Componentente monoclonal como marcador tumoral

Marcador tumoral ideal?

DIAGNSTICO PRONSTICO MONITORIZACIN

TRATAMIENTO El CM est directamente relacionado con la masa del clon de clulas B que lo producen

QU VAMOS A VER:

DETECCIN DEL CM EN SUERO Y EN ORINA. CUANTIFICACIN DEL CM EN SUERO Y ORINA. IDENTIFICACIN DEL CM EN SUERO Y ORINA. CADENAS LIGERAS LIBRES EN SUERO.

PROCESOS DEL ESTUDIO DE UNA GAMMAPATA MONOCLONAL DE NUEVA APARICIN

DETECCIN

CUANTIFICACIN

IDENTIFICACIN

Electroforesis Gel de Agarosa

Densitometra

Inmunofijacin

Electroforesis capilar

Espectrofotometra UV

Inmunotipado

Se requiere estudio simultaneo en suero y orina.

REQUERIMIENTOS DE LABORATORIO

FASE PREANALTICA
Suero! evitando la hemlisis y procesar el mismo da de la extraccin o congelar la muestra. Ori"a de #$ %ora&

FASE ANALTICA:
Electroforesis en gel de Agarosa o electroforesis capilar (preferida), para la deteccin del CM. Cuantificacin de protenas totales por m todos colorim tricos, tur!idim tricos o nefelom tricos. "dentificacin del componente monoclonal mediante inmunofi#acin (preferi!le) o inmunotipado.

FASE POST ANALTICA

Emisin del informe de la!oratorio, ad#untando los resultados del proteinograma, #unto con su gr$fica y la interpretacin correspondiente del perfil. Cuantificar el CM siempre %ue sea posi!le, tanto en suero como en orina.

PROCESO DE DETECCIN
&'()AME(*+ )E, -.+CE/+ E,EC*.+&+.0*"C+ E( 1'0 /E 2A/A3

METODOS DE DETECCI-N +. ELECTROFORESIS EN /EL DE A/AROSA

Fraccio"e& 'al()mi"a'al*a +'al*a#'(eta',ama

CUANTIFICACIN DE PROTEINAS

Mtodos colorimtricos:

Biuret Verde bromocresol

Protenas totales.

Albmina, Inmunoglobulinas, Beta2 microglobulinaetc.

1. Electroforesis en gel de agarosa.

Lectura densitomtrica
proporcional a la cantidad de colorante fijado en cada fraccin.

1. Inspeccin visual del gel. 2. Revisin del perfil electrofortico.

A/G : 1,45 (1,2-1,8)

PT: 70 g/L

METODOS DE DETECCI-N #. ELECTROFORESIS CAPILAR

La separacin se realiza en un capilar de slice fundida de dimetro muy pequeo, presentando un detector de lectura UV al final del capilar (lectura a 200 nm directamente proporcional a la cantidad de enlace peptdico de la muestra.

Mtodo rpido y sensible, totalmente automatizado, basado en la separacin de partculas cargadas que migran a una diferente velocidad bajo la accin de un campo elctrico.

COMPARACIN DE MTODOS
Electroforesis en gel de agarosa: Sensibilidad menor 1 g/L, segn recomendaciones National Academy of clinical Biochemistry (NACB). Cuantificacin del CM por densitometra, (depende del tipo de colorante, violeta cido ms sensible que negro amido). Ms costosa, semimanual. Electroforesis capilar: Sensibilidad hasta 0,2 g/L en gama y 0,5 g/L en beta. Cuantificacin del CM por espectrofotometra (mide enlace peptdico). Rpido, totalmente automatizado. Actualmente el mtodo ms utilizado.

Criterios de calidad:

LIMITACIONES

Falsos positivos: -Fibringeno y sus productos de degradacin. -Protena C reactiva. -Hemlisis. -Muestras contaminadas o sometidas a procesos de congelacin descongelacin. -Administracin endovenosa de contrastes yodados.

Falsos negativos: -CM dbiles -CM dbil superpuesto a una banda. -Inmunoglobulinas polimerizadas (bandas de aspecto policlonal). -Crioglobulinas.

Utilizar siempre muestras de suero reciente o en su defecto congelar la muestra.

Son relativamente estables a 4 C la Ig A e Ig G. Ig M tiende a desnaturalizarse. Ig D muy sensible a proteasas. Ig E poco estable.

