UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS DA SADE LABORATRIO DE TECNOLOGIA FARMACUTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTTICOS BIOATIVOS

RASSA MAYER RAMALHO CATO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

JOO PESSOA - PB 2007

RASSA MAYER RAMALHO CATO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Trabalho de Tese apresentado ao Programa de Ps-Graduao em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos do Centro de Cincias da Sade - Laboratrio de Tecnologia Farmacutica da Universidade Federal da Paraba em cumprimento s exigncias para obteno do ttulo de Doutor em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos (Farmacologia).

Orientadores:

Prof. Dr. Edeltrudes de Oliveira Lima Prof. Dr. Jos Maria Barbosa Filho

Co-orientadora: Prof. Dr. Maria do Socorro Vieira Pereira

JOO PESSOA - PB 2007 I

RASSA MAYER RAMALHO CATO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES

Aprovada em 11/05/2007

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________ Prof. Dr. Edeltrudes de Oliveira Lima Orientadora

__________________________________________ Prof. Dr. Margareth de Ftima Formiga Melo Diniz Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Lindomar de Farias Belm Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Beatriz Susana Ovruski de Ceballos Examinador

__________________________________________ Prof. Dr. Lauro Santos Filho Examinador

II

DEDICATRIA

Ao meu esposo Almir; Aos meus filhos, Rodolfo, Rafaella e Raquel; Aos meus pais Raff (in memorian) e Eliane.

III

AGRADECIMENTOS
A Deus. A Almir, Rodolfo, Rafaella e Raquel por tudo que eles representam em minha vida. Aos professores do Programa de Ps-graduao em Produtos Naturais e Sintticos Bioativos, em particular Professora Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima e ao Professor Dr. Jos Maria Barbosa Filho, orientadores que renem entre inmeras qualidades sapincia e humildade. A professora Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira, pela pacincia e dedicao durante todo este perodo de estudo. A professora Dra. Bagnlia de Arajo Costa, pela dedicao e incentivo ao ensino e pesquisa. Aos colegas de turma, pelo companheirismo e amizade, em especial a Alessandra, Josimar, Rossana, Thlio e Vanda, por acreditarem no PQI/UEPB. Aos colegas do Departamento de Farmcia da UEPB. A UEPB, por ter nos dado a oportunidade de investir na nossa qualificao profissional. A CAPES, por ter concedido bolsa de estudos atravs do Programa de Qualificao Institucional PQI, possibilitando a parceria entre a UEPB/UFPB-LTF. A todos que direta ou indiretamente contriburam na realizao deste trabalho.

IV

... De tudo ficaram trs coisas, a certeza de que estaremos sempre comeando, de que preciso continuar e de que seremos interrompidos antes de terminar. Fazer da interrupo um novo caminho, da queda um passo de dana, do medo uma ponte, da procura um encontro.... Fernando Sabino

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .............................................................. LISTA DE FIGURAS............................................................................................

IX X

LISTA DE GRFICOS ......................................................................................... XII LISTA DE QUADROS.......................................................................................... XIII LISTA DE TABELAS ........................................................................................... XIV RESUMO.............................................................................................................. XV ABSTRACT.......................................................................................................... XVI 1 INTRODUO ...................................................................................................... 17 2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 22 2.1 Geral.............................................................................................................. 23 2.2 Especficos .................................................................................................... 23 3 REVISO DE LITERATURA ................................................................................ 24 3.1 Patognese microbiana ................................................................................. 25 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.2.1 3.3.1 3.3.2 3.3.3 Staphylococcus aureus.......................................................................... 25 Escherichia coli ...................................................................................... 28 Pseudomonas ........................................................................................ 29 Fungos leveduriformes .......................................................................... 29 Mecanismos de ao de alguns antimicrobianos .................................. 32 Mecanismos genticos de aquisio de resistncia aos

3.2 Antimicrobianos ............................................................................................. 30 3.3 Resistncia bacteriana aos antimicrobianos.................................................. 38 antimicrobianos ..................................................................................... 40 Plasmdeos............................................................................................ 42 Transposons (Tn) .................................................................................. 44

3.4 Aspectos botnicos e fitoqumicos da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) ................................................................................................... 45 3.4.1 3.4.2 3.4.3 Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae)................................................... 45 Alcamidas de plantas ............................................................................ 46 Riparinas ............................................................................................... 47

VI

4 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 51 4.1 Local da pesquisa.......................................................................................... 52 4.2 Material.......................................................................................................... 52 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9 Obteno dos produtos sintticos ......................................................... 52 Linhagens microbianas.......................................................................... 52 Meios de cultura .................................................................................... 53 Substncias ........................................................................................... 53 Obteno da O-metil-N-(benzoil)-tiramina (riparina I)............................ 54 Obteno da O-metil-N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina (riparina II) ............. 55 Obteno da O-metil-N-(2,6-dihidroxibenzoil)-tiramina (riparina III) ...... 55 Obteno das solues de riparinas ..................................................... 56 Isolamento e identificao de bactrias................................................. 57 Suspenso bacteriana ........................................................................... 57 Isolamento e identificao de leveduras................................................ 58 Suspenso de leveduras ....................................................................... 58 Determinao da atividade antimicrobiana Triagem........................... 59

4.3 Mtodos......................................................................................................... 54

4.3.10 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica bacteriana.................... 62 4.3.11 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica fngica......................... 64 4.3.12 Determinao da caracterizao fenotpica dos padres de resistncia aos antimicrobianos Perfil de sensibilidade ...................... 66 4.3.13 Tratamento por riparinas I, II e III, obtidas a partir da A. riparia Avaliao da atividade curagnica ........................................................ 66 4.3.14 Estudo da relao estrutura/atividade antimicrobiana das riparinas...... 68 4.3.15 Anlise estatstica.................................................................................. 68 5 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 69 5.1 Resistncia antimicrobiana............................................................................ 70 5.2 Atividade antimicrobiana in vitro de riparinas ................................................ 72 5.2.1 5.2.2 5.2.3 Frente s cepas padres ATCC ............................................................ 72 Frente s Cepas de S. aureus ............................................................... 72 Frente s cepas de E. coli ..................................................................... 75

5.3 Determinao da CIM e da CBM ................................................................... 75 5.4 Classificao do perfil fenotpico das cepas de S. aureus ............................. 79 5.5 Avaliao da relao estrutura-atividade antimicrobiana das riparinas ......... 80 VII

5.6 Avaliao da cintica bacteriana ................................................................... 83 5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de riparinas sobre linhagens de Candida albicans ........................................................................................... 90 5.8 Avaliao da cintica fngica ........................................................................ 91 5.9 Avaliao da atividade curagnica ................................................................ 92 6 CONCLUSES .................................................................................................... 98 7 PERSPECTIVAS................................................................................................. 100 REFERNCIAS ..................................................................................................... 102 APNDICES .......................................................................................................... 123

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMH AS ASD ATCC BAB BHI CBM CB CDC CF CFM CHM CLSI CIM CS DCC DMSO HCl MH MIC MLS MRSA MSSA MRD OMS PBP UFC

Agar Meller-Hinton Agar Sangue Agar Sabouraud Dextrose American Type Culture Collection Blood Agar Base Brain Heart Infusion Concentrao Bactericida Mnima Cintica Bacteriana Centro de Preveno e Controle de Enfermidades Cintica Fngica Concentrao Fungicida Mnima Caldo Mueller-Hinton Clinical and Laboratory Standards Institute Concentrao Inibitria Mnima Caldo Sabouraud Dicloro Diciano Carbodiimida Dimetil-Sulfxido cido Clordrico Meller-Hinton Minimun Concentration Inhibitory Macroldeos-Lincosamdeos-Estreptogramina Staphylococcus aureus Methicillin Resistant Staphylococcus aureus Methicillin Sensitive Mecanismo de Resistncia Multidrogas Organizao Mundial de Sade Protein Binding Penicillin Unidade Formadora de Colnia

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Plasmdeo de resistncia........................................................................ 44 Figura 2. Foto de exsicata de Aniba riparia ........................................................... 46 Figura 3. Reao geral para sntese de riparina I - Acoplamento do ster

metlico da tiramina com o cloreto de benzoila....................................... 54 Figura 4. Reao geral para sntese de riparina II - Acoplamento de ster metlico da tiramina com o salicilato de metila........................................ 55 Figura 5. Reao geral para sntese de riparina III - Acoplamento de ster metlico da tiramina com os cidos 2,6 dihidroxibenzico ...................... 56 Figura 6. Placa de microdiluio............................................................................ 60 Figura 7. Fluxograma da cintica bacteriana......................................................... 63 Figura 8. Fluxograma da cintica fngica .............................................................. 65 Figura 9. Fluxograma para avaliao da atividade curagnica.............................. 67 Figura 10. Perfil de suscetibilidade por difuso em meio slido, da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas I, II e III nas concentraes de 400(1), 200(2), 100(3) e 50(4) g/mL ................................................ 77 Figura 11. Determinao da CIM e CBM da riparina III frente a linhagens de S. aureus ATCC 25923 (1), 122U (2), 146U (3), 223U (4), 312U (5), 319U (6), 129FN (7), 233FN (8), 322FN (9), 1A (10), 46c (11), 50c (12) nas concentraes de 400(A), 200 (B), 100 (C), 50 (D), 25 (E) e 12,5 (F) g/mL ........................................................................................ 78 Figura 12. Demonstrao do crescimento bacteriano (a) e do efeito da riparina III sobre a cepa de S. aureus 319U (b) em diferentes espaos de tempo .. 88 Figura 13. Efeito bactericida da riparina III sobre S. aureus aps exposio por 24h/37C................................................................................................. 89 Figura 14. Variantes da linhagem 319U aps tratamento com riparina III, placa matriz BAB (a) e placa imprint - BAB-penicilina (b) ........................... 95 X

Figura 15. Antibiograma da linhagem 319U antes do tratamento de cura pela exposio riparina III (a) e de sua variante sensvel penicilina aps o tratamento (b) ............................................................................. 96 Figura 16. E-test para penicilina da linhagem de S. aureus 319U antes (a) e aps exposio riparina III confirmao de cura (b) ......................... 96 Figura 17. Determinao da CIM para penicilina por E-test em variantes 319U... 97

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LISTA DE GRFICOS

Grfico 1. Comparao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e E. coli ..................................................................................................... 82 Grfico 2. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas................................................................................................. 84 Grfico 3. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s riparinas...... 85 Grfico 4. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas...... 86 Grfico 5. Cintica fngica da cepa de C. albicans ATCC 76643 frente riparina III............................................................................................... 92 Grfico 6. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em S. aureus linhagem 319U.................................................. 95

XII

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Mecanismos de resistncia aos antimicrobianos................................... 42 Quadro 2. Caractersticas gerais das riparinas obtidas a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae) ........................................................................ 56

XIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Identificao e origem das cepas microbianas testadas ....................... 53 Tabela 2. Comportamento das cepas de S. aureus frente aos antimicrobianos ... 71 Tabela 3. Determinao da atividade antimicrobiana in vitro de riparinas frente s cepas padres ATCC........................................................................ 72 Tabela 4. Perfil de suscetibilidade in vitro das cepas de S. aureus frente s riparinas................................................................................................. 73 Tabela 5. Comportamento das cepas de E. coli frente s riparinas ...................... 75 Tabela 6. Determinao da CIM e da CBM das riparinas frente s cepas de E. coli, P. aeruginosa e S. aureus por difuso em meio slido.............. 76 Tabela 7. Classificao dos perfis fenotpicos das cepas de S. aureus ................ 80 Tabela 8. Apresentao da relao estruturaatividade antimicrobiana de riparinas frente a S. aureus (n = 22) ...................................................... 81 Tabela 9. Avaliao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e E. coli ..................................................................................................... 82 Tabela 10. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923, frente s riparinas................................................................................................. 84 Tabela 11. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s rparinas....... 85 Tabela 12. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas...... 86 Tabela 13. Perfil de suscetibilidade das cepas de C. albicans frente s riparinas..... 90 Tabela 14. Cintica fngica e efeito in vitro da riparina III sobre C. albicans ATCC 76643.......................................................................................... 91 Tabela 15. Linhagens de S. aureus com marcas de resistncia para penicilina e eritromicina ............................................................................................ 93 Tabela 16. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em linhagens de S. aureus ..................................................... 94

XIV

RESUMO
CATO, R.M.R. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E EFEITOS BIOLGICOS DE RIPARINAS SOBRE BACTRIAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES. Joo Pessoa, Tese de Doutorado. 2007. 126p. Universidade Federal da Paraba. A sntese de novas substncias com atividade farmacolgica representa um grande desafio, sendo o maior deles, a transformao de produtos de plantas medicinais em substncias medicamentosas. Nessa pesquisa objetivou-se avaliar a relao estrutura/atividade antimicrobiana in vitro das riparinas I, II e III, obtidas por sntese a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae), planta tpica da regio amaznica, sobre cepas padro ATCC de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans e sobre cepas multirresitentes de S. aureus. Foram avaliadas a atividade antimicrobiana e a freqncia de cura de plasmdeos de resistncia penicilina e eritromicina em S. aureus. A atividade antimicrobiana foi determinada pela mensurao das Concentraes Inibitria Mnima (CIM) e Bactericida Mnima (CBM), pelas tcnicas de medio de halos, microdiluio em placas e determinao dos nveis de resistncia atravs das Cinticas Bacteriana (CB) e Fngica (CF). Duas amostras representativas de S. aureus (linhagens 319U e 122U), com marcas de resistncia plasmidial para penicilina e eritromicina foram selecionadas para avaliao da atividade curagnica sobre plasmdeos, aps 24 horas de exposio frente s riparinas, na concentrao sub-inibitria (1/2 CIM = 100 g/mL). No foi observada a eliminao da marca de resistncia para eritromicina nessas linhagens aps tratamento pelas riparinas. Apenas a riparina III foi capaz de produzir reverso fenotpica na linhagem 319U a qual teve sua marca de resistncia penicilina eliminada numa freqncia de 61,7%. Todas as riparinas apresentaram atividade antimicrobiana sobre as linhagens de S. aureus. As CIMs demonstraram que as riparinas I e II apresentaram efeito bacteriosttico sobre S. aureus enquanto que a riparina III apresentou efeito bactericida e ao curagnica eliminando a marca de resistncia para penicilina, na concentrao sub-inibitria. O desenvolvimento de novos agentes bactericidas pode ser alcanado pela elaborao racional de novas geraes de antimicrobianos visando minimizar a resistncia, atravs do descobrimento de produtos naturais e sintticos bioativos. PALAVRAS-CHAVE: Riparinas; Atividade antimicrobiana; Cura de Plasmdeos; Bactrias; Leveduras.

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ABSTRACT
CATO, R.M.R. ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND BIOLOGICAL EFFECTS OF RIPARINS IN BACTERIA AND YEAST-LIKE FUNGI. Joo Pessoa. Tese de Doutorado, 2007. 126p. Universidade Federal da Paraba. The synthesis of new substances with pharmacological activity represents a great challenge, and the greatest of all is the transformation of products from medicinal plants into medical substances. In this research study, the objective was to evaluate the antimicrobial structure/activity relation in vitro of riparinas I, II and III, obtained by synthesis from Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae), plants which are typical of the Amazon region, over strains of standard ATCC of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans, as well as multiresistant samples of S. aureus. The antimicrobial activity and the frequency of curing of plasmids of resistance to penicillin and to erythromycin were evaluated in S. aureus. The antimicrobial activity was determined by the measuring the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericide Concentration (MBC), by using the technique for halo measurement, microdilution in plates and determining resistance levels by means of Bacterial Kinetics (BC) and Fungic Kinetics (CF). Two representative strains of S. aureus (lineages 319U and 122U) with marks of plasmidial resistance to penicillin and erythromycin were selected to the evaluate curagenic activity over plasmids, after 24 hours of being exposed to riparins, on the sub-inhibitory concentration (1/2 MIC = 100 g/mL). It was observed that only riparin III was able to produce phenotypic reversion on lineage 319U, which had its mark of resistance to penicillin eliminated on a frequency of 61,7%. The riparins presented antimicrobial activity over the lineages of S. aureus. The MICs demonstrated that riparins I and II presented a bacteriostatic effect over of S. aureus, while riparin III presented a bactericide effect and curagenic action, thus losing their mark of resistance to penicillin on a sub-inhibitory concentration. The development of new bactericide agents might be reached by the rational elaboration of new generations of antimicrobial, which aim at minimizing the resistance, through the discovery of natural and synthetic bioactive products. KEY-WORDS: Riparins; Antimicrobial activity; Curing of Plasmids; Bacteria; Yeasts.

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1 INTRODUO

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1 INTRODUO O reino vegetal ocupa lugar de destaque, devido possibilidade de utilizao diversificada, tanto para fins alimentcios quanto para fins medicamentosos. Durante milhes de anos, os organismos includos no reino vegetal sofreram modificaes para melhor adaptarem-se ao meio ambiente. Esses processos antomo-fisiolgicos deu-lhes a capacidade da sntese do prprio alimento e foi chamado de metabolismo de ordem primria, que inclui a biossntese de lipdeos, protenas e carboidratos. Os vegetais possuem mecanismos reguladores que os ajudam a desempenhar suas funes vitais (DI STASI, 1996; YAMADA, 1998; DIAS, 2001). Por meio desses mecanismos, chamados em seu conjunto de metabolismo de ordem secundria, a planta consegue elaborar substncias (metablitos secundrios), que desempenham papis especficos em casos de estresse, crescimento, reproduo, capacidade para repelir organismos invasores, atrair insetos ou pssaros, que so necessrios para a polinizao e adaptao s mudanas fsico qumicas do meio externo (BEART, et al., 1985; CARVALHO; SARTI, 1995; MACHADO et al., 1995; DI STASI, 1996). Devido a estas caractersticas, so atribudas diversas aes biolgicas aos princpios qumicos vegetais, podendo-se dizer que a planta se constitui num enorme laboratrio de sntese orgnica, fruto de milhes de anos de evoluo (DI STASI, 1996; SALL, 1996; VON POSER; MENTZ; SCHENKEL, 2000; DIAS, 2001; MONTANARI; BALZANI, 2001). Desse laboratrio natural o homem se aproveita para obter substncias que possam contornar a resistncia aos antimicrobianos convencionais. Por um longo perodo de tempo, as plantas foram usadas como as principais fontes de produtos naturais para a manuteno da sade humana (GOTTLIEB; BORIN, 2002). As principais classes de compostos antimicrobianos de origem vegetal so fenis, terpenos, alcalides, lecitinas, polipeptdeos e poliacetilenos. Alm das citadas, outras substncias de origem vegetal mostram certa atividade antimicrobiana, como: poliaminas, isotiocianatos, tiossulfinatos e glicosdeos (NOGUEIRA, 2000). Com a descoberta dos antibiticos e com o avano da indstria farmacutica, que permitiu a criao dos medicamentos obtidos de sntese, alguns produtos

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naturais utilizados at ento, caram em desuso durante o ps-guerra. Entretanto, o aparecimento de microrganismos resistentes s drogas, os altos nveis de resduos txicos nos alimentos, aliados ao desequilbrio ecolgico causado pelo homem, fizeram com que se buscassem alternativas compatveis com o modo de vida humana, nas mais diversas facetas do bem-estar bio-psico-social. Atualmente em todo o mundo, so aproveitados os recursos naturais com bons resultados. Sob esse aspecto, a flora se torna o campo para a investigao de solues satisfatrias e criativas, originando diversas pesquisas sobre produtos de origem natural. Na literatura cientfica emergem a todo o momento, trabalhos cujo objeto de estudo a obteno de agentes antimicrobianos de extratos vegetais (COUTINHO et al., 2004). Nas ltimas dcadas, devido ao desenvolvimento de tcnicas analticas de isolamento e elucidao estrutural, foram descobertos cerca de 50.000 novos metablitos secundrios isolados de plantas, muitos deles sem qualquer ou com pouca avaliao com relao ao seu potencial farmacolgico. Sobre este prisma, a busca de novos compostos vegetais com ao antimicrobiana, se apresenta como um modelo experimental, ecologicamente correto, para se produzir substncias que sejam eficazes e menos agressivas ao meio ambiente e aos homens, contribuindo assim com a melhoria da qualidade de vida, conforme estabelece a Carta Europia do Ambiente e da Sade, publicada pela OMS em 1989 (DOUX; DOUX, 1998). O uso de plantas medicinais para o tratamento de muitas doenas est associado medicina popular em vrias partes do mundo (ARAJO; LEON, 2001). Aproximadamente 80% da populao dos pases subdesenvolvidos e em desenvolvimento so quase completamente dependentes da medicina caseira utilizando plantas para suas necessidades bsicas de sade (BARBOSA-FILHO, 1997; CAETANO et al., 2002). Grande parte da populao brasileira consome apenas 37% dos medicamentos disponveis, dependendo quase que exclusivamente de medicamentos de origem natural (FUNARI; FERRO, 2005). As espcies do gnero Aniba, rvore da famlia Lauraceae, nativa da regio amaznica conhecida popularmente como louro (CASTELO-BRANCO et al., 2000), e pau-rosa (MARQUES, 2001), destacam-se pelo alto valor econmico, devido constituio do leo essencial, encontrado em grande quantidade principalmente no lenho e na casca. Aproximadamente 40 espcies de Aniba

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ocorrem no Brasil e podem ser divididas em 3 grupos de acordo com a natureza qumica do constituinte predominante no leo essencial: do linalol, do benzoato e do albenzeno (MARQUES, 2001). A quimiodiversidade e a potencialidade farmacolgica da flora brasileira so imensurveis e permite o estudo de plantas nativas de cada regio bem como o estudo de plantas exticas na Paraba como o caso da Aniba riparia (Ness) Mez, rvore da famlia Lauraceae, considerada uma das mais primitivas famlias, cujos primeiros registros datam de 2.800 a.C. sendo originrias da Grcia antiga. As Lauraceae destacam-se das demais famlias pela sua importncia econmica, sendo algumas espcies utilizadas na medicina popular e nas indstrias de perfumaria e qumica (MARQUES, 2001). Na medicina popular, as Lauraceae apresentam utilizaes variadas, desempenhando diferentes funes contra diversas doenas. Deve-se ressaltar, entretanto, que o uso das plantas deve ser feito com critrios e com eficcia teraputica conhecida (MARTINS; SANTOS, 1995). Segundo Barbosa-Filho et al. (1987), do ponto de vista fitoqumico, Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae), apresenta uma classe especial de alcalides contendo uma funo alcamida, restrito a poucos representantes na natureza. Aps a elucidao estrutural de um dos seus compostos o (O-metil-)-N-(2-hidroxibenzoil) tiramina verificou-se que, biogeneticamente, esta molcula resultado da condensao de duas substncias: o ter metlico da tiramina, agente simpaticomimtico, e o cido saliclico, agente queratoltico e antimictico. A partir da despertou-se a curiosidade de se verificar a potencialidade farmacolgica deste produto natural, de modo que este e outros anlogos foram sintetizados no Laboratrio de Tecnologia Farmacutica (LTF) da Universidade Federal da Paraba. Trs so de ocorrncia natural e foram isoladas pela primeira vez da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae), sendo chamadas de riparinas I, II e III, denominao esta para fazer referncia planta de origem. Estes produtos foram submetidos a ensaios farmacolgicos, observando-se que o composto mais ativo da srie sinttica o (O-metil-)-N-(2,6-dihidroxibenzoil) tiramina, riparina III (BARBOSAFILHO,1997).

