PRUEBAS GENETICAS DE FILIACION. ASPECTOS TECNICOS METODOLOGICOS. IDENTIFICACION GENETICA E INDICE DE ABUELISMO Prof. Dr. Vctor B.

Penchaszadeh: (Profesor de Pediatra y Gentica, Albert Einstein College of Medicine y Jefe de Gentica Mdica, Beth Israel, Medical Center, Nueva York, USA. Miembro del Panel de Expertos en Gentica Humana de la Organizacin Mundial de la Salud.)

INTRODUCCION El conjunto de las caractersticas genticas de cada ser humano es nico para cada persona y, con excepcin de los gemelos idnticos, no existen dos individuos con la misma constitucin gentica. El conocimiento de este fenmeno y los avances de la gentica humana en los ltimos decenios, han sido la base del desarrollo de tcnicas de identificacin gentica. Estas se han aplicado en medicina, para transfusiones sanguneas, transplante de rganos e identificacin de restos humanos. Adems, como las caractersticas genticas son heredadas, han servido de base para probar relaciones de parentesco, como en el caso de determinar paternidad de un nio en casos de disputa legal. Cuando la ltima dictadura militar argentina se dedic a secuestrar y desaparecer disidentes, las vctimas incluyeron nios cuyos padres fueron asesinados o que nacieron en cautiverio de mujeres que estaban embarazadas en el momento de su secuestro y desaparicin y que fueron asesinadas luego del parto. Estos nios fueron entregados por los militares como "botn de guerra" a individuos conectados de alguna manera con el poder: personal de seguridad, mdicos militares, amigos de jueces venales, etc. La organizacin Abuelas de Plaza de Mayo se dedic a buscar el paradero de estos nios y a investigar las posibilidades de que los que fueran hallados pudieran ser adecuadamente identificados estableciendo su relacin con sus familias biolgicas. En esta gesta las Abuelas solicitaron ayuda a varios genetistas de diversos pases. Entre los genetistas que colaboraron y desarrollaron la tecnologa para identificar a esos nios desaparecidos se contaron el autor de este artculo: el Dr. Cristian Orrego, entonces con la American Association for the Advancement of Sciences de Estados Unidos; la Dra. Marie-Claire King de la Universidad de Berkeley; el Dr. Fred Alien, del New York Blood Center; el Dr. Pierre Darlu de la Universidad de Paris; y la Dra. Ana Mara Di Lonardo del Laboratorio de Inmunologa del Hospital Durand de Buenos Aires. El resultado de este trabajo colaborativo fue la aplicacin de las tcnicas de identificacin gentica para estimar la probabilidad que un nio determinado, cuyos padres se encuentran desaparecidos, sea nieto de un determinado set de abuelos. Desde 1984 estas tcnicas se han empleado en un nmero grande de casos por mandato judicial y han permitido la identificacin de por lo menos 30 nios hijos de desaparecidos por la dictadura militar. Algunos de estos casos resultaron en controversias de diverso tipo, por razones polticas, familiares, psicolgicas y/o sociales. En estas controversias lo primero en cuestionarse ha sido la validez de las pruebas de identificacin gentica y la certeza de sus conclusiones. El seguimiento de estos temas en los medios de difusin evidenci una gran ignorancia y confusin pblica sobre el significado e interpretacin de estas pruebas. Uno de los objetivos de este trabajo es facilitar la comprensin por parte del pblico no especializado, de un tema en s muy complejo. Lo que sigue a continuacin est basado en la experiencia propia del autor y en las presentaciones de los Dres. Wilma Bias, Jos Antonio Ocariz, Daniel Corach y Marie-Claire
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King en el Panel de Gentica del Seminario de Identificacin, Localizacin y Restitucin realizado en Buenos Aires del 18 al 20 de abril de 1992.

