UNIDADES DE TRANSCRIO

PROCARIOTOS X EUCARIOTOS

Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4nd edition, Freeman and Company, New York. (Fig 9.1)

RNA Polimerase Eucaritica

3 RNA polimerases que podem ser diferenciadas pela sensibilidade amanitina. Cada uma transcreve um tipo de RNA.

Enzima RNA pol I RNA pol II RNA pol III

Localizao
Nuclolo

Produto rRNA

Atividade Relativa 50-70%

Sensibilidade -amanitina Insensvel

Nucleoplasma

mRNA

20-40%

Sensvel

Nucleoplasma

tRNA; rRNA 5S e pequenos RNAs nucleares

~10%

Pouco sensvel

Viso geral de um gene eucaritico transcrito pela RNA Polimerase II

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

A RNA Polimerase eucaritica possui mais de 10 subunidades

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Sequncias comuns em Promotores reconhecidos pela RNA Polimerase II de eucariotos

Py2CAPy5

Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

A maioria dos promotores possui a sequncia TATA box a cerca de 25 pb a montante do stio de incio da transcrio (geralmente A)
sequncia curta, bem definida e com localizao relativamente fixa com respeito ao stio de incio da transcrio; encontrada na grande maioria dos promotores dos eucariotos

TATA box o stio de interao da TBP (TATA binding protein) define o incio da transcrio na maioria dos genes dependentes da RNA polimerase II.

TATA box

+1

___________T82A97T93A85A63(T37)A88_____21 a 29 pb_____|A50___regio codante__

Alm do promotor bsico, os promotores eucaritiocos contm ainda elementos de seqncia que so reconhecidos por fatores de transcrio que ativam ou reprimem a ao destes promotores. Estes elementos podem ser divididos em dois grupos - Elementos proximais: encontrados logo acima (entre -200 e -100pb) - Elementos distais: encontrados a grande distncia dos promotores (at -50 kpb) e podem ser localizados antes do promotor, aps o cistron ou mesmo em introns internos.

Todas as RNA polimerases tm em comun a TBP (TATA Binding Protein) que serve de elemento guia para os demais fatores gerais de transcrio.

TBP liga-se ao DNA pela cavidade menor (virtualmente todas as protenas que se ligam ao DNA o fazem pela cavidade maior).

Forma uma cela curvando o DNA: o TATA box curvado em direo cavidade maior esta mudana na organizao espacial do DNA parece gerar uma interao mais ntima entre os demais FTs e RNA Pol II com o DNA

As RNAs Polimerases eucariticas so posicionadas em todos os Promotores por um fator que contm TBP

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

O complexo de Transcrio montado pela adio seqencial de fatores basais.

Montagem do complexo de iniciao:

entrada orquestrada de vrios fatores gerais de transcrio (fatores basais da transcrio). A TBP est associada aos TAF (TBP Associated Factor) que dependendo da polimerase pode ser TAFI, TAFII ou TAFIII.

A transcrio a partir da RNA pol II depende ainda de fatores especficos diversidade fenotpica encontrada nos diversos tipos celulares.
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers.

Reconhecimento de um promotor contendo TATA box: primeiras etapas

1) Ligao de TFIID em uma regio que se estende a montante do TATA box; 2) TFIID ( cerca de 800 kDa): TBP + TAFs (TAFII00); 3) TFIIDs contendo diferentes TAFs podem reconhecer diferentes promotores alguns TAFs so tecido-especficos; 4) Os TAFIIs podem ser encontrados em outros complexos: remodelamento da cromatina antes do incio da transcrio; 5) TFIID ubquo mas no nico

Aspectos gerais da iniciao da transcrio eucaritica (RNA PolII)

1- TFIID se liga ao promotor (core)

2- TFIIA estabiliza o complexo TFIID/promotor

3- TFIIB se liga ao complexo TFIID/TFIIA e recruta a pol II para o promotor

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

4- TFIIE e s depois TFIIH se ligam ao complexo polimerase/promotor

5- TFIIH participa de duas formas: -com sua atividade ATPsica desenrola a hlice do DNA (girase) - sua atividade de protena quinase fosforila o CTD

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Elementos que regulam a transcrio pela RNA Polimerase II