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A sntese de novas substncias, com atividade farmacolgica significou um grande avano tecnolgico e o estudo qumico e farmacolgico dos produtos naturais representa um grande desafio, sendo o maior deles, o interesse pela transformao desses produtos obtidos de plantas medicinais em substncias medicamentosas. provvel que novos e revolucionrios antimicrobianos no sejam descobertos em um futuro prximo. Porm, importante que os agentes existentes sejam sabiamente empregados a fim de que se possa reduzir a emergncia e a disseminao de bactrias resistentes. So necessrios estudos sobre a concentrao inibitria mnima (CIM), concentrao bactericida mnima (CBM) e cintica bacteriana (CB), relacionados determinao da ao curagnica na remoo de plasmdeos, de modo que se possa impedir ou mesmo minimizar a transferncia plasmidial de resistncia a antibiticos, levando reverso do fentipo de resistncia para sensibilidade. com esse propsito que essa pesquisa visa anlise dos efeitos biolgicos das riparinas obtidas por sntese a partir da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae), sobre microrganismos multirresistentes, isolados de infeces humanas, animais ou de amostras ambientais. importante tambm, avaliar a ao curagnica desses produtos sobre plasmdeos em bactrias e sua ao sobre leveduras, possibilitando de alguma forma a limitao da emergncia da resistncia aos antimicrobianos. A relevncia desse estudo consiste na possibilidade de contribuir para a preveno de linhagens multirresistentes.

2 OBJETIVOS

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2 OBJETIVOS

2.1 Geral Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana in vitro, dos substratos sintticos, Riparina I, II e III, inicialmente obtidos a partir da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) sobre cepas padres American Type Culture Collection - ATCC de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e tambm sobre cepas de S. aureus de origem humana, animal e ambiental, verificando a que grupo farmacolgico (bacteriosttico ou bactericida) pertencem e estudar os efeitos biolgicos da ao desses compostos sobre plasmdeos de resistncia a drogas em linhagens de S. aureus.

2.2 Especficos Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro das riparinas I, II e III sobre amostras ambulatoriais e padres ATCC de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans. Determinar as Concentraes: Inibitria Mnima (CIM), Bactericida Mnima (CBM) e Fungicida Mnima (CFM) das riparinas ativas, pela tcnica de microdiluio em placas e pelo mtodo cavidade-placa, sobre as cepas ATCC. Determinar as Cinticas: Bacteriana (CB) e Fngica (CF) das riparinas I, II e III, sobre cepas que apresentaram sensibilidade aos respectivos substratos. Avaliar a relao estrutura/atividade das riparinas I, II e III em amostras ambulatoriais e padro ATCC de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans. Caracterizar fenotipicamente as cepas de S. aureus, utilizadas neste estudo, com relao aos padres de resistncia a antibiticos. Avaliar a ao das riparinas I, II e III na eliminao de plasmdeos de resistncia penicilina e eritromicina em cepas de S. aureus.

3 REVISO DE LITERATURA

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3 REVISO DE LITERATURA

3.1 Patognese microbiana Dentre os principais microrganismos responsveis por processos infecciosos, freqentemente isolados em humanos, e que apresentam elevada resistncia aos antimicrobianos, destacam-se: Staphylococcus aureus e Escherichia coli (TRABULSI et al., 2006). Entretanto, outros microrganismos considerados emergentes, como Listeria monocytogenes e fungos, tambm tm sua importncia devido gravidade dos processos infecciosos por eles causados, principalmente quando atingem pacientes imunossuprimidos fisiolgica ou patologicamente. Em geral, o quadro clnico da listeriose de extrema severidade caracterizando-se primordialmente, pela meningite e septicemia (HOFER, 2001). Entre os fungos leveduriformes, Candida albicans a espcie isolada com maior freqncia em infeces superficiais e/ou subcutneas (COLEMAN et al., 1998; TRABULSI et al., 2006).

3.1.1 Staphylococcus aureus Esses microrganismos pertencem famlia Micrococaceae, so

caracterizados morfo-tintorialmente como cocos Gram-positivos que crescem agrupados formando cachos irregulares (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000). O gnero Staphylococcus constitudo por vrias espcies, sendo algumas produtoras da enzima coagulase alm de outros componentes de superfcies, considerados fatores de virulncia, utilizados na identificao e diferenciao deste gnero, atravs de suas propriedades fisiolgicas, enzimticas e bioqumicas (NOVAK, 2000). Trata-se de uma das bactrias mais resistentes no formadoras de esporos. So relativamente termo-resistentes e capazes de sobreviver por longos perodos em objetos inanimados secos. Essas propriedades permitem ao S. aureus sobreviver em qualquer tipo de ambiente onde se encontram seres humanos. So considerados como potentes patgenos e so amplamente encontrados na biota humana, podendo causar vrios processos infecciosos piognicos, algumas vezes levando formao de abscessos em tecidos profundos, podendo produzir enfermidades mrbidas distintas por meio da produo de toxinas especficas

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(TRABULSI et al., 2006; BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000; NOVAK, 2000; KURODA et al., 2001). A patognese atribuda ao S. aureus devida ao nmero de fatores de virulncia na forma de toxinas, enzimas e protenas associadas parede celular, mediados por genes plasmidiais ou cromossmicos, que combinados conduzem doena (CARDOSO, 1998; PEREIRA, 2000). O potencial patognico deste microrganismo est associado diferenciada capacidade de mutao para formas resistentes, exigindo reavaliaes peridicas de seu perfil de susceptibilidade (ZAVADINACK-NETTO, et al., 2001). Esses microrganismos so capazes de adquirem resistncia aos agentes antimicrobianos quase imediatamente aps a sua introduo no mercado. Atualmente muitas cepas so resistentes a quase todos os antimicrobianos e a perspectiva de aparecimento de uma cepa resistente a todos os antimicrobianos disponveis, constitui uma sria preocupao (SCHAECHTER et al., 2002). Um dos principais aspectos da resistncia de S. aureus aos antimicrobianos, que ela pode ser codificada cromossomicamente ou mediada por plasmdeos (DYKE; RICHMOND,1967; SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005; YAMADA et al., 2006), alm do uso abusivo e indiscriminado de agentes antimicrobianos na clnica mdica humana e veterinria que tem causado efeito seletivo no surgimento e manuteno de resistncia s drogas (PEREIRA, 2000; COELHO et al., 2007). Particularmente, S. aureus, possui versatilidade no desenvolvimento de resistncia a vrios agentes antimicrobianos, contribuindo para a sua sobrevivncia em ambientes hospitalares e difuso entre pacientes, como o caso do S. aureus resistente meticilina (Staphylococcus aureus Methicillin Resistant - MRSA) e que geralmente, tambm, resistente s cefalosporinas, tetraciclinas, aminoglicosdeos, rifampicina (GILLESPIE; MCHUGH, 1997). Esses microrganismos possuem trs diferentes mecanismos de resistncia meticilina: 1) hiperproduo de betalactamases; 2) presena de uma protena ligadora de penicilina (PBP Protein Binding Penicilin) alterada, denominada PBP 2a; 3) modificaes na capacidade de ligao das PBPs, podendo os trs mecanismos estarem presentes numa mesma amostra, inclusive interagindo entre si (SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005; YAMADA et al., 2006).

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Os mecanismos pelos quais os genes de resistncia se movimentam entre os microrganismos, so complexos. Em S. aureus a resistncia mltipla resulta principalmente da presena de plasmdeos, que geralmente se encontram em mltiplas cpias, o que permite sua transferncia em uma freqncia elevada (FORBES; SHABERG, 1983; PEREIRA, 2000). A transferncia de resistncia plasmidial, tambm pode envolver processos de transduo, os quais esto relacionados ao de uma partcula viral (TRABULSI et al., 2006). Outra estratgia da resistncia em S. aureus, a aquisio de genes de resistncia no cromossomo, produzindo multirresistncia a maioria das drogas usadas na prtica clnica, como o caso da linhagem de MRSA. Tambm h relatos de envolvimento de transposons para vrias marcas de resistncia em S. aureus (LYON; SKURRAY, 1987). Vrias pesquisas foram realizadas em amostras de S. aureus, no intuito de se obter esclarecimentos sobre a localizao e interao dos genes de resistncia cromossomial ou em outros elementos genticos como plasmdeos, transposons e bacterifagos (KURODA et al., 2001). Algumas cepas MRSA so associadas a infeces nosocomiais, no entanto existem relatos de casos em pessoas saudveis e sem fatores de risco conhecidos para desenvolvimento deste tipo de infeco (NAINI et al., 2003; BERNARDES, JORGE; LEO, 2004). Algumas linhagens de S. aureus resistentes vancomicina (VRSA) tambm apresentam resistncia a potentes -lactmicos (KURODA et al., 2001). No Brasil, Pereira et al. (1997), demonstraram pela primeira vez, transferncia de resistncia tetraciclina, por conjugao mediada por fago, em linhagens de S. aureus bovinas para linhagem de laboratrio de origem humana, indicando que a conjugao pode desempenhar um importante papel na disseminao de resistncia a drogas em condies naturais. Alm da resistncia a vrios antimicrobianos, S. aureus pode ainda apresentar resistncia a ons metlicos (arsenato, cdmio, mercrio) e a biocidas, tais como acriflavina, cloreto de benzalcnio, cetrimida e ciclohexidina. A seleo e manuteno destas marcas de resistncia se explicam pela presena desses agentes, como poluentes urbanos ou industriais ou mesmo o uso hospitalar como anti-sptico (RUSSEL,1997).

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Para destruir as bactrias, muitos antibiticos se ligam a protenas da famlia PBP de forma a torn-las inativas. Essas protenas esto envolvidas na construo da parede celular dos microrganismos. Sem a parede corretamente montada, as bactrias no podem manter sua integridade e morrem. O principal caminho usado pelas bactrias para se tornar resistente a meticilina (oxacilina), envolve a aquisio do gene mecA. Esse gene comanda a sntese da protena PBP2a (adquirida ou alterada), que no desativada pelos antibiticos e capaz de formar a parede celular da bactria. No entanto PBP2a, no age sozinha; sua atividade est associada a vrias outras protenas codificadas pelo DNA da prpria bactria e pela PBP2 (inata). A resistncia ocorre pela incapacidade de agentes -lactmicos se ligarem a essa PBP interferindo na sntese da parede celular bacteriana (SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005). Em bactrias Gram positivas, a resistncia a macroldeos, pode acontecer atravs de bomba de efluxo e pela produo de uma enzima metilase que atua na poro 23S do RNA ribossmico, codificada pelo gene erm, e pode conferir resistncia cruzada a outras classes de drogas como lincosaminas e estreptograminas. Este fentipo de resistncia conhecido como MLS (macroldeoslincosamdeos-estreptogramina) e pode ser constitutvel ou induzvel. O fentipo constitutivo pode ser facilmente detectado pelo antibiograma, observando-se resistncia aos macroldeos, estreptograminas e lincosaminas. Quando o fentipo induzvel pode-se observar in vitro resistncia a eritromicina e sensibilidade clindamicina, atravs do teste de induo, conhecido por D-teste (NCCLS, 2004).