LA GENETICA EN POCAS PALABRAS El material hereditario est constituido por genes. Los genes son segmentos de la molcula hereditaria cido desoxiribonucleico o ADN, que contiene la informacin necesaria para que las clulas del cuerpo fabriquen productos con funcin biolgica, tales como enzimas, hormonas, grupos sanguneos y otras protenas. El organismo humano cuenta con aproximadamente 50.000-100.000 genes, que en conjunto constituyen el genoma del individuo. Los genes existen de a pares llamados alelos. Cada par de genes alelos es responsable de la fabricacin de un producto determinado: por ejemplo, insulina, hormona de crecimiento, grupo sanguneo Rh, etc. De cada par de alelos, un ejemplar proviene del padre y el otro de la madre. En el ejemplo anterior, todo individuo tiene un par de genes alelos del grupo Rh: un alelo Rh materno y otro alelo Rh paterno. Los genes estn ubicados en estructuras llamadas cromosomas, que se encuentran, tambin en pares, en el ncleo de cada clula del cuerpo. El sitio en el cromosoma que le corresponde a cada gen se llama locus (del latn: lugar; plural: loci): as, existe un locus para el gen de la insulina, un locus para el gen del grupo Rh, etc. Una caracterstica esencial del genoma es su variacin. Es decir que los genes alelos que constituyen una pareja no siempre son idnticos entre s. Un ejemplo de este fenmeno es el grupo sanguneo AB0. Los grupos sanguneos estn determinados por sustancias adheridas a la superficie de los glbulos rojos. Estas sustancias se llaman antgenos y son producidas por genes. Existe un locus gnico en un par cromosmico con dos genes alelos que determinan el grupo sanguneo AB0. Se conocen por lo menos tres variantes de genes alelos que pueden ocupar el locus AB0: el A, el B, y el 0. O sea que el par de alelos en el locus AB0 puede estar constituido por dos A (AA), dos B (BB), dos 0 (00), un A y un B (AB), un A y un 0 (A0), o un B y un 0 (B0). Cada una de esas combinaciones se llama genotipo. Este trmino se puede usar en forma particular, para describir la combinacin de alelos en un locus, o en forma general, refirindose a las combinaciones de varios loci, o del total del genoma. Los genotipos AA y A0 determinan el grupo sanguneo "A", los genotipos BB y B0 determinan el grupo "B", mientras que el genotipo 00 determina el grupo "0". Cuando los dos alelos son idnticos (p. ej. AA, BB, 00) se dice que el individuo es homocigota en ese locus; si los alelos son diferentes (p. ej. AB, A0, B0), se dice que el individuo es heterocigota en ese locus. La transmisin hereditaria del material gentico se hace a travs de las clulas reproductivas: el espermatozoide en el varn y el vulo en la mujer. A diferencia de las dems clulas del organismo, las clulas reproductivas poseen una sola copia de cada gen. Para cada par de alelos, el azar determina cual de los dos va a cada vulo o espermatozoide. Es decir que un progenitor transmite a su hijo un miembro de cada par de genes alelos de su genoma. En el ejemplo del grupo sanguneo AB0, una persona con el genotipo AB puede transmitir el alelo A o el B; un individuo A0 puede transmitir el A o el 0, etc. Lgicamente, una persona homocigota (AA, BB, 00) slo puede transmitir un slo tipo de alelo. Una persona slo puede transmitir a sus hijos los alelos que dispone, y un hijo slo puede heredar alelos que estn presentes en sus padres. Por ello, conociendo qu alelos de un locus determinado estn presentes en los padres, se pueden predecir los alelos posibles en los hijos. Y viceversa, conociendo los alelos de un locus en una persona, se sabe que cada progenitor debe tener uno de ellos. La variacin gentica descripta para el locus ABO est presente en la mayora de los miles de loci que componen el genoma. Algunos de los genes con mayor variedad son aqullos que