Elementos que agem em cis
seqncias regulatrias

Elementos que agem em trans

Fatores de transcrio que se ligam aos elementos cis
RNAs Regulatrios

Os promotores de metazorios so mais complexos

Promotores eucariticos da RNA pol II: grande diversidade de sequncias curtas eficincia e regulao da transcrio

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

Os promotores normalmente respondem a mltiplos sinais

Ex: promotor de metalotionena: proteo contra metais pesados

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

Diversidade de elementos que agem em cis elementos basais elementos regulatrios

Diversidade de fatores que agem em trans

fatores da maquinaria basal natureza bimodular dos fatores de transcrio ativadores e repressores montagem sequencial e ordenada do complexo de iniciao da transcrio

Fatores de transcrio

A transcrio pela RNA pol II normalmente modulada por FTs que ao se ligarem aos elementos proximais ou distais ativam ou mesmo silenciam o promotor.

Estes fatores so normalmente modulares ou seja, podem ser dissociados em domnios de ligao ao DNA (DBD: DNA Binding Domain) e domnios reguladores da transcrio.

Reguladores globais da expresso gnica

natureza bimodular dos fatores de transcrio

Ativadores bimodulares Domnios de ligao ao DNA Domnios de ativao

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Os Fatores de Transcrio so protenas modulares

Explique o resultado da figura ao lado (a e b)

Os domnios so independentes Papel do domnio de ativao

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4nd edition, Freeman and Company, New York.

Diagrma esquemtico ilustrando a estrutura modular de ativadores da transcrio de eucariotos. Gal4 e GCN4 so ativadores da transcrio em levedura. GR o receptor de glicocorticide. SP1 liga-se a elementos ricos em G-C (G-C rich elements) no promotor de um grande nmero de genes de mamferos.

A maquinaria basal interage com os vrios elementos ativadores

Os promotores do tipo II apresentam inmeros elementos regulatrios que podem ser tecido especfico ou estgio especfico
A transcrio do gene TTR
(transthyretine)

requer uma forte cooperatividade entre fatores regulatrios durante a montagem do complexo de iniciao. Nos hepatcitos, a transcrio do gene TTR controlada por pelo menos 5 diferentes ativadores transcricionais especficos

Fatores de Transcrio
Classificao em famlias Domnios:
de ligao ao DNA de trans-ativao (ou represso) de interao protena-protena

3 importantes famlias de fatores de transcrio so descritas quanto ao tipo de domnio de ligao ao DNA

1) Hlice-Volta-Hlice 2) Dedos de Zinco 3) Leucine Zipper

Ver nos slides disponibilizados no site de aulas as caractersticas gerais destas famlias de protenas como uma curiosidade

Regulao Gnica em Eucariotos

linfcito Neurnio

Diferentes nveis de regulao da expresso gnica em eucariotos

Remodelagem da cromatina Controle transcricional Controle ps-transcricional Controle do transporte do mRNA

Controle traducional

Controle ps-traducional

Controle da expresso acontece principalmente em nvel de transcrio

Acessibilidade cromatina Iniciao da transcrio Processamento do RNA Traduo

Representao do core de Histonas de um nucleossomo Alm das histonas, outras protenas fazem parte da cromatina
- HMGs (High Mobility Group): tambm muito abundantes; - Fatores de transcrio; - Protenas associadas com a replicao

Organizao dos nucleossomos

Acessibilidade aos FTs e RNA Polimerase ??

Controlando a Acessibilidade da cromatina aos FTs e RNA Polimerase

O grau de condensao da cromatina regulado quimicamente diversas modificaes qumicas Acetilao: ao geralmente relaxante Histona acetil-transferases (HATs) Histona desacetilases (HDACs) Metilao: geralmente condensadora Fosforilao

Estrutura de cromatina e expresso gnica

Nos organismos eucariticos a estrutura da cromatina tem papel crucial na regulao da expresso gnica. O N-terminal das histonas projetado na superfcie do nucleossomo rico em resduos de aminocidos de LISINA (carregados positivamente interao forte com o fosfato do DNA) podem ser modificados reversivelmente por acetilao, metilao e fosforilao. As funes das modificaes das histonas por acetilao/desacetilao so as mais bem conhecidas Controle da expresso gnica durante a intrfase Os ativadores e os repressores transcricionais regulam mudanas na estrutura da cromatina por acetilao/desacetilao do N-terminal das histonas alterao na acessibilidade da cromatina (ligao ao promotor) aos fatores gerais de transcrio

Ativadores direcionam alteraes locais na estrutura da cromatina

promotor inacessvel dentro da cromatina ativador recruta HAT ativador recruta remodelador de nucleossomo

promotor acessvel

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Papel da desacetilao e hiperacetilao da cauda N-terminal de histonas no controle da transcrio em S. cerevisiae

As desacetilases (HDACs) represso da expresso de genes protenas repressoras (UME6) FTs recrutam acetilases (histona acetilases - HATs) para o complexo de iniciao da transcrio protenas ativadoras (GCN4)
Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4nd edition, Freeman and Company, New York.