UTILIDAD CLNICA E INTERPRETACIN DEL PROTEINOGRAMA

Por la complejidad de los perfiles que nos podemos encontrar, es fundamental un mnimo de informacin clnica en la solicitud del proteinograma que ayude a la correcta interpretacin. El informe de laboratorio debe aportar siempre la interpretacin del perfil, junto con el trazado electrofortico (grfica).

UTILIDAD CLNICA E INTERPRETACIN DEL PROTEINOGRAMA

VALORACIN DEL ESTADO GENERAL DEL INDIVIDUO:

-Sndrome inflamatorio (aumento alfa1 y alfa2. -Hemlisis intravascular (disminucin de alfa2). -Estados carenciales (aumento de transferrina en beta). -Deteccin de cirrosis (puente beta-gamma). -Deteccin de enfermedades infecciosas, autoinmunes o sistmicas (cambios en alfa1, alfa2, beta y sobre todo gamma). -Deteccin de dficit congnito o adquirido de protenas : albmina, alfa-1-antitripsina, inmunoglobulinas. -Evaluacin y seguimiento de lesin heptica (cirrosis o hepatitis), lesin renal (sndrome nefrtico) y lesiones digestivas.

DETECCIN DE GAMMAPATAS MONOCLONALES: Diagnstico, pronstico, seguimiento, evaluacin de tratamiento

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN ALBMINA:

,a al!4mina es un par$metro importante para el estadia#e de MM5 "// ,a me#or forma de cuantificarla es la nefelometria m todo de !romocresol ( independiente de pico M) *ener en cuenta %ue altos niveles de CM tienden a so!reestimar su valor

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN ALFA 1:

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN ALFA 2:

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN BETA:

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN GAMA:

EJEMPLOS DE PERFILES ELECTROFORTICOS

ALTERACIONES EN FRACCIN GAMA:

El CM puede aparecer tambin en beta o incluso en alfa 1. Tambin se pueden observan 2 CM (gammapata biclonal).

3 o ms bandas monoclonales, que reflejan sntesis de anticuerpos frente a varios antgenos.

BANDAS OLI/OCLONALES
Los anticuerpos del perfil oligoclonal son predominantemente del isotipo Ig G-Kappa y pueden corresponder con:
-Autoanticuerpos: -Anticuerpos frente a protenas vricas: -Respuestas autoinmunes en pacientes transplantados bajo terapia inmunosupresora. -Respuestas inmunes en individuos sanos (1-5%).

,a deteccin del perfil oligoclonal es muy frecuente encontrarlo en 0acie"te& co" mieloma tra&0la"tado& 1+2345'6 ,os tratamientos actuales (!orte6omid, lenalidomida, !emdamustina..) favorecen en un 789 su aparicin. "mportante la deteccin y vigilancia regular de la evolucin del aspecto oligoclonal de las "gs. Puede &er i"ter0retado de *orma err7"ea como reca8da. /e:alar %ue esta !anda es diferente de la paraproteina original. E" el i"*orme &e de(er8a5 descri!ir la !anda (tipo); aproximadamente la cantidad en gr<, so!re un fondo de glo!ulinas policlonales.

METODOS DE CUANTIFICACIN DEL CM

Gel agarosa: densitometra.

Refleja cantidad de colorante fijado a la protena.

Electroforesis capilar: espectrofotometra directa en zona UV.

Medida de absorbancia ms exacta, al ser directamente proporcional a la cantidad de enlace peptdico.

Estimacin cuantitativa del CM.

ELECTROFORESIS DE PROTENAS SUERO

albmina alfa 1

alfa2 Beta Gamma

gamma

5 +2

ESPECIFICACIONES ANALTICAS DE CALIDAD BASADAS EN LA VARIACIN BIOLGICA

Documento de consenso de la Sociedad Espaola de Bioqumica clnica (SEQC 2009). Tanto la electroforesis en gel de agarosa, como la electroforesis capilar cumplen los objetivos analticos de calidad en cuanto a imprecisin analtica de las distintas fracciones del proteinograma. ( Especificacin de calidad deseable: CVa < 0,5 Cvi)

EL POR QU DE SEGUIR A UN PACIENTE CON EL COMPONENTE MONOCLONAL Y NO CON OTROS PARMETROS Coeficiente de variacin total, analtico y biolgico

KATZMANN JA. et al. Clin Chem 2011; 57:1687-92. (estudio sobre 158 pacientes con gammapata clnicamente estable)

%CV biolgico
Recomendaciones para el seguimiento

9ALOR DE REFERENCIA DEL CAMBIO 19RC6 PARA EL CM

El menor %CV biolgico del CM, respecto a las Igs, nos indica que es el parmetro mejor indicado para el seguimiento del paciente, pues reflejar de un modo ms preciso los cambios significativos en el estado del paciente. El %CV biolgico, nos permite calcular el VRC, que ser importante para el seguimiento del paciente, pues define los cambios que son considerados significativos, relacionados exclusivamente con el cambio de estado de salud paciente. VRC = 21/2* 1,96*(CVa2+CVi2)1/2
CVa coeficiente de variacin analtico (imprecisin). CVi coeficiente de variacin intraindividual.

