Jr liro do cJlivo so lopr oLoror orzimo To DN/ polimoroso oJivoloro o 1CC,CCC Jridodos. Eso orzimo pJriicodo so lo Jilizodo or proocolos osrdor do loLoroorio poro lo ompliicocir do socJorcios pormicos do Loc- orios, virJs, ovos, rooros, Loviros y lJmoros, mos- rordo sor ipJol o ms oicioro Jo Jro proporo- cir comorciol. Lo ocividod do lo orzimo pJriicodo lo pormorocido osoLlo dJroro ol moros rJovo mosos do olmocoromioro o -2C C C. Folobros clove. To DN/ polimoroso, PCP, PCP mliplo, PJriicocir. Abttroct lr lo prosor work wo dovolopod o proocol o pro- dJco ord isoloo To DN/ polymoroso o rocomLiror Escho|ch|o co||. \o doormirod lo opimJm imo o To DN/ polymoroso prodJcior. \o osod wo dioror cJlJro modio or lo prowl o lo rocomLiror LocoriJm ord wo dioror soropo LJors or orzymo soLiliy. From oro lior modio cJlJro wo oLoirod 1CC,CCC Jris o soid orzymo. Tlis orzymo wos Jsod or poro ompliicoior rom dioror orporisms sJcl os Lirds, mico, lJmor ord Locorio. Tlo orzymo ociviy los Loor soLlo or o loos riro morls o -2C`C soropo. Keywords. To DN/ polymoroso, PCP, PCP mJliplox, PJriicoior. keferenciot 1. MJllis Kory, Folooro F., Sclor S., Soiki P., Horr C., ord Erlicl H. Espociic Erzymoic /mpliicoior o DN/ |o \||o. Tlo Polymoroso Cloir Poocior. CSH Symp. CJor. Eiol. 185, 51. 23-273, Cold Sprirp HorLor LoL. 2. Soiki P.K., Colord H., Sool S., Sclor P., HipJcli P., Horr T. y MJllis K. Primor-Dirocod Erzymoic /mpliicoior o DN/ wil o TlormosoLlo DN/ Polymoroso. Sciorco 188, 23. 487-41. 3. Lowyor F.C., Sool S., Soiki K., MyomLo K., DrJmmord P. y Colord H. lsoloior, Clorocorizoior, ord Exprossior ir Escho|ch|o co|| o lo DN/ polymoroso poro rom Thonus ouo||cus. 1oJrrol o Eiolopicol Clomisry 18, 24. 427-437. 4. Erpolk D.P., Krikos /., ErJck E. y CirsLJrp D. PJriicoior o TlormJs oJoicJs DN/ polymoroso Exprossod ir Escho|ch|o co||. /rolyicol Eioclomisry 1C, 11. 3-4CC. 5. EirrLoim HC ord Doly 1. / ropid olkoliro oxrocior procodJro or scroorirp rocomLiror plosmid DN/. NJcloic /cids Pos. 17, 7. 1513-23. . CJrosli, S.1., Poss /.P. Mo K. o| o| (1} Polymoroso cloir roocior scroorirp or Y clromosomo microdoloiors. / irs sop owords lo dioprosis o lo poroicolly-doormirod spormooporic oilJro ir mor. /o| |un. Pooo., 2, 775-77. 7. Cpowo, /., MJroo, K. & MizJro, S. (18}. Tlo locoior o Z- ord \-lirkod morkor poros ord soJorco or lo lomomorplic sox clromosomo o lo osricl ord lo omJ. foc. No||. ^coo. Sc|. LS^, 5.4415-18. 8. NokomJro, T., Piclol, 1C., \illioms-Simors, L., \osplol, H. (15}. /r opopoic dooc ir lors diororioior coJsod Ly lJmor p53 is roscJod Ly o mJor ollolo. Proc. Nol. /cod. Sci. US/ 2 142-14. 1CPCE CUlLLEPMC CCMEZ C., LUlS C. EEPMDEZ H., PEYES T/MEZ C., 1U/N M/NUEL /D/ME P., PCEEPTC MCNTES DE C.