3.1.2 Escherichia coli O gnero Escherichia compreende vrias espcies, entretanto a nica espcie de importncia prtica Escherichia coli a qual se caracteriza por causar diversos processos patolgicos, tanto no seu habitat natural, o trato intestinal, quanto fora dele. E. coli a causa mais comum de infeco urinria, sendo responsvel por 90% ou mais das infeces adquiridas na comunidade. Pode tambm causar, meningite em recm-nascidos e bacteremias, sendo as fontes mais comuns os tratos urinrio e gastrointestinal, cateteres intravenosos, aparelhos respiratrios e pele. Essa espcie compreende grande nmero de grupos e tipos sorolgicos distintos, identificados por meio de anti-soros especficos. Atualmente,

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vem apresentando crescente resistncia aos agentes antimicrobianos. Esta resistncia em parte tambm plasmidial (KONEMAN et al., 2001; MIMS et al., 2005; TRABULSI et al., 2006).

3.1.3 Pseudomonas Gnero de microrganismos que compreende mais de 100 espcies so bastonetes curtos e Gram-negativos. Do ponto de vista clnico, a espcie mais importante do gnero Pseudomonas aeruginosa. Considerado um patgeno oportunista, pode ser encontrado no solo e na gua; possui necessidades nutricionais mnimas e capaz de sobreviver sob condies ambientais bastante diversas. Devido a essa adaptabilidade e sua resistncia tanto intrnseca quanto adquirida, aos antimicrobianos mais comuns, o gnero Pseudomonas, encontra no hospital um ambiente favorvel ao seu desenvolvimento (SCHAECHTER et al., 2002), sendo causa freqente de infeces nosocomiais, e agente causal de inmeras infeces humanas. P. aeruginosa um patgeno importante, principalmente em indivduos imunocomprometidos, com fibrose cstica, queimaduras e diabetes (TRABULSI, et al., 1999; SCHAECHTER et al., 2002). Tambm apresenta importncia em estudos relacionados a microbiologia de alimentos, pois so microrganismos causadores de deteriorao (FRANCO; LANDGRAF,1996).

3.1.4 Fungos leveduriformes Dentre os fungos leveduriformes o gnero Candida destaca-se por ser responsvel por vrias micoses oportunistas, ou seja, micoses causadas por fungos de baixa virulncia que convivem pacificamente com o hospedeiro, mas, ao encontrar condies favorveis, como distrbios do sistema imunodefensivo, desenvolvem seu poder patognico invadindo tecidos. Atingem indivduos de ambos os sexos, de todas as raas e faixas etrias (GOMPERTZ et al., 1999). O gnero Candida responsvel por cerca de 80% das infeces fngicas no mbito hospitalar e constitui causa relevante de infeces na corrente sangnea (COLOMBO; GUIMARES, 2003). O agente mais freqente Candida albicans,

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porm outras espcies como C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis podem ser encontradas em diversos processos patolgicos (GOMPERTZ et al., 1999). Alguns processos patolgicos envolvendo espcies emergentes, como C. kefyr, C. rugosa, C. utilis e C. inconspicua entre outras, tambm tem sido descritos (COLEMAN et al., 1998). O aumento das infeces por Candida spp. deve-se entre outros fatores, aos tratamentos com antimicrobianos de amplo espectro, ao uso de nutrio parenteral, de cateteres intravenosos e de entubao endotraqueal. A maior freqncia ocorre em pacientes imunossuprimidos e/ou submetidos a cirurgias de grande porte (ZARDO; MEZZARI, 2004). Vrios so os fatores de virulncia encontrados nas espcies de Candida, entre eles destacam-se a produo de toxinas e enzimas proteolticas extracelulares, que constitui os mais importantes fatores relacionados ao desencadeamento das infeces fngicas. A produo de fosfolipases e adesinas pela C. albicans tambm so componentes importantes no reconhecimento e disseminao hematognica (ZARDO; MEZZARI, 2004).

3.2 Antimicrobianos Com base nas propriedades farmacolgicas, as substncias antimicrobianas podem ser divididas em dois grupos principais: bactericida e bacteriosttico. O primeiro, inclui as substncias que exibem propriedades de eliminao de microrganismos em funo da concentrao como fluorquinolonas e aminoglicosdeos. Para este grupo, quanto maior a concentrao da droga, mais rpida a erradicao dos microrganismos. O segundo grupo inclui as substncias capazes de impedir a multiplicao da populao bacteriana, cujo pico das concentraes pouco relevante. O tempo durante o qual as concentraes so mantidas acima da Concentrao Inibitria Mnima (CIM ou MIC) crtico para a erradicao bacteriana. Neste grupo, esto as drogas independentes da concentrao, ou seja, so drogas dependentes do tempo de uso exposio ou contato. Na prtica, os antimicrobianos bacteriostticos, so geralmente eficazes (AGUIAR, 2003).

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De um modo geral, um agente bactericida que cause a morte rapidamente de microrganismos prefervel a um agente bacteriosttico que inibe reversivelmente o crescimento microbiano. No entanto, a preferncia na clnica mdica e veterinria, pelo uso de agentes bactericidas depende de vrias circunstncias relacionadas ao processo infeccioso. Por exemplo, a eritromicina, um inibidor da sntese protica, um agente bacteriosttico, mas interrompe bruscamente a sntese de toxinas proticas; a penicilina, ao contrrio, bactericida, mas no imediatamente, de modo que, durante um intervalo de tempo at que a substncia exera seu efeito ltico; e os microrganismos continuam a produzir toxinas (AGUIAR, 2003; TRABULSI et al., 2006). A distino entre bacteriosttico e bactericida no deve ser tomada de forma absoluta. Primeiro, porque a ao da droga pode diferir em distintos organismos; segundo, porque algumas drogas apresentam cintica de ao peculiar, o que as torna de difcil classificao. Em outros casos, a combinao de duas substncias bacteriostticas pode induzir uma ao bactericida (SCHAECHTER et al., 2002). importante ressaltar, a necessidade de desenvolver pesquisas que busquem outras maneiras de atuao das drogas, tais como a capacidade de inibir fatores de virulncia, como toxinas e adesinas. No entanto, estas drogas no afetariam o crescimento de microrganismos in vitro e, por conseguinte sua ao se manifestaria apenas in vivo (SCHAECHTER et al., 2002). A farmacocintica e a farmacodinmica esto inter-relacionadas, de modo que as propriedades farmacocinticas de uma droga caracterizam o aumento e a queda das concentraes da droga no sangue e no tecido no decorrer do tempo. Os parmetros farmacodinmicos integram a atividade microbiolgica e farmacocintica de uma droga antimicrobiana, focalizando seus efeitos biolgicos, especialmente a inibio do crescimento e a eliminao de patgenos (BURGESS, 2000). A transferncia de material gentico entre organismos da mesma ou de diferentes espcies desempenha um papel crucial na evoluo da resistncia aos antimicrobianos. Por exemplo, em S. aureus, essa transferncia pode ocorrer por transformao, transduo e processos que envolvem contato entre as clulas, mediada por fagos ou conjugao propriamente dita. Alguns fatores podem afetar a transferncia conjugativa de plasmdeos, como a composio do meio, pH e temperatura. Antibiticos como a gentamicina e a vancomicina estimulam a

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freqncia de transferncia de 10 a 20 vezes enquanto meticilina e alguns inibidores da sntese de protenas reduzem essa freqncia (AL - MASAUDI et al., 1991). A resistncia mediada por plasmdeos, pode ser simples, porm na maioria das vezes mltipla, tornando a bactria, resistente a dois ou mais antimicrobianos. Isto ocorre devido presena de genes de resistncia, para diferentes antimicrobianos, num s plasmdeo (TRABULSI et al., 2006). Geralmente, a multirresistncia a antimicrobianos, resulta da presena de plasmdeos em mltiplas cpias, o que garante a sua distribuio durante a diviso celular e permite a transferncia sem causar na maioria das vezes um custo biolgico para a clula bacteriana (TOMAZ, 1994; PEREIRA; SIQUEIRA, 1995). Os plasmdeos podem ser inativados ou removidos da clula, curados, depois de serem submetidos a diferentes condies de estresse, como mudanas na temperatura de incubao e presena de determinadas substncias adicionadas aos meios de cultura. A eliminao de plasmdeos est bem estabelecida atravs de uma variedade de compostos, como os corantes de acridina, brometo de etidio, rifampicina, sal de bis-amnio, tioridazina (uma fenotiazina), assim como tambm antibiticos 2000). Recentemente, alguns autores relataram a eliminao de resistncia aos frmacos tetraciclina, estreptomicina e penicilina por concentraes sub-inibitrias de fluorquinolonas, em cepas de S. aureus de origem bovina (PEREIRA et al., 2004) e pelo extrato metanlico de Punica granatum em cepas de S. aureus (MRSA e MSSA) de origem clnica (BRAGA et al., 2005). inibidores da sub-unidade B da DNA-girase, novobiocina, e coumermicina (HOOPER et al., 1984; WEISSER; WIEDMANN, 1985; PEREIRA,

3.2.1 Mecanismos de ao de alguns antimicrobianos -lactmicos (Penicilina) Todos os -lactmicos (cefalosporinas, oxacilinas, meticilina e outras penicilinas) caracterizam-se por apresentarem um anel -lactmico que essencial para a sua atividade antibacteriana (MACEDO et al., 2005).