VRC % CM suero = 20,1 % VRC % CM orina = 63 % VRC% FLCs = 54 % VRC% Ig G suero = 30 %

Porcentaje de disminucin necesaria de cada magnitud para que fuera significativo en el seguimiento del tratamiento (P=0,95), segn Katzmann et al.

IDENTIFICACIN DEL CM: Cadena pesada y/o ligera

Isotipos de cadena pesada Ig G, Ig D e Ig E
forma molecular monomrica.

Ig A
forma monmeros o dmeros.

Ig M
forma pentamrica.

MTODOS DE IDENTIFICACIN DEL CM 1. INMUNOFIJACIN

PROCESO: 1.Separacin de las protenas por electroforesis en gel de agarosa. 2.Inmunoprecipitacin de la protena con anticuerpos especficos frente a cadenas pesadas (G,A,M,D,E) y cadenas ligeras (kappa y lambda) o cadenas ligeras libres. 3.Tincin con colorantes (violeta cido, negro amido, azul de Coomassie).

Mtodo ms Sensible. Considerado criterio diagnstico

MTODO IDENTIFICACIN DEL CM 2. INMUNOTIPADO

Adaptacin de la inmunofijacin a la electroforesis capilar. Se trata de una inmunosustraccin en fase homognea, en donde se ve el inmunocomplejo formado en la zona entre albmina y alfa-1. Se realiza electroforesis capilar despus de enfrentar la muestra con antisueros especficos frente a cadenas pesadas (G,A,M) y cadenas ligeras (kappa y lambda). Destaca su practicabilidad, totalmente automatizado y su rapidez. Como limitacin, no dispone de anticuerpos frente a Ig D e Ig E.

EJEMPLOS DE IDENTIFICACIONES POR IFE

DIFICULTADES EN LA IDENTIFICACIN

Si aparecen 2 bandas del mismo isotipo, conviene repetir despus de aplicar tratamiento reductor, para descartar fenmenos de polimerizacin.

Inmunoglobulina polimerizada que impide la migracin de los componentes de la muestra en el gel. Aparece una banda en el punto de aplicacin (en beta), en todos los carriles; en este caso en necesario tratar la muestra con un agente reductor (betamercaptoetanol) y repetir el anlisis.

EJEMPO DE MIELOMA DE CADENAS LIGERAS

Hay que descartar presencia de Ig D e ig E.

Ej: Gammapata monoclonal Ig A Kappa, con migracin en betta.

Identificacin mediante inmunotipado

Cuantificacin del pico monoclonal interferida por el resto de protenas que migran en la misma zona electrofortica. Se recomienda seguimiento mediante cuantificacin de Ig A

ESTUDIO DE LA ORINA PROTEINURIA BENCE-JONES

Slo despus de comprobar que no se aprecia CM por electroforesis ni por IFE, que el cociente K/L srico es normal y que no existe proteinuria de Bence-Jones, se podra excluir un diagnstico de gammapata.

Se detecta en ms del 80% de pacientes con MM y en un 20% de casos es el nico CM detectado (mieloma de cadenas ligeras). Constituye un marcador de malignidad, til para el diagnstico y pronstico. Fenmeno de escape en pacientes tratados: cambio en CM de cadena pesada a CM exclusivo de cadena ligera.

ESTUDIO DE ORINA

Definicin de proteinuria de Bence-Jones (PBJ): cadenas ligeras libres monoclonales de inmunoglobulinas o sus fragmentos, que son secretadas por clulas B derivadas de un nico clon que prolifera. Responsables de alteracin renal a distintos niveles. Las CLL son sintetizadas por las clulas B a lo largo de todo su proceso madurativo, siendo la mayor produccin en las clulas plasmticas Produccin: 500 mg/da

CONCENTRACIN PLASMTICA.