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determinan los antgenos de histocompatibilidad HLA. Estos antgenos son sustancias adheridas a la superficie de los glbulos blancos que determinan la respuesta inmunolgica a los trasplantes. Los antgenos HLA son producidos por clulas inmunes de acuerdo a informacin de varios genes HLA, denominados con letras: el A, el B, el C, y el D son los que se analizan ms comnmente. Cada gen de HLA ocupa un locus especfico y existen decenas de alelos diferentes para cada uno. Las combinaciones posibles de alelos de HLA en un individuo son tantas que es casi imposible que dos personas no emparentadas puedan tener la misma combinacin. Por eso los antgenos HLA se usan tanto en identificacin humana (Dupont, 1989). Con 50.000 a 100.000 genes que constituyen el genoma, y con la posibilidad de muchas variantes alternativas en la mayora de ellos, las combinaciones posibles de alelos en cada clula reproductiva, y por ende en cada individuo, es prcticamente infinita. .De hecho, no existen dos personas con un set idntico de todos los genes del genoma (excepto los mellizos idnticos). Con el desarrollo de la gentica se ha descubierto que no todo el ADN contiene informacin que se traduce en la fabricacin de productos con funcin biolgica. En efecto, existen segmentos de ADN entre y dentro de los genes que no codifican para ningn producto. Significativamente, son estos segmentos los que presentan la mayor variabilidad gentica. A esta altura, podemos preguntarnos: Cul es la base molecular de la variacin gentica? El ADN es una cadena formada por cuatro bases: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). La identidad de la molcula de ADN est dada por la secuencia especfica de estas cuatro bases a lo largo de la cadena. La variacin gentica est dada por cambios en la secuencia y/o nmero de bases: puede faltar una base, puede haber un cambio de una base por otra, puede haber una secuencia repetitiva de una base de mayor o menor longitud, etc. Cuando estos cambios ocurren en segmentos de ADN que codifican determinados productos, se observa un cambio correspondiente en el producto. Por ejemplo, los diferentes tipos de HLA obedecen a modificaciones en la secuencia de ADN en cada uno de los loci correspondientes. Ya hemos visto que la variacin gentica es la base de la identificacin gentica y del establecimiento de lazos de parentesco. Los rasgos genticos que se prestan para este objetivo son aquellos que tienen un alto grado de variabilidad (nmero alto de alelos alternativos) y que son relativamente fciles de detectar en la sangre. Por eso se llaman marcadores genticos. Los marcadores genticos se pueden analizar de dos maneras: se puede estudiar la variacin en los productos (por ejemplo, determinando los grupos AB0, HLA, etc.), o en el propio ADN.

ANALISIS GENETICO DE PRODUCTOS Los productos cuyas variaciones se estudian para anlisis de filiacin son numerosos y su utilizacin ha variado con el desarrollo de esta disciplina. Entre estos se cuentan: los grupos sanguneos de los glbulos rojos de los cuales hay varios (AB0, Rh, Kelly, Lewis, etc.), ciertas protenas sricas, y los antgenos de histocompatibilidad HLA-A, HLA-B, HLA-C y HLA-DR. Estos ltimos han reemplazado a todos los dems pues son los ms variables: hay ms de 20 alelos diferentes de HLA-A, ms de 40 alelos de HLA-B, ms de 40 alelos para HLA-DR, etc. (Dupont. 1989). La combinacin de los alelos en los loci de HLA se denomina haplotipo: cada persona tiene dos haplotipos: uno heredado del padre y el otro heredado de la madre. Un ejemplo de haplotipo sera: A1-B18-DR4. La probabilidad que dos individuos no emparentados compartan los mismos dos haplotipos de HLA es bajsima. La tcnica tradicional de anlisis de tipo de HLA se basa en la tipificacin serolgica. Algunos alelos de estos marcadores genticos son ms frecuentes en la poblacin y otros son menos frecuentes;
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adems, la frecuencia de los distintos alelos vara segn los diversos grupos tnicos. Como veremos mas adelante, el conocimiento de la frecuencia poblacional de los diferentes marcadores genticos es fundamental en las pruebas de parentesco.