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Embora o mecanismo de ao das penicilinas (molculas caracterizadas por anel tiazolidnico e -lactmico), ainda no tenha sido completamente determinado, sua atividade bactericida inclui a inibio da sntese da parede celular e a ativao do sistema autoltico endgeno da bactria. Esse processo ocorre atravs da inativao da transpeptidao na formao do peptideoglicano (inibidor de enzimas autolticas) da parede celular levando lise da bactria (RANG et al., 2000; BRAOIOS, 2005). A ao da penicilina depende da parede celular que contm na sua composio, peptideoglicano. Durante o processo de replicao bacteriana, a penicilina inibe as enzimas que fazem a ligao entre as cadeias peptdicas, impedindo, portanto, o desenvolvimento da estrutura normal do peptideoglicano. Estas enzimas, transpeptidase, carboxipeptidase e endopeptidase, localizam-se logo abaixo da parede celular e so denominadas PBPs. A habilidade de penetrar na parede celular e o grau de afinidade destas protenas, com a penicilina, determinam a sua atividade antibacteriana (RANG et al., 2000; KONEMAN et al., 2001). As bactrias podem desenvolver resistncia aos -lactmicos atravs de trs mecanismos: preveno da interao entre o antimicrobiano e a PBP alvo, incapacidade de se ligar PBP e hidrlise do antimicrobiano por -lactamases. Existem vrios tipos de enzimas -lactamases, que so classificadas pela sua seqncia de aminocidos e divididas em quatro classes (A, B, C e D) baseadas em suas estruturas e substratos especficos (MACEDO et al., 2005). As -lactamases rapidamente se dissemam e so encontradas em muitos isolados clnicos tanto de S. aureus quanto em outras espcies de Staphylococcus (RANG et al., 2000). O uso indiscriminado da penicilina favoreceu a grande emergncia de resistncia em S. aureus. Essa resistncia pode ser mediada por plasmdeos, tendo diferentes causas, entre elas: produo de -lactamases, reduo da permeabilidade da membrana externa (mais comum em microrganismos Gram negativos) e ocorrncia de stios modificados de ligao penicilina, particularmente importante em cepas MRSA (RANG et al., 2000; TAVARES, 2000; MASUNARI; TAVARES, 2006). As bactrias, por sua vez, diferem na sua composio quanto ao tipo e concentrao de PBPs e, conseqentemente, quanto permeabilidade de suas paredes celulares ao antibitico. Tendo-se assim, diferentes suscetibilidades

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bacterianas penicilina. Alguns microrganismos possuem enzimas autolticas defeituosas e so inibidos, porm no sofrem lise e so considerados como tolerantes (RANG et al., 2000). Quinolonas O termo quinolona foi utilizado pela primeira vez por Prince, em 1949, ao descrever um cido carboxlico com a estrutura das quinolenas e contendo um tomo de oxignio na posio 4 da molcula. Esta substncia foi obtida por degradao de certos alcalides, no sendo reconhecida como uma droga com atividade biolgica, no entanto, serviu como estrutura bsica para o desenvolvimento de uma srie de compostos com aplicaes teraputicas (PEREIRA, 2000). O primeiro composto dessa classe de drogas foi o cido nalidxico (prottipo de primeira gerao), comercializado em 1964, a partir dele, outros compostos foram sintetizados, dentre eles destaca-se o cido pipemdico (TILLOTSON, 1996; MIMS et al., 2005). Um novo e decisivo avano na famlia das quinolonas ocorreu em 1980, com a introduo das fluorquinolonas. Estes agentes compreendem um grupo de compostos antimicrobianos, que resultam de modificaes estruturais do ncleo quinolnico, pela introduo de tomo de flor e um grupo piperazinil. Estes radicais conferiram as quinolonas maior espectro antimicrobiano e diminuio dos efeitos adversos (ZUCARELLI, 1988; PEREIRA, 2000). Todas as quinolonas agem por inibio da enzima alvo DNA-girase, uma topoisomerase, responsvel primariamente pela introduo da superhelicoidizao negativa do DNA, na presena de ATP. Estas alteraes no estado topolgica da molcula do DNA desempenham importantes funes nos processos de replicao, transcrio, recombinao. A inibio da atividade da DNA-girase pelas fluorquinolonas, resulta na interrupo da sntese do DNA e consequentemente na morte da clula bacteriana (TAKENOUCHI et al., 1995). Macroldios (Eritromicina) O termo macroldio est relacionado com a estrutura formado por um anel lactona de vrios membros ao qual se ligam um ou mais desoxi-acares. Durante aproximadamente 40 anos, a eritromicina foi o nico antibitico macroldeo de uso

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clinico geral. O mecanismo de ao da eritromicina, assim como de outros macroldeos (claritromicina e azitromicina), baseado no fato que essas substncias inibem a sntese de protenas bacterianas atravs de um efeito sobre a translocao. A eritromicina se liga ao RNA ribossmico 23S (rRNA) na subunidade 50S do ribossomo e bloqueia o passo de translocao no processo de sntese de protenas (atividade bacteriosttica), impedindo assim a liberao do RNA de transferncia (tRNA) aps a formao da ligao de peptdeos (MIMS et al., 2005). Esse processo pode ocorrer por modificao enzimtica - metilao do rRNA de bactrias Gram positivas e a metilase envolvida usualmente codificada por genes plasmidiais A eritromicina pode interferir na ligao do cloranfenicol que tambm atua neste local. (SCHAECHTER et al., 2002). Segundo Rang et al. (2000), alguns microrganismos resistentes, com mutaes em componentes nessas subunidades ribossmicas, 23S e 50S, no se ligam ao frmaco. Acredita-se que o mesmo no iniba diretamente a formao de ligaes peptdicas, mas sim, a etapa de transferncia, atravs da qual uma molcula de peptidil-tRNA recm sintetizada, que migra do stio aceptor sobre o ribossomo, para o stio peptidil, ou doador. Os macroldios podem ser bactericidas e/ou bacteriostticos. A eritromicina um indutor de resistncia, e as cepas resistentes a esse antibitico tambm podero ser resistentes lincomicina e clindamicina, em um processo conhecido como resistncia MLS (macroldeos-lincosamdeosestreptogramina). A capacidade de induo varia entre as espcies bacterianas, porm so mais comuns em cocos Gram positivos (MIMS et al., 2005). Tetraciclinas As tetraciclinas formam uma famlia de grandes estruturas cclicas com vrios stios para possveis substituies qumicas. O grupo inclui alm da tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina e minociclina. As tetraciclinas so inibidores especficos do ribossomo de clulas procariticas, bloqueando o receptor na subunidade 30S que se liga ao t-RNA durante a traduo gnica. Atuam inibindo a sntese de protenas aps sua captao em microrganismos sensveis por transporte ativo (RANG et al., 2000).

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As tetraciclinas so antimicrobianos bacteriostticos, de amplo espectro, porm muitas cepas microbianas tornaram-se resistentes a esses frmacos, diminuindo sua utilidade. A resistncia mediada principalmente por plasmdeos que possuem genes capazes de codificar uma protena (bomba de efluxo) que ativamente expulsa a tetraciclina da clula; esses plasmdeos tambm podem codificar uma protena capaz de ligar-se ao ribossomo impedindo a ao da tetraciclina (RANG et al., 2000). Aminoglicosdeos Os aminoglicosdeos constituem um grupo de antimicrobianos com estrutura qumica complexa, que se assemelham entre si quanto sua atividade antimicrobiana, caractersticas farmacocinticas e toxicidade. Possuem um dos mais complexos mecanismos de ao de todos os antimicrobianos antiribossmicos. Basicamente, ele segue trs etapas: penetrao na membrana externa das bactrias Gram negativas; associao a um sistema de transporte ativo de duas fases; e ligao subunidade ribossmica 30S para inibir a sntese protica, principalmente na etapa inicial, interferindo na codificao feita pelos ribossomos, conduzindo assim a produo de protenas no-funcionais (RANG et al., 2000; SCHAECHTER, et al., 2002; MIMS et al., 2005). Os dois principais mecanismos de resistncia aos aminoglicosdeos foram descobertos em bactrias Gram negativas. O primeiro a inativao do seu transporte, esse mecanismo de resistncia ocorre em bactrias anaerbicas e o segundo envolve a inativao enzimtica, que considerado como o mecanismo mais comum em amostras de origem clnica. Muitas das diferentes enzimas que inativam essas substncias foram identificadas em linhagens de E. coli, Pseudomonas e Staphylococcus. Normalmente, as enzimas que inativam aminoglicosdeos so codificadas por plasmdeos ou transposons, alm disso, mais de um desses determinantes genticos podem ser transportado em um plasmdeo (SCHAECHTER, et al., 2002). Antifngicos O nmero de agentes teraputicos, adequados, contra fungos (antifngicos ou antimicticos), quando comparados s substncias antibacterianas, muito limitado. Geralmente, os antifngicos so considerados como substncias txicas e

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alguns no apresentam toxicidade seletiva, como o caso da maioria dos antimicrobianos que inibem os ribossomos de fungos e so tambm ativos contra ribossomos humanos (RANG et al., 2000). No existem, atualmente, inibidores da sntese protica dos fungos que tambm no inibam a via equivalente nos mamferos (MIMS et al., 2005). Entretanto, existem antifngicos com toxicidade seletiva, dentre eles os polinicos, anfotericina B, considerada o padro ouro, nistatina e natamicina que se ligam com maior avidez ao ergosterol das membranas de fungos do que ao colesterol das membranas de eucariotos superiores; os imidazis que constituem um grupo de frmacos com maior especificidade para o citocromo P-450 desmetilase fngica do que para a desmetilase animal, envolvida na sntese de esteris; e a griseofulvina que considerada como um dos antifngicos mais eficazes contra micoses superficiais e age ligando-se fortemente queratina recm-formada (RANG et al., 2000; NOBRE et al., 2002). Foi iniciada uma nova era no tratamento das micoses, com a introduo dos antifngicos azlicos, especialmente, fluconazol e itraconazol que possuem boa disponibilidade via oral e baixa incidncia de efeitos adversos (ZARDO; MEZZARI, 2004). Tem sido observado, com freqncia, o isolamento de cepas de leveduras com suscetibilidade diminuda ou resistente aos antifngicos. Esta resistncia pode ser clnica, por conseqncia do baixo nvel do frmaco no tecido e no sangue, devido interao entre frmacos ou imunodepresso do paciente, ou pode ser in vitro, onde as cepas suscetveis se transformam em resistentes devido ao contato prvio com o antifngico. consenso que a resistncia aos frmacos depende da interao deste, com o hospedeiro e com o fungo. Porm fatores relacionados aos hospedeiros so considerados como os mais importantes para o surgimento da resistncia (SILVA; DAZ; FEBR, 2002). O tratamento de infeces fngicas ainda dificultado por problemas de solubilidade, estabilidade e absoro dos frmacos existentes e a busca de novos agentes antifngicos, constitui prioridade mxima. Alm disso, a resistncia medicamentosa cada vez maior e nenhum agente antifngico ideal se usado isoladamente (MIMS et al., 2005).

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3.3 Resistncia bacteriana aos antimicrobianos A resistncia aos antimicrobianos pode ter origem gentica (cromossmica e extra-cromossmica por conjugao, transduo, transformao e transposio) e no gentica (relacionada ao metabolismo), e tem se tornado um fato rotineiro desde o incio da era dos antibiticos, considerados como uma das grandes contribuies da medicina no Sc. XX. Entretanto, essa resistncia microbiana tem acarretado crescente morbidade e mortalidade, bem como elevao nos custos da sade. Por esta razo a Organizao Mundial de Sade (OMS), o Centro de Preveno e Controle de Enfermidades (CDC) e ouros rgos americanos e europeus, tm desenhado novos programas e sistemas de vigilncia da resistncia bacteriana. Mesmo assim, solicita-se que cada pas tenha seu prprio programa de vigilncia nacional e local para poder realizar um melhor controle desse fenmeno (CRESPO, 2002). Desde o incio dos anos 80, o nmero de antimicrobianos em fase de desenvolvimento diminuiu consideravelmente, ao mesmo tempo, a resistncia bacteriana aos antimicrobianos tem crescido de forma imensurvel. Enquanto, nos anos 70 e 80, as bactrias Gram-negativas resistentes eram consideradas como o principal flagelo, entretanto no final do Sc. XX, as bactrias Gram-positivas, resistentes, tornaram-se importantes, indicando que estes microrganismos esto cada vez mais desenvolvendo novos mecanismos de resistncia. Com o uso excessivo de antimicrobianos, principalmente penicilina G, algumas cepas resistentes a esse frmaco comearam a se tornar um grande problema, principalmente dentro dos hospitais (BRAOIOS, 2005). O desenvolvimento de agentes antimicrobianos eficazes para o tratamento de doenas infecciosas representa uma das mais marcantes realizaes do Sc. XX. Como conseqncia desse avano cientfico, evidenciou-se uma considervel reduo de morbidade e mortalidade associadas. Entretanto, a emergncia disseminada de resistncia adquirida a antimicrobianos nos ltimos anos, facilitada por diversos fatores demogrficos tais como: crescimento populacional e urbanizao, facilidade de deslocamento de grandes continentes populacionais, como o turismo, por exemplo, constituem, atualmente, uma sria ameaa sade pblica global, tanto em ambientes hospitalares quanto nas comunidades. importante ressaltar que o desenvolvimento de qualquer novo frmaco com atividade