Son aclaradas y metabolizadas en el rin

PRODUCCION DE FLC POR LAS CALULAS PLASMBTICAS

Inmunoglobulinas policlonales ( /: 2/1) Dimerica (50kDa) Monomerica (25KDa)

Do(le 0roducci7" de cade"a& :! 0ero &e meta(oli;a" a"te& 0or<ue circula" e" *orma mo"om=rica! mie"tra& <ue la& L lo %ace" e" *orma dim=rica > 0or ello tarda" tre& ?ece& m@& tiem0o e" &er elimi"ada& de la circulaci7".

NORMALES 9ERSUS MIELOMA

IgG IgG L IgA IgA L IgD IgD L IgE IgE L IgM IgM L IgG IgG L IgA IgA L IgD IgD L IgE IgE L IgM IgM L

Activacin Policlonal

FLC: y

Ratio Normal

IgG

IgG

Mieloma FLC: anormal Ratio

NEFROTOXICIDAD DE CLLs

La PBJ causan dao renal por diferentes mecanismos y en diferentes niveles: glomerular, tubular e intersticial La enfermedad renal est presente en 20-50% MM. Si creatinina > 2 mg/dL 20%, si creatinina > 1.5 mg/dL 30-50%. Se asocia con aumento de la morbi y mortalidad. La mayor causa de fallo renal es la sobreproduccin de CLL nefrotxicas. Nefropata por cilindros: 40-63%, EDCL 19-26%, AL 7-30% Nefropatas por CLL: Glomerulopatias: Enfermedades por depsito de PBJ Amiloidosis AL Enfermedad por depsito de cadenas ligeras Tubulopatias Sndrome de Fanconi Nefropata por cilindros Lesiones vasculares

METABOLISMO DE CADENAS LIGERAS LIBRES

ESTUDIO DE LA PBJ: PREANALTICA

La PBJ es susceptible a la degradacin bacteriana Conservar a 2-8 C, estable al menos 1 semana (gua SEQC) Orina de 24horas: orina necesaria para cuantificacin de la PBJ (Enfermedad medible. Criterios de respuesta). Ventaja: se elimina la variabilidad intraindividual. Dificultad: Recoleccin y transporte.

Orina aleatoria como alternativa y expresando los resultados en funcin de la creatinina.

Centrifugacin de la orina para eliminar partculas y precipitados (400x g, 10 min)

Concentracin de la muestra

DETECCIN E IDENTIFICACIN DEL CM

Lmite de deteccin recomendado: 10 mg/L Problemas de interpretacin: Patrn en escalera de CL policlonales (light chain ladders) Se producen un patrn de bandas (3-8), usualmente kappa Se puede observar en pacientes con proteinuria tubular.

INMUNOFIJACIN: Es el mtodo de eleccin.

Permite verificar las caractersticas de la PBJ: CLL y monoclonalidad Los mtodos de elevada sensibilidad y resolucin no necesitan concentracin de la muestra Lmite de deteccin: 10 mg/L Se debe realizar IF cuando se requiera una alta sensibilidad: diagnstico amiloidosis AL, diagnstico MM, evaluacin remisin completa en MM

DETECCIN DE PBJ. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Permite la deteccin de CM y definir el tipo de proteinuria Menor sensibilidad que la IF, 100 mg/L Se debe utilizar colorante de alta sensibilidad (Violeta cido) Se puede realizar de manera convencional o de alta resolucin Si el mtodo es sensible no es necesario concentrar la muestra o concentrar mnimamente (10x). Concentrar si la concentracin de Proteinas orina < 150 mg/L (Anja y col. Am J Clin Pathol 2008; 130:141-145)

Criterio de sensibilidad: se debe observar la banda de albmina

EJEMPLOS DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Se debe realizar una Inmunofijacin, siempre que se observe una banda en el trazado electrofortico diferente a la albmina, aunque sea reconocida (Transferrina)

CUANTIFICACIN DEL CM EN ORINA

La medida de la excrecin de PBJ est incluida en los criterios de respuesta al tratamiento No existe un mtodo ideal para la medida de la PBJ El mtodo recomendado en todas las guas es la Densitometra: Medida de las protenas totales en la orina Electroforesis de protenas urinarias: E.Gel agarosa, E.capilar Los mtodos inmunoqumicos no se recomiendan (IMWG 2011, UKMF-NMSG 2009)

CUANTIFICACIN DEL CM

Acotar el CM en el trazado electrofortico.