ANALISIS GENETICO DIRECTO DEL ADN NUCLEAR Como se dijo arriba, el ADN es la molcula hereditaria que se transmite de padres a hijos, cuyas unidades de informacin, llamadas genes, codifican la produccin de protenas en las clulas. El 99% del ADN se encuentra en los cromosomas, en el ncleo de las clulas. Por eso se denomina ADN nuclear. Cada hijo recibe el 50% de su ADN nuclear de cada progenitor. Una pequea fraccin del ADN se encuentra en organelas del citoplasma de las clulas llamadas mitocondrias, y contiene genes que codifican enzimas relacionadas con la respiracin celular: este es el ADN mitocondrial. Cuando se forman los espermatozoides en el varn, las mitocondrias desaparecen; es decir, no hay transmisin de mitocondrias del padre a los hijos. En cambio, las mitocondrias maternas s permanecen en los vulos y son transmitidos a los hijos de ambos sexos. Es decir que las mitocondrias de un individuo se heredan por va materna: madre, abuela materna, bisabuela materna, etc. La variacin detectada en todos los productos gnicos (los grupos sanguneos, antgenos HLA, enzimas, etc.) es debida a variaciones en la secuencia de ADN en los genes que los codifican. Los avances en la tecnologa del ADN en la dcada de los 70 allanaron el camino para la deteccin de la variacin gentica en secuencias especficas de ADN y determin un cambio en la direccin del estudio de la variacin gentica, de los productos del ADN, al ADN mismo. Las investigaciones han demostrado gran variacin entre individuos en la secuencia de bases del ADN, tanto en regiones (genes) que codifican protenas como en regiones que no codifican productos (National Research Council, 1992). Un tipo de variacin en el ADN es debida a cambios en una base (por ejemplo, en un sitio determinado, una adenina en lugar de una guanina). Se estima que dos individuos no emparentados tienen una diferencia en la secuencia de ADN cada 500 bases (el total de bases del genoma se estima en 3 mil millones). Otro tipo de variacin se basa en que ciertas regiones del ADN, particularmente aqullas que no codifican productos, contienen secuencias de bases repetidas en tndem. Estos segmentos se llaman repeticiones numricas variables en tndem (VNTR, por las iniciales en ingls). La unidad repetida puede ser de slo dos bases (p. ej., timina-guanina, repetida numerosas veces) o tan grande como de 30 bases o ms. La variacin entre individuos radica en la longitud del segmento repetido: una persona en un sitio determinado puede tener un segmento repetido 3 veces, mientras que otra persona puede tener en ese mismo sitio una repeticin de 20 veces. Dado que estas repeticiones ocurren generalmente en zonas que no codifican productos, la longitud de la repeticin no tiene trascendencia alguna para la salud. Sin embargo, aportan un elemento muy valioso para la identificacin gentica, y ya se estn usando en medicina forense, por ejemplo para asignar una muestra de sangre, semen, u otro tejido a un individuo determinado en situaciones criminales Adems, dado que todas las variaciones en el ADN son hereditarias, tambin se utilizan para determinar relaciones de parentesco, como veremos pronto. Estas dos formas principales de variacin del ADN (cambios de a una base y VNTRs) pueden detectarse analizando ADN de cualquier clula de un individuo, mediante tcnicas especiales. En primer lugar, se debe extraer el ADN de las clulas. El paso siguiente es someter el ADN a la accin de enzimas de restriccin, que tienen la facultad de "cortar" la molcula en segmentos cortos. La longitud de estos segmentos vara en funcin de si hay o no cambios en la secuencia de bases (es decir, si hay o no variacin gentica). Luego se somete la muestra a electroforesis, con lo cual los segmentos de ADN se separan de acuerdo a su tamao,
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apareciendo en forma de bandas ubicadas a distintas alturas en relacin a su tamao. Esta tcnica se conoce con el nombre tcnica de Southern, y cuando se la aplica para determinar genotipos de loci altamente variables, se habla de tipeo de ADN por "huellas digitales de ADN" ("fingerprinting") (Jeffreys et al., 1985). Esta denominacin no es muy feliz, pues si bien no hay dos individuos con exactamente las mismas huellas digitales, la variacin en stas tiene un origen predominantemente no gentico, mientras que el ADN es obviamente gentico y hereditario. La tecnologa de anlisis de ADN para identificacin humana y establecimiento de relaciones de parentesco entre individuos se est desarrollando a pasos acelerados. Hay muchas variaciones en las tcnicas y cada laboratorio se especializa en un tipo de tcnica. Algunos usan "sondas" de ADN para identificar segmentos de ADN ubicados en varios sitios del genoma, mientras que otros determinan la variacin en unos pocos loci seleccionados. Estas tcnicas recin ahora se estn comenzando a estandarizar en Estado Unidos por el Federal Bureau of Investigations (FBI) para su uso en medicina forense.