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antimicrobiana vem acompanhado do aparecimento da resistncia microbiana. E que a emergncia de patgenos resistentes, aos antimicrobianos, uma ameaa a esses avanos (MOELLERING Jr., 2000). A resistncia bacteriana tornou ineficaz, vrios tratamentos com

antimicrobianos anteriormente valiosos e ameaa a eficcia de novas terapias similares. O aparecimento de resistncia resulta em vrios fatores, tais como o uso crescente e inadequado de antimicrobianos, procedimentos invasivos, em grande nmero de hospedeiros susceptveis e falhas no controle de infeces, ocasionado aumento da transmisso de organismos resistentes, principalmente em ambientes hospitalares e em pacientes imunocomprometidos (BRAOIOS, 2005). A presso seletiva resultante da administrao de drogas antimicrobianas pode levar ao aparecimento de cepas previamente susceptveis, que adquiriram resistncia ou proliferao de cepas que so intrinsecamente resistentes. Em geral a resistncia adquirida por mutao ou pela aquisio de material gentico com cdigo de resistncia, ou seja, a informao gentica que controla a resistncia bacteriana aos antimicrobianos codificada no DNA cromossomial e no DNA extracromossomial, nos plasmdeos (BRAOIOS, 2005). O uso cada vez maior de antimicrobianos na prtica clnica, assim como tambm a enorme quantidade de antibiticos utilizados, s vezes usados indiscriminadamente, na agricultura, na criao de peixes, aves e outros animais, possibilita condies favorveis para a seleo de microrganismos resistentes (TOMAZ, 1994; BRAOIOS, 2005). Essa presso ambiental proveniente do uso excessivo de agentes antimicrobianos evidentemente contribuiu para disseminar os determinantes de resistncia. Praticamente todas as bactrias patognicas adquiriram genes de resistncia antimicrobiana (FILE Jr., 2000). Muitos fatores contribuem para o desenvolvimento da resistncia bacteriana s substncias antimicrobianas, porm um dos principais fatores a exposio repetida, concentrao de antimicrobianos, abaixo do ideal. Dados farmacolgicos que descrevem a relao entre concentrao da droga no soro e seus efeitos farmacolgicos podem ser teis em esquemas de tratamento que minimizam a probabilidade de exposio dos patgenos a nveis subletais de drogas (BURGESS, 2000).

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3.3.1 Mecanismos genticos de aquisio de resistncia aos antimicrobianos Mltiplos, complexos e ainda no totalmente conhecidos, so os mecanismos reguladores da expresso de resistncia pelos quais os microrganismos podem sobreviver aos efeitos dos antimicrobianos (MARANGONI, 1997; NOVAK, 2000). Entre os vrios mecanismos, incluem-se os de resistncia adquirida, tais como: alterao da estrutura molecular de antimicrobianos ou produo de enzimas que inativam a droga ou modificam grupos funcionais farmacologicamente importantes presentes em sua estrutura, criando funes inativas para o reconhecimento molecular (por exemplo: -lactamases ou enzimas modificadoras de aminoglicosdeos), alterao das protenas ligantes da penicilina ou outros pontosalvo nas paredes das clulas, alvos modificados da DNA-girase, mutaes de permeabilidade, que restringe a penetrao de alguns compostos (as bombas de resistncia multidrogas MDRs), efluxo contnuo do antibitico (resistncia a tetraciclina e fluorquinolonas) modificaes ribossmicas e rotas metablicas alternativas (DYKE; RICHMOND, 1967; FILE Jr., 2000; STERMITZ et al., 2000; TEGOS et al., 2002; FUCHS, 2004; MOREIRA, 2004). A utilizao de um ou mais desses mecanismos, permite que linhagens bacterianas consigam reprimir a ao at dos antimicrobianos mais promissores, independentemente da classe qumica a qual pertenam (SILVEIRA et al., 2006b). A resistncia aos antimicrobianos pode ser mediada por intercambio gentico e por mutaes cromossmicas. Pode ser transferida entre bactrias pelos plasmdeos, transposons, ou pelos mecanismos de insero seqencial. Entretanto a forma mais eficaz e poderosa de propagao da informao gentica ocorre por intermdio dos plasmdeos R tambm conhecidos como Fatores R, que so plasmdeos conjugativos capazes de conferir, aos microrganismos, resistncia a diversos grupos de antimicrobianos (TRABULSI et al., 2006). Grande parte da resistncia de diversos microrganismos, s drogas, de natureza extracromossmica, isto , determinada por plasmdeos portadores de genes para essa finalidade (LYON, SKURRAY, 1987). A transferncia plasmidial pode ser dividida em quatro estgios: formao de uma unio especfica, doadorreceptor (contato efetivo); preparao para transferncia do DNA (mobilizao); transferncia do DNA; e formao de um plasmdeo funcional replicativo no receptor. Nem todos os plasmdeos so capazes de desenvolver todos estes estgios,

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portanto, de acordo com sua funcionalidade os plasmdeos so classificados como: conjugativos, mobilizveis e autotransmissveis (TRABULSI et al., 2006). O uso constante e inadequado de antimicticos e inibidores celulares, em geral, tm levado seleo de isolados resistentes, tornando estes frmacos pouco eficientes (ROCHA, 2002). Os primeiros dados de resistncia aos antifngicos ocorreram em pacientes com candidase muco-cutnea, tratados com cetoconazol, principalmente em pacientes imunocomprometidos pela infeco com o vrus da AIDS (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida), pela quimioterapia de pacientes com cncer ou nos transplantados. O desenvolvimento de resistncia aos azis precede o uso prolongado e repetido do fluconazol na teraputica de pacientes com candidase oral e esofgica (RUHNKE, et al, 1994). Os principais grupos de antifngicos de uso clnico so os polienos, os derivados azlicos e os alilaminas/tiocarbamatos, todos interagem com o ergosterol, principal esterol presente na membrana plasmtica da maioria dos fungos (ZARDO; MEZZARI, 2004). O ergosterol necessrio na manuteno da permeabilidade e fluidez da membrana garantindo a modulao de enzimas ligadas membrana plasmtica. A ausncia do ergosterol e o acmulo de seus precursores afetam a estrutura da membrana plasmtica e a absoro de vrios nutrientes, tornando o fungo vulnervel a danos (ROCHA, 2002). Os principais mecanismos de resistncia aos antifngicos esto relacionados s alteraes na rota da biossntese do ergosterol e da expresso do gene ERG 11 envolvidos na sntese da enzima 14 alfa-demetilase (14 DM) que reduz o acmulo intracelular do frmaco e/ou inativao do mesmo (MORSCHHUSER, 2002). necessrio conhecer os mecanismos da resistncia das espcies de Candida para auxiliar no desenvolvimento de estratgias em novas aes teraputicas. O Quadro 1 apresenta de modo simplificado alguns dos mais comuns mecanismos de resistncia aos antimicrobianos.

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Quadro 1. Mecanismos de resistncia aos antimicrobianos Mediao por plasmdeos

Antimicrobianos

Mecanismos de resistncia

Penicilinas e Cefalosporinas

Sim

Hidrlise do anel -lactmico pelas -lactamases. Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente. Bomba de Efluxo; Deficincia no transporte ativo da tetraciclina. Modificao enzimtica da substncia pela ao de enzima codificada por plasmdeos R. Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente. Modificao enzimtica (metilao do RNA ribossmico 23S). Alvo alterado, permeabilidade alterada, inativao do agente. Mutao espontnea da DNA-girase e outras enzimas-alvo; Alterao da permeabilidade s quinolonas. Modificao das protenas ligadoras de penicilina (no em -lactamases) Modificao da permeabilidade da membrana citoplasmtica fngica. Alteraes na biossntese do esterol.

Tetraciclinas

Sim

Aminoglicosdeos

Sim

Macroldeos (Eritromicina)

Sim

Quinolonas

No

Meticilina

No

Azis, Anfotericina e Nistatina

No

Griseofulvina

No

Modificao da sntese de cido nuclico.

Fonte: Adaptado de SCHAECHTER et al., 2002; MIMS et al., 2005.

3.3.2 Plasmdeos A caracterizao de plasmdeos compreende entre outros estudos, a determinao do seu grupo de incompatibilidade, a verificao de sua capacidade de transferncia e mobilizao e determinao do seu peso. Este tipo de anlise permite informaes sobre as relaes filogenticas e a origem de uma determinada

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amostra bacteriana e tambm sobre os tipos de plasmdeos que ela possui (CEBALLOS, 1984). Entre as vrias propriedades mediadas pelos plasmdeos de maior relevncia mdica, esto as relacionadas com a resistncia a antibiticos e aos fatores de virulncia. Existe grande variedade de plasmdeos, diferentes em tamanho, composio gentica e capacidade de transferncia entre bactrias. Vrios tipos distintos de plasmdeos penicilinase podem ser encontrados em S. aureus. Essa diferenciao est baseada na proporo da produo da enzima penicilinase e na degradao dessa enzima extracelularmente (DYKE; RICHMOND, 1967). Alguns plasmdeos realizam sua prpria transferncia entre bactrias da mesma espcie ou de espcies diferentes, estes so chamados de plasmdeos de conjugao. Muitos plasmdeos de resistncia a antibiticos, tambm so plasmdeos de conjugao. Alguns apresentam capacidade de se replicar em diferentes hospedeiros e propagar a resistncia s drogas entre espcies bacterianas no-relacionadas. Esses plasmdeos contribuem para o drstico aumento da resistncia antimicrobiana em populaes naturais (SHCAECHETER et al., 2002). Os plasmdeos transferveis podem possuir genes que apresentam cdigo de transferncia em relao a uma ampla gama de drogas antimicrobianas. Assim, para os microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, uma nica transferncia pode resultar na aquisio de vrios determinantes de resistncia microbiana. A resistncia antimicrobiana um problema emergente na medicina humana e exige uma mudana na terapia emprica e reviso das estratgias dos procedimentos de testes. A velocidade na qual se desenvolvem os microrganismos est relacionada sua exposio aos agentes antimicrobianos (TENOVER, 2000). Certos plasmdeos, como o plasmdeo R, amplamente distribudo,

transportam um ou mais transposons, elementos de transposio de regies de DNA, responsveis por resistncia a drogas (Figura 01). A capacidade desses determinantes de saltar de um plasmdeo para outro, propicia s bactrias a capacidade de se adaptarem a ambientes hostis, como o de hospitais, comumente inundado por antibiticos. Nesses tipos de ambientes, as bactrias podem tornar-se resistentes a antibiticos pela aquisio de genes de resistncia. Devido presso seletiva, os plasmdeos R podem adquirir muitos transposons com novos genes de

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resistncia a drogas e como muitos desses plasmdeos R so de conjugao, a resistncia a mltiplas drogas pode disseminar-se entre vrios tipos de bactrias (SCHAECHTER et al., 2002).