Referir el porcentaje a la concentracin total de protena

ELECTROFORESIS DE I/ EN SUERO

Hiper Policlonal

Gammapata monoclonal

Se"&i(ilidad

M/USCMM 90%

LCMM 45%

AL Amil 50%

NSMM 0%

Electro*ore&i& e" &uero

Kyle RA and Rajkumar SV. Cecil Textbook of Medicine, 22nd Edition, 2004

ELECTROFORESIS DE I/S EN ORINA

Se"&i(ilidad

Mieloma ~ 95%

LCMM 90%

AL Amil 70%

NSMM 0%

Electro*ore&i& &uero D ori"a

INMUNOFIEACI-N DE I/ EN SUEROCORINA

Persona Sana

MM Ig G k

Bence Jones k

Se"&i(ilidad Electro*ore&i& D IFE &uero D ori"a

Mieloma LCMM AL Amil 97% 95% 90%

NSMM 0%

CADENAS LIGERAS LIBRES EN SUERO

PATOLO/AS CON COMPONENTES MONOCLONALES NO DETECTADOS

100000

Rango Normal / (0,26 (0,261,65)

10000

Sueros normales

Sensibilidad 1000 SPE Sensibilidad 100 IFE (mg/L)

10

MM CL MM CL Amiloidosis MM No Secretor

0.1 0.1 1 10 100 1000 10000 100000

(mg/L)

CARCTERSTICAS METODOLGICAS Y LIMITACIONES

Tipo de muestra : suero, plasma con heparina de litio. Estabilidad: 6 semanas a 4o C, 12 semanas a -20oC. Estandarizacin: no existe un material de referencia ni un patrn internacional para las CLLs. Descritas diferencias de reactividad entre el calibrador comercial y las diferentes CLLs monoclonales Influencia del analizador automtico:
estudios comparativos entre distintos analizadores encuentran diferencias en los resultados obtenidos . Se atribuyen al mtodo (nefelometra vs turbidimetra) o a al diferente rendimiento analtico del instrumento
Tate J et al. Clin Chem. 2003;49:1252-7. Nakano T et al. Clin Chem Lab Med. 2006;44:522-32. Pattenden RJ et al. Ann Clin Biochem. 2007;44:512-5.

CARCTERSTICAS METODOLGICAS Y LIMITACIONES

Exceso de antgeno: concentraciones elevadas de CLLs resultado falso negativo (Efecto Prozona, debido a un exceso de antgeno) Prdida de linealidad post-dilucin: muestras con protenas monoclonales (PM) tienden a una respuesta no lineal al diluirlas. Efecto matriz con el suero o a que la PM no reconoce todos los Acs policlonales del reactivo, y d lugar a un exceso de antgeno Infraestimacin de la concentracin Sobreestimacin de la concentracin: polimerizacin de las CLLs. Por la presencia de mltiples epitopos antignicos, que originan un aumento de la reaccin de inmunoprecipitacin

RATIO DE CADENAS LIGERAS LIBRES INFORMAN DE MONOCLONALIDAD

FLC EN SUERO F ORINA EN /AMMAPATAS MONOCLONALES

50,000
Ne*ro0at8a de t)(ulo&

50,000

FLC en suero (mg/L)

5,00,000

orina
500
Protei")ria Be"ce3Eo"e&

5,000

2,000

250

100

suero
1,000

10 0 6 12 18 24

10 30

Tiempo (meses)

FLC en orina (mg/L)

RANGO RENAL PARA EL RATIO DE CLLS

UTILIDAD CLNICA

El grupo de Trabajo Internacional del Mieloma (IMWG), ha establecido recomendaciones para la medida de la concentracin de las CLLS en todas las GM : En el momento del diagnstico. Como factor pronstico. En la monitorizacin de la AL y del MMNS u oligosecretor. Para definir el concepto de respuesta completa estricta en los pacientes con MM

Dispenzieri A et al. Leukemia.2009;23:215-24

RESUMEN

- Es necesario estudiar suero y orina de 24 horas. - Para la deteccin y cuantificacin del CM se recomienda la electroforesis capilar. - Para la identificacin del componente monoclonal, el Gold estndar es la Inmunofijacin, tanto en suero como en orina. - Se debe realizar inmunofijacin en caso de: . Hipogammaglobulinemia con clnica sugestiva. (descartar MMCL) . Si existe sospecha intensa de gammapata, aunque la electroforesis e inmunoglobulinas sean normales (AL).

RESUMEN

- Si aparece una cadena ligera en la inmunofijacin, sin correspondencia con cadena pesada (G, A, M), sospechar presencia de mieloma Ig D o Ig E. - La aparicin de bandas oligoclonales son frecuentes tras el trasplante de mdula sea y con los tratamientos actuales. No confundir con recadas.