ANALISIS GENETICO DIRECTO DEL ADN MITOCONDRIAL Como se explic arriba, las mitocondrias se heredan slo por va materna y contienen genes que codifican diversas enzimas respiratorias. A diferencia del ADN nuclear, que existe por duplicado (diploide) y que vara entre hermanos, el ADN mitocondrial existe en una sola copia (haploide) y cada individuo tiene exactamente el mismo patrn que sus hermanos, su madre, tos maternos, abuela materna, primos por va de las hermanas de la madre, y as de seguido. El ADN mitocondrial ha sido secuenciado en su totalidad (es decir que se conoce toda su secuencia de bases) se ha evidenciado que existe una altsima variacin entre individuos no emparentados. En particular, la regin de control del ADN mitocondrial, que no codifica ningn producto, es altamente variable entre individuos. Las investigaciones de varios autores (Aquadro y Greenberg, 1983; Orrego y King, 1990; DiRienzo y Wilson, 1991) han demostrado que analizando una zona hipervariable de 347 bases de la regin de control, la probabilidad que dos individuos no emparentados puedan tener una secuencia idntica por azar es de 1 en 370. Esta probabilidad depende de dos factores principales. En primer lugar, qu regin y longitud del ADN mitocondrial se analice. Obviamente cuanto ms variable sea la regin analizada y cuantas ms bases se secuencien, menor ser la chance que dos individuos no emparentados tengan idntica secuencia (es decir, mayor ser la probabilidad que una secuencia idntica indique parentesco por va materna). El otro factor que influye en la probabilidad que una secuencia idntica indique parentesco materno directo, est relacionado con aspecto complejos de gentica poblacional, cuya explicacin en detalle no cabe aqu (tasa de endogamia en la poblacin, grupos tnicos, etc.).

USO DE MARCADORES GENETICOS EN PRUEBAS DE FILIACION La identificacin positiva de relaciones de parentesco en base al anlisis de marcadores genticos, depende de cuntos y qu tipos de marcadores estudiemos de las personas investigadas, es decir, cuntos loci estudiemos en ellos. Como ya se explic arriba, hay marcadores ms discriminantes que otros. Hoy en da, los anlisis directos del ADN, ya sea nuclear o mitocondrial, brindan mucha ms seguridad a las conclusiones. Es claro que dos individuos que poseen un mismo patrn de alelos en un solo locus no necesariamente estn emparentados. Sin embargo, cuanto mayor sea el nmero de loci analizados, mayor ser la probabilidad que dos personas que compartan los mismos marcadores de acuerdo a los patrones de herencia pertenezcan a la misma familia. Por otra parte, hay loci ms aptos que
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otros para ser usados en identificacin. La regla es que cuanto ms variacin exista en un locus, menor ser la probabilidad que dos individuos tengan un mismo alelo por azar, y entonces ms apto ser ese locus para revelar filiacin. Adems, en cada locus hay alelos ms frecuentes y alelos menos frecuentes. Si dos individuos comparten un alelo que tiene una frecuencia muy baja en la poblacin, es ms probable que sean parientes que si comparten un alelo muy frecuente. Las pruebas genticas de parentesco se han utilizado desde hace muchos aos en disputas legales de paternidad. Hasta hace poco era universal el uso exclusivo de los marcadores de antgenos HLA determinados serolgicamente. En casos de duda, se agregaban marcadores de ADN nuclear. En Estados Unidos, hoy se tiende cada vez ms a analizar directamente los marcadores de ADN nuclear, pues son ms fciles de determinar y dan una mayor certeza. La demora en incorporar estas pruebas se debe a la falta de experiencia de los tribunales en estos mtodos y a problemas tcnicos que se han ido superando. A continuacin se explicarn los conceptos bsicos del anlisis de paternidad tradicional, pues son los mismos en los que se basan los estudios para identificara los abuelos de los nios secuestrados en Argentina. Los