Figura 1. Plasmdeo de resistncia

Fonte: Tortora et al., 2000

3.3.3 Transposons (Tn) Elementos de transposio, ou transposons, so regies de DNA que podem se transferir de uma regio para outra do genoma, deixando ou no uma cpia no local antigo onde estavam. A transposio pode ser para o mesmo cromossoma, para outro cromossoma, para um plasmdeo ou para um fago. Foram descobertos em torno de 1950, por Barbara McClintock, inicialmente no milho e bem mais tarde em bactrias; esto presentes em todos os organismos (SUZUKI et al., 1998; TORTORA et al., 2000). Os transposons podem ser divididos em duas classes: transposons compostos, onde duas cpias de um elemento IS (Seqncia de Insero) idntico flanqueiam genes de resistncia aos antimicrobianos, como por exemplo, a resistncia a canamicina no Tn5; e transposons simples, como o Tn3, que codifica resistncia aos -lactmicos (MIMS et al., 2005). Existe uma enzima associada com a transposio, denominada transposase, que normalmente codificada pelo prprio elemento de transposio, que, portanto, carrega consigo o mecanismo para a transposio. Outros elementos importantes da transposio so as extremidades do mesmo, geralmente repeties invertidas na faixa de 30bp (pares de base). A freqncia de transposio comparvel taxa de

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mutao espontnea que ocorre nas bactrias, geralmente baixa em torno de 10-5 a 10-7 por gerao. Os transposons so teis na engenharia gentica por transportarem genes exgenos, de possvel interesse clnico, como o gene da resistncia a antimicrobianos (SCHAECHTER, et al., 2002; TORTORA et al., 2000).

3.4 Aspectos botnicos e fitoqumicos da Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) 3.4.1 Aniba riparia (Nees) Mez (Lauraceae) A famlia Lauraceae considerada uma das famlias mais primitivas pertencente diviso Magnoliophyta, e apresenta-se amplamente distribuda atravs das regies tropicais e subtropicais do planeta, sendo formada por 49 gneros e cerca de 3.000 espcies. Os primeiros registros relativos utilizao desta famlia datam 2.800 a.C. sendo originrios da Grcia antiga. O destaque da famlia se d pela sua importncia econmica, onde algumas espcies so utilizadas pela indstria para fabricao de diversos produtos, porm, a maioria das espcies tem seu uso restrito s comunidades tradicionais que detm o conhecimento emprico da utilizao destas plantas (MARQUES, 2001). No gnero Aniba, estabelecido por Aublet (1775), incluem-se 41 espcies classificadas em seis subgrupos. Sua distribuio se estende desde as Antilhas, Guianas, Andes, regies secas do centro e sul do Brasil. Algumas destas espcies, por exemplo, A. perutilis e A. canelilla so utilizadas na marcenaria, dormentes de trilhos e em construes durveis (LON; PERNIA, 2000). Em estudos sobre a anatomia do lenho de oito espcies do gnero Aniba, incluindo a Aniba riparia, foi observado a cor amarela, odor aromtico e textura mediana (LON; PERNIA, 2000; MARQUES, 2001). A. riparia rvore de mdio porte, com folhas cartceas e foscas em ambas as faces, Apresenta reticulao aureolada, ramos com aproximadamente 3 mm de espessura, marrons e lenticelados, pecolo canaliculado, engrossado na base e gema terminal menor que 4 mm, arqueadas, pelo menos os pares basais. Folha no papilosa (Figura 2) (VICENTINI et al., 1999).

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Figura 2. Foto de exsicata de Aniba riparia

Fonte:http://fm1.fieldmuseum.org/vrrc/index.php?language=esp& page=view&id=26963&PHPSESSID=fc4166ccc9368eb31a2ecb8 134721b67&PHPSESSID=fc4166ccc9368eb31a2ecb8134721b67

No Brasil A. riparia nativa da regio amaznica, podendo tambm ser encontrada em outras regies. Dela pode-se obter um extrato dos frutos e dos clices persistentes que possuem atividade comprovada contra Candida albicans, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus (MARQUES, 2001).

3.4.2 Alcamidas de plantas A condensao qumica de um cido com uma amina resulta na formao de uma amida. O grupo funcional amida ubquo, se encontra em todos os organismos vivos constituindo as unies peptdicas, ou seja, a unio entre os aminocidos para

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formao da estrutura primria das protenas, base funcional da vida (MOLINATORRES; GARCIA-CHVEZ, 2001). As amidas como produtos naturais, no so abundantes. Um exemplo interessante deste grupo de compostos so as alcamidas que compreendem um grupo aproximadamente de 70 estruturas conhecidas e distribudas no reino vegetal. Do ponto de vista biogentico, as alcamidas representam uma classe distinta de produtos naturais que se forma ao combinar duas diferentes rotas metablicas (MOLINA-TORRES; GARCA-CHVEZ, 2001). Esto constitudas pela unio de um cido graxo, de cadeia longa que pode ser de 8 a 18 tomos de carbono. A cadeia geralmente aliftica ou linear, unida a uma amina proveniente de algum aminocido por descarboxilao no momento da condensao. Dependendo do nmero de ligaes duplas que apresentem, as alcamidas so definidas em dois grupos principais: alcamidas alifticas, que tem apenas duplas ligaes e alcamidas acetilnicas, com pelo menos uma ligao tripla (MOLINA-TORRES; GARCACHVEZ; RAMREZ-CHVEZ, 1999) e as que apresentam anis homo ou heterocclicos que so mais observadas na famlia Piperaceae (PARMAR et al., 1997). As alcamidas so consideradas como compostos bioativos, visto que uma pequena quantidade destes compostos produz uma resposta em clulas receptoras. So encontradas em vrios grupos de plantas, dos quais os mais importantes esto presentes nas famlias Asteraceae, Solanaceae e Piperaceae. Cada uma delas tem suas prprias caractersticas individuais, porm interessante citar que suas molculas apresentam estruturas qumicas relacionadas. As alcamidas alifticas tm demonstrado sua eficcia como compostos medicinais, saborizantes e no controle biolgico, sendo desta forma um grupo de metablitos de grande interesse na atualidade (MOLINA-TORRES; GARCA-CHVEZ, 2001).

3.4.3 Riparinas Riparinas so alcamidas presentes na A. riparia e obtidas por sntese, aps condensao de duas molculas, o ter metlico da tiramina e cido 2hidroxibenzico, mais conhecido como cido saliclico (BARBOSA-FILHO, 1997).

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De acordo com Seixas (1996), a sntese das riparinas, pode ser dividida em 5 grupos: 1. Acoplamento do ter metlico da tiramina com cloreto de benzoila (riparina I), 2. Acoplamento do ter metlico da tiramina com o salicilato de metila (riparina II), 3. Acoplamento do ter metlico da tiramina com os steres dos respectivos cidos: 2,6 dihidroxibenzico (riparina III), 2,5 dihidroxibenzico (riparina IV), 2,4 dihidroxibenzico (riparina V),

4. Metilao da Riparina 3 por diazometano (riparina VI) 5. Acoplamento do ster metlico da tiramina com os cidos: 2-hidroxi-5-metoxibenzico (riparina VII), 2-hidroxi-4-metoxibenzico (riparina VII), 3-hidroxi-4-metoxibenzico (riparina IX), 3-metoxibenzico (riparina X), 3,4-dimetoxibenzico (riparina XI), 3,5-dimetoxibenzico (riparina XII), 3,4,5-trimetoxibenzico (riparina XIII), 3,4-metilrnodioxibenzico (riparina XIV).

Atividades biolgicas A descoberta de atividade antimicrobiana de amidas isoladas da A. riparia,

induziu o estudo de suas caractersticas qumicas e atividade biolgica (BARBOSAFILHO; SILVA; BHATTACHARYYA, 1990). Estas alcamidas naturais, riparinas, atravs de estudos farmacolgicos in vitro, apresentaram atividade antimicrobiana, antimalrica, schistossomicida e moluscicida (CASTELO-BRANCO,1992). Aps a sntese, as alcamidas foram submetidas a uma triagem farmacolgica, cujo principal efeito observado foi uma diminuio da presso arterial e freqncia cardaca, em ratos acordados e no estressados. De todas as alcamidas avaliadas, apenas as riparinas II, III, IV e V na dose 1mg/kg, por via intravenosa (i.v.), apresentaram efeito significativo sobre a presso arterial (SEIXAS, 1996). As

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riparinas mostraram tambm, potente efeito relaxante quando utilizadas em preparaes com leo de cobaia, tero de rata e aorta de coelho (SEIXAS, 1996). Entre outros efeitos observados pelas riparinas I, II e III, pode-se citar atividade anti-inflamatria (ARAJO et al., 2006), relaxante muscular (MARQUES et al., 2005), citotxica para linfoblastos L929 (SILVEIRA et al., 2006), ansioltico (SOUSA et al., 2004; MELO et al., 2006) e anticonvulsivante (LEITE et al., 2006). Mecanismos de ao Embora se reconhea que as riparinas possuem propriedades

antimicrobianas, poucas so as informaes de como elas atuam, de modo que o seu mecanismo de ao ainda no foi elucidado. Porm importante enfatizar que a caracterstica hidrofbica, de sua molcula poder permitir relacionar-se com lipdeos da membrana celular bacteriana promovendo desarranjos estruturais e tornando-a mais permevel. Entre outras possibilidades de mecanismo de ao, pode-se supor: degradao da parede celular bacteriana, danos membrana citoplasmtica, danos s protenas de membrana, diminuio da fora de prtons na cadeia de transporte de eltrons da membrana. A maior resistncia das bactrias Gram negativas aos antimicrobianos , em parte, devido grande complexidade da composio da dupla camada lipdica da sua membrana celular, em contraste com as estruturas nicas encontradas nas membranas de glicoprotenas em bactrias Gram positivas e do -glucano, em fungos (TORTORA et al., 2000) Para explicar as divergncias entre a sensibilidade de clulas Gram positivas e Gram negativas, tm-se sugerido como fatores contribuintes, os graus de hidrofobicidade das superfcies celulares (HELANDER et al. 1998; CHAO et al., 2000). Entretanto as diferenas de hidrofobicidade das superfcies das membranas celulares bacterianas podem ser compensadas pela presena de protenas, porinas, em clulas Gram negativas. Estas porinas criam canais que permitem a passagem de componentes com pequena massa celular, permitindo seu acesso no espao periplasmtico. Segundo Thomas et al. (1994), o mecanismo de ao do efeito espasmoltico das riparinas provavelmente envolve inibio de liberao de clcio dos estoques intracelulares, entretanto, estes efeitos no so dependentes da gerao de AMP

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cclico. Enquanto que, segundo Seixas (1996), os mecanismos especficos de ligao das riparinas assim como as mudanas conformacionais induzidas por elas em nvel de receptores, ainda no so conhecidas e estudos posteriores sero necessrios para investigar a relao da sua estrutura - atividade sobre receptores. Toxicidade Castelo-Branco et al. (2000), estudando os efeitos de trs benzoilamidas, riparinas, constituintes de A. riparia (Nees) Mez (Laureaceae), verificaram que as riparinas I e II quando administradas por via oral (v.o.) ou via intraperitoneal (v.i.) em doses de at 1g/kg no causaram morte nos ratos. No entanto, a riparina III, quando administrada pela v.i., apresentou toxicidade (DL50=104,2 mg/kg) e relaxamento da traquia em ratos (CI50 = 1,9 mg/mL). Devido toxicidade ser um fator limitante no uso teraputico de substncias, Silveira et al. (2006), investigaram o potencial citotxico das riparinas I, II e III em fibroblastos L929 e observaram uma significativa diminuio da viabilidade celular nestes fibroblastos, sendo a riparina I, considerada a mais txica.