Controle da expresso acontece principalmente em nvel de transcrio

Acessibilidade cromatina Iniciao da transcrio
Aparato basal de transcrio
fatores de transcrio gerais e RNA pol

Elementos de Resposta no DNA

Promotor, Enhancer, Silencers, outras sequncias

Fatores de transcrio e protenas acessrias

Processamento do RNA Estabilidade do transcrito

Recrutamento dos fatores gerais de transcrio

O promotor s garante um nvel basal de transcrio Genes constitutivos Ativadores e repressores controlam o recrutamento diferencial do aparato basal de transcrio O complexo Mediador Superfcies mltiplas de interao

Ativao da iniciao da transcrio em eucariotos pelo recrutamento da maquinaria de transcrio

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Montagem do complexo de pre-iniciao na presena do Mediador, modificadores e remodeladores de nucleossomos e ativadores transcricionais
Em adio aos fatores basais, ativadores recrutam outros complexos facilitao da montagem do complexo de pr-iniciao

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Diferentes modos de ao de Repressores transcricionais

Muito comuns em procariotos Em eucariotos, mais comumente por remodelao da cromatina Como no caso de ativadores, pode haver resposta a um sinal molecular (presena ou ausncia de metablitos)

Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Represso do gene gal1 em leveduras

Mig1 Repressor transcricional especfico (CreA, CreB outros organismos) Tup1 Repressor transcricional geral

1) + glicose: Mig liga-se a um stio entre UASG e o promotor 2) Mig recruta o complexo repressor Tup1 3) Tup1 recruta desacetilase
Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Insuladores bloqueiam a ativao por

enhancers

c) O ativador pode ativar outro promotor d) O promotor original pode ser ativado por outro enhancer

ajusante
Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings

Elementos importantes para a regulao da transcrio pela RNA Polimerase II Diversidade de elementos de sequncia (elementos em cis) Diversidade de Fatores de Transcrio (elementos em trans) Modulao da atividade dos FTs (diversos mecanismos)

Quem regula o regulador?

sntese protica do FT modificao covalente do FT interao de uma molcula ligante ao FT ligao do FT a um inibidor

Quem regula o regulador?

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

A expresso de muitos genes responde a estmulos extracelulares

Os hormnios esterides entram nas clulas e seus receptores transitam entre o citoplasma (na forma livre) e o ncleo (na forma ligada)

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

Muitos promotores respondem a estmulos extra-celulares

Hormnios esterides entram na clula

Alguns fatores de transcrio respondem a presena de hormnios como a corticides, tiroxina ou cido retinico Estes receptores hormonais transitam entre o citoplasma (na forma livre) e o ncleo (forma ligada)

Estes fatores so relacionados estruturalmente

Outros estmulos sinalizam a partir do meio extracelular (Vias de Transduo de Sinais)

Hormnios proticos NO entram na clula

Hormnios polipeptdicos no so internalizados e reconhecem receptores especficos na membrana citoplasmtica, desencadeando uma cascata de eventos que levam a mensagem ao ncleo

Fator de Transcrio NFB Regulao da Expresso Gnica em resposta a um sinal ambiental

Sinal Externo Via Transduo de Sinal Ativao de um fator de Transcrio Tranporte para o ncleo Ativao da Transcrio de genes alvo (em resposta ao sinal extracelular)

Aps a transcrio gerado o pr-mRNA

mRNA maduro
ncleo sntese e maturao do pr-mRNA citoplasma mRNA maduro sntese de protenas

mRNA maduro
AUG 5 CAP UAA Cauda poli-A 3

5UTR regio codante

3UTR

UTR (untranslated region) - regio 5 no traduzida

O processo de maturao do pr-mRNA

e os mecanismos de regulao deste processo: regulao do splicing