conceptos son los mismos ya sea que se trate de marcadores clsicos de productos (HLA) o marcadores de ADN nuclear. Al final haremos consideraciones con respecto al uso del ADN mitocondrial, que tiene caractersticas especiales. En las disputas de paternidad la pregunta que se formula es: ante un nio de quien no se conoce el padre, cul es la probabilidad que un individuo determinado es el padre? Aqu el concepto clave es el de probabilidad, que estar siempre presente en todas las consideraciones que siguen. En teora, nunca se puede probar con un 100% de certeza que un individuo es el padre de otro. Sin embargo s se puede llegar a establecer que la probabilidad de que lo sea es, por ejemplo, 99,99%. El primer paso es analizar marcadores genticos en la madre, el nio y el supuesto padre. Si este individuo no es el verdadero padre, el nio poseer marcadores genticos paternos que no se encuentran en l. Si los marcadores del individuo incriminado no se encuentran en el nio, es prueba que no es el padre. En la prctica, usando marcadores de HLA es posible excluir paternidad en la casi totalidad de casos en los que el padre supuesto no es el padre verdadero. Esto quiere decir que cuando no hay exclusin, la probabilidad que el individuo incriminado sea el padre es altsima. En un ejemplo con marcadores de HLA, supongamos que el nio es A 1,18; B3,9 (es decir en el locus HLA-A tiene los alelos 1 y 18, y en el locus HLA-B tiene los alelos 3 y 9) y la madre es Al ,4; B3,12. En este caso el nio recibi de su madre al alelo Al y el B3, o sea que el padre debe necesariamente tener los alelos A 18 y B9. Si el individuo incriminado no posee ambos alelos no es el padre. La exclusin es siempre absoluta con una certeza del 100% y basta para probarla que haya discordancia en un solo locus, an cuando haya concordancia en los dems. Ahora supongamos en ese caso que el padre supuesto tiene marcadores HLA A4,18; B 7.9. En este caso no hay exclusin, y este individuo podra ser el padre verdadero pues posee los alelos A 18 y B9, pero esto tambin podra ocurrir por coincidencia. La probabilidad que este individuo sea efectivamente el padre se denomina probabilidad de inclusin de paternidad o ndice de paternidad. La probabilidad de inclusin se determina por clculos matemticos complejos que generalmente requieren la ayuda de programas de computacin, y que tienen en cuenta el nmero y tipo de marcadores analizados, su variabilidad, y la frecuencia de sus diferentes alelos en la poblacin. Este ltimo dato es crucial para saber cul es la probabilidad de que una concordancia dada pueda ser producto del azar. En principio, la probabilidad de inclusin nunca llega a 100%, pues la chance del azar nunca se puede excluir absolutamente. En casos de no-exclusin, sin embargo, se usa un gran nmero de marcadores para disminuir al mnimo la probabilidad de coincidencias al azar. Es decir, la concordancia para decenas de marcadores "vale" ms que la concordancia para uno solo. Adems, hay marcadores que "valen" ms que otros: cuanto ms variable sea un marcador en la poblacin, ms valioso ser
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para discriminar entre coincidencia y prueba. Adems, como se describi arriba, cuando la concordancia es de un alelo muy raro en la poblacin, la probabilidad de parentesco es mayor que si el alelo es muy frecuente. Para los marcadores tradicionales, los tribunales suelen requerir probabilidades de inclusin por encima del 95% para determinar paternidad. Hay que recordar que adems de las pruebas genticas, existen evidencias circunstanciales que tambin son tomadas en cuenta por los jueces. Con el advenimiento de los marcadores de ADN, la certeza que adquieren estas pruebas es mucho mayor, y cuando no hay exclusin la probabilidad de inclusin de paternidad no baja del 99%. Ahora bien, cmo utilizar estas pruebas para probar relaciones de parentesco cuando los padres estn desaparecidos, como