4 MATERIAIS E MTODOS

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4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 Local da pesquisa As atividades de pesquisa foram desenvolvidas nos Laboratrios de Tecnologia Farmacutica (LTF), Micologia do Centro de Cincias da Sade (CCS) e Gentica de Microrganismos do Centro de Cincias Exatas e da Natureza (CCEN) da Universidade Federal da Paraba (UFPB) e no Laboratrio de Microbiologia do Centro de Cincias Biolgicas e da Sade da Universidade Estadual da Paraba (CCBS/LAC/UEPB), onde funciona o Laboratrio de Pesquisas em Atividades Antimicrobianas do Programa de Qualificao Institucional PQI/UEPB/UFPB.

4.2 Material 4.2.1 Obteno dos produtos sintticos Os produtos, riparinas I, II e III, foram sintetizados no Laboratrio de Tecnologia Farmacutica (LTF) da Universidade Federal da Paraba (UFPB), a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae), de acordo com as tcnicas desenvolvidas e padronizadas por este Laboratrio (BARBOSA-FILHO et al., 1987; BARBOSAFILHO et al., 1990; CASTELO-BRANCO, 1992; SEIXAS, 1996; CASTELO-BRANCO et al., 2000). 4.2.2 Linhagens microbianas Foram utilizadas neste trabalho, amostras de Staphylococcus aureus, meticilina-sensveis (MSSA) e S. aureus meticilina-resistentes (MRSA), E. coli, P. aeruginosa e C. albicans, alm de cepas padro American Type Culture Collection (ATCC), apresentadas na Tabela 1.

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Tabela 1. Identificao e origem das cepas microbianas testadas Cepas / Identificao S. aureus ATCC 25923 (MSSA) S. aureus (122 U, 146 U, 223 U, 312 U, 319 U, 129 FN, 233 FN, 322 FN) S. aureus (8, 18, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50) S. aureus (171c MRSA) S. aureus (1A, 2A) P. aeruginosa ATCC 27853 E. coli ATCC 25922 E. coli (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) C. albicans ATCC 76643 C. albicans (1, 2, 3, 4, 5, 6) Origem Cefar Animal1 Humana* Humana1 Ambiental** Cefar Cefar Humana*** Cefar Humana2

Legenda: U = bere; FN = fossas nasais; * Isolados de secreo de orofaringe de pacientes ambulatoriais do Lab. DIAGNOSE; ** Isolados de ambiente hospitalar (Centro Cirrgico); ***Isolados de pacientes ambulatoriais com infeco urinria atendidos no Lab. DIAGNOSE; 1= Lab. de Gentica de Microrganismos da UFPB; 2 = Lab. de Micologia da UFPB.

4.2.3 Meios de cultura Para Bactrias Blood Agar Base (BAB), Agar Sangue (AS), Agar Manitol Salgado (AMS), Agar Mueller-Hinton (AMH), Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo MuellerHinton (CMH), todos de marca Difco. Para Fungos Agar Sabouraud Dextrose ASD (Difco). Caldo Sabouraud CS (Difco).

4.2.4 Substncias Tween 80 (Sigma Chemical) DMSO Dimetil-sulfxido (Merck) gua Destilada Soluo salina (NaCl 0,85%) Resazurina (Sigma-Aldricht) Antibiticos - Tetraciclina (Lote: 1112, Fornecedor DGE. Origem: China) - Penicilina G (Lab. de Gentica de Microrganismos da UFPB)

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- Estolato de eritromicina (Lote: 200.592, Fornecedor: AMT do Brasil. Origem: ndia) - Sulfato de estreptomicina (Lote: 826.545, Fornecedor: INLAB Brasil) - Discos de Antibiticos (Cefar) - E-Test Benzilpenicilina (Penicilina G) (AB BIODISK, Sweden - Article Number: 5100028; Lot Number: BF2933) - E-Test Eritromicina (AB BIODISK, Sweden - Article Number: 51001058; Lot Number: BE2833) 4.3 Mtodos As riparinas foram sintetizadas de acordo com os protocolos de CasteloBranco (1992) e Seixas (1996), descritos abaixo.

4.3.1 Obteno da O-metil-N-(benzoil)-tiramina (riparina I) Foram dissolvidos 2,0 mL de ter metlico de tiramina em 20 mL de ter etlico. A esta soluo, adicionou-se 1,0 mL de cloreto de metila (gota a gota, sob agitao magntica e a temperatura ambiente, durante 15 minutos) dissolvido em 20 mL de ter etlico. Aps a adio de todos os reagentes, a mistura reacional foi mantida sob agitao temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, concentrou-se o produto da reao em rotaevaporador. O resduo obtido foi lavado vrias vezes com soluo de HCl a 1% (v/v) e gua destilada e filtrado posteriormente. O filtrado foi solubilizado em clorofrmio e seco com sulfato de sdio anidro. O solvente foi evaporado sob presso reduzida e o resduo foi submetido recristalizao com benzeno-hexano, fornecendo cristais incolores com ponto de fuso em 120C. O rendimento do produto final foi de 64% (Figura 3).

Figura 3. Reao geral para sntese de riparina I - Acoplamento do ster metlico da tiramina com o cloreto de benzoila

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4.3.2 Obteno da O-metil-N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina (riparina II) Misturou-se 2,0 mL de ter metlico da tiramina com 1,0 mL de salicilato de metila. Esta soluo foi mantida sob refluxo em 15 mL de benzeno durante 24 horas. Aps resfriamento, o produto da reao foi lavado trs vezes com soluo de cido clordrico a 5% (v/v) e repetidas vezes com gua destilada, sendo posteriormente filtrado. Aps secagem da fase orgnica, com sulfato de sdio anidro e filtrao, o solvente foi destilado obtendo-se assim um leo cuja purificao foi realizada por cromatografia em coluna de slica gel, eluda com hexano e clorofrmio (1:1). Na primeira frao separou-se o composto desejado, o qual foi cristalizado em hexanoter, fornecendo cristais esbranquiados com ponto de fuso em 112C. O rendimento do produto final foi de 15% (Figura 4).

Figura 4. Reao geral para sntese de riparina II - Acoplamento de ster metlico da tiramina com o salicilato de metila 4.3.3 Obteno da O-metil-N-(2,6-dihidroxibenzoil)-tiramina (riparina III) Misturou-se 2,0 mL de ter metlico de tiramina com 2,0g de cido 2,6 dihidroxibenzico dissolvido em 20,0 mL de tetrahidrofurano na presena de 2,0g de N,N diciclohexilcarbodiimida. A mistura permaneceu sob agitao magntica por 24 horas em temperatura ambiente. Aps este perodo, o solvente foi evaporado sob presso reduzida e o resduo dissolvido em gua e extrado com acetato de etila. A fase acetato foi concentrada e o resduo purificado atravs de cromatografia em coluna de slica gel e cristalizado por vrias vezes com clorofrmio-hexano, fornecendo um material amorfo esbranquiado, com ponto de fuso em 130C. O rendimento do produto final foi de 30% (Figura 5).

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Figura 5. Reao geral para sntese de riparina III - Acoplamento de ster metlico da tiramina com os cidos 2,6 dihidroxibenzico O Quadro 2 apresenta de forma simplificada, algumas informaes importantes referentes s riparinas I, II e III, utilizadas neste estudo. Quadro 2. Caractersticas gerais das riparinas obtidas a partir da Aniba riparia (Ness) Mez (Lauraceae) Nomenclaturas Riparina I ou O-metil-N-benzoiltiramina ou N-8-4-metoxifeniletil benzoilamida Riparina II ou O-metil-N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina ou N-[8-4-metoxifeniletil]-2-hidroxibenzoilamida Riparina II ou O-metil-N-(2-hidroxibenzoil)-tiramina ou N-[8-4-metoxifeniletil]-2-hidroxibenzoilamida C16H17NO4 287 C16H17NO3 271 C16H17NO2 255 Frmula PM

4.3.4 Obteno das solues de riparinas As solues apresentando diferentes concentraes de riparinas foram obtidas, para cada uma delas da seguinte forma: Em um tubo de ensaio (15 x 75 mm) estril, colocou-se 12 mg de riparina; 0,04 mL de Tween 80; 50 l de DMSO e 3,0 mL de gua destilada estril. Essa mistura foi homogeneizada por aproximadamente 5 minutos. A partir de tal procedimento, obteve-se uma soluo com concentrao de 400 g/mL (soluo padro). Seguindo-se o processo de diluies seriadas, preparou-se uma srie de 6 tubos de ensaio onde cada continha

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2,5 mL de gua destilada estril. A partir da soluo padro, 400 g/mL, diluies seriadas foram realizadas, transferindo-se 2,5 mL dessa diluio para o primeiro tubo de ensaio da srie, homogeneizou-se por 5 vezes e transferiu-se 2,5 mL para o tubo seguinte e assim sucessivamente at o ltimo tubo da srie, obtendo-se solues com concentraes decrescentes de 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 g/mL de riparina. A adio de Tween 80 e de DMSO permitiu uma melhor solubilizao no preparo das solues de riparinas (HADACEK; GREGER, 2000). 4.3.5 Isolamento e identificao de bactrias Para os ensaios foram utilizados os seguintes meios de cultura (Difco): Agar Sangue (AS) para verificar a pureza e a capacidade hemoltica das cepas bacterianas, Agar Manitol Salgado (AMS) para verificao da capacidade de utilizao do manitol pelas cepas de S. aureus e Agar Meller-Hinton (AMH) para a realizao do Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos -TSA por ser o meio de cultura padro recomendado para esse procedimento de acordo com Bauer et al. (1966) e com o NCCLS (2004). As cepas de S. aureus de origem humana e ambiental, utilizadas nesse trabalho foram adquiridas, isoladas e identificadas fenotipicamente por mtodos microbiolgicos tradicionais, no Laboratrio de Microbiologia da Universidade Estadual da Paraba UEPB e no Setor de Bacteriologia da DIAGNOSE-Clnica de Anlises Especializadas LTDA, Campina Grande-PB. As cepas de origem animal foram doadas da coleo do Laboratrio de Gentica de Microrganismos da UFPB e as cepas ATCC foram fornecidas pela Cefar (Tabela 1). Para identificao fenotpica das cepas de S. aureus, foram realizados testes bioqumicos rotineiros para detectar a produo de alguns fatores de virulncia tais como, as enzimas catalase, coagulase e DNase alm de observar a utilizao do manitol (fermentao e oxidao) e a produo de hemlise em placas de Agar Sangue.

4.3.6 Suspenso bacteriana Durante a realizao do ensaio, as cepas foram mantidas em meio Agar Meller-Hinton (Difco) e repicadas para caldo Brain Heart Infusion - BHI (Difco) e

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incubadas a 37C/24 horas. Aps este perodo, procedeu-se o semeio pela tcnica de estrias (para obteno de colnias isoladas) em placas de Agar Sangue, que foram incubadas a 37C/24 horas. Para a obteno do inculo bacteriano, foram selecionadas 3 a 5 colnias semelhantes as quais foram transferidas para 5,0 mL de caldo BHI e incubadas a 37C/24 horas, para atingir a fase exponencial de crescimento. Aps este perodo, realizou-se o