es el caso de los nietos de las Abuelas de Plaza de Mayo? Obviamente, todas las caractersticas genticas de los nios en cuestin provienen de sus padres, y los genes de stos, a su vez, provienen de los abuelos. Por lo tanto, se pueden probar estas relaciones familiares analizando a los abuelos supuestos de los nios localizados. La suposicin de que determinados individuos pueden ser los abuelos de nios de padres desaparecidos, surge de evidencias circunstanciales. Este es el tipo de evidencias en que la Abuelas se han hecho expertas por necesidad: denuncias annimas, parecidos fsicos, coincidencias de fechas y lugar, adopciones dudosas, etc. En caso de que los padres supuestos estn desaparecidos es necesario hacer una modificacin de las formulaciones matemticas de la probabilidad de inclusin de paternidad para tener en cuenta esa situacin. En estos casos, no se habla de probabilidad de inclusin de paternidad, sino de probabilidad de inclusin de abuelidad, o ndice de abuelidad, es decir la probabilidad, expresada en porcentaje, que un set de abuelos supuestos sean efectivamente los abuelos reales de un nio determinado. Los principios son exactamente los mismos que en las pruebas de paternidad. Lo que vara es que los genotipos de los desaparecidos que podran ser los padres del nio deben inferirse del estudio de los genotipos de sus padres, es decir de los abuelos supuestos del nio. Ac aparecen ms incertidumbres, pues no se tiene la certeza de los genotipos de los padres, sino una inferencia. Las mejores situaciones son cuando los cuatro supuestos abuelos estn disponibles para estudio, y hay adems parientes colaterales como ser hermanos de los padres supuestos desaparecidos y sus descendientes (posibles tos y primos del nio). En estos casos se puede deducir los genotipos de los padres supuestos con casi la misma certeza que si se los analizara directamente. Sin embargo, en varios casos reales de nios localizados, la familia biolgica supuesta dista mucho de estar completa, por desaparicin de hermanos de los supuestos padres o por fallecimiento de abuelos. Como siempre, el primer paso en cada caso es intentar la exclusin de abuelidad de aquellos abuelos supuestos, cuya posibilidad de ser los abuelos del nio ha surgido de evidencias circunstanciales. Si se excluye la relacin de parentesco directa, se debe calcular la probabilidad de inclusin. Cada caso que se estudia representa un desafo a las tcnicas de identificacin gentica y al poder de la metodologa estadstica que establece la probabilidad de inclusin de abuelidad. El primer caso de identificacin positiva de un nio localizado fue el de Paula Logares, efectuado en 1984 gracias al estudio de antgenos de HLA con una probabilidad de inclusin de 99,8% (DiLonardo AM y col., 1984). Posteriormente, se efectuaron decenas de pruebas en otros tantos nios sospechados de ser hijos de desaparecidos y sus abuelos supuestos. En muchos casos, la supuesta "abuelidad" fue excluida, lo que sin embargo mantiene la posibilidad de que el nio en cuestin sea hijo de otros padres desaparecidos. En varios casos, la supuesta abuelidad no fue excluida y se obtuvieron altas probabilidades de inclusin, con posterior restitucin de los nios a sus familias biolgicas. Un ejemplo de exclusin inicial de parentesco e inclusin posterior en otra familia, es el caso de los mellizos Reggiardo-Tolosa, que inicialmente se pens que pudieran ser los hijos del matrimonio Rosetti-Ross. En este tema la posibilidad de error est presente en cada paso. Desde la seleccin de los familiares a estudiar, la confusin de muestras, la seleccin de los marcadores a analizar, el
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desconocimiento de la frecuencia de los marcadores utilizados en la poblacin de nuestro pas, etc. Factores adicionales que pueden confundir incluyen la falta de evidencias circunstanciales, los errores de laboratorio, la falta de informatividad de las pruebas, la inexistencia de los cuatro abuelos y la necesidad de recurrir a parientes colaterales, con la consiguiente "rebaja" del poder de discriminacin de los anlisis, y muchos ms. Finalmente, hay que recordar que la probabilidad de inclusin es siempre una probabilidad, y nunca llega al 100%. El azar puede intervenir y llevar a una conclusin equivocada. El caso trgico de la nia Juliana, adoptada por la familia Trevio durante la dictadura militar, y que bien podra ser hija de desaparecidos, sirve para recordarnos la posibilidad de conclusiones errneas. Juliana fue identificada errneamente como hija de la pareja Sandoval-Fontana pues la probabilidad de inclusin con marcadores de HLA fue muy alta (99.8%). Es posible que si se hubieran estudiado otros familiares colaterales en su momento se hubiera excluido esa posibilidad desde el principio. La exclusin luego se hizo por anlisis de ADN. Recientemente se ha usado el anlisis del ADN mitocondrial para el estudio de varios casos (King, 1991). Un caso notorio fue el de un nio que por evidencias circunstanciales se pens que podra estar relacionado con las familias Lpez Guerra, Belaustegui Herrera y Weisberg, varios de cuyos integrantes fueron desaparecidos por la dictadura, incluyendo dos parejas que estaban embarazadas. El ADN mitocondrial en esta familia sirvi para excluir parentesco pues se encontraron varias diferencias en la secuencia del nio con respecto a los supuestos familiares de la rama materna de las parejas desaparecidas.

CONCLUSION Los anlisis genticos para determinar identidad y relaciones de parentesco tienen un gran poder de resolucin y bien usados pueden jugar un papel trascendente en la reparacin de las injusticias y violaciones a los derechos humanos que se cometieron durante la pasada dictadura militar. Efectivamente, al identificar a nios secuestrados y relacionarlos positivamente con sus familias biolgicas, se efectiviza uno de los derechos fundamentales del nio que es el derecho a su identidad, a su historia y a su familia. La responsabilidad de la sociedad y los medios de comunicacin masiva es que no se usen pretextos como el de que las pruebas "no sirven", para impedir la accin de la justicia. Estas pruebas han demostrado su valor y poder en muchas partes del mundo, donde son reconocidas ampliamente por la justicia. Por supuesto que dada la enorme trascendencia que estos anlisis tienen para la vida de los protagonistas (los nios y sus familiares), es imprescindible que sean realizados con la mxima idoneidad y calidad, y que sean interpretados con suma cautela y sin presiones de ninguna naturaleza.

BIBLIOGRAFIA Aquadro Cf., Greenberg BD (1983). Human mitochondrial DNA variation and evolution analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics 103: 287-3/2. DiLonardo AM, Darlu P., Baur M., Orrego C., King MC (1984). Human genetics and human rights: identifying the families of kidnapped children. Am J Foren Med Pathol 5:339-347. DiRienzo A, Wiisnn AC (1991). Branching pattern in the evolutionary tree for human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA.
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Dupont B (1989). Inmunobiology of HLA. Springer Verlag, New York. Jeffreys AJ, Wiison V, Thein SL (985). Individiial-specific "fingerprnts" of human DNA. Nature 316:76-79. Kng MC (1991). An application of DNA sequencing to a human rights problem. Molecular Genetic Medicine 1:117-131. National Research Council (1992). DNA Tecnology in Forensic Science. National Academic Press, Washington. Penchaszadeh VB (1992). Abduction of children of political dissidents in Argentina and the role of human genetics in their restitution. J Public Health Policy 13: 291-305. Orrego C, King MC (1990). Determination of familial relationships: En "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" (Innis M, Gelgand D, Sninsky J, White T, editores), pp. 416-426. Academic Press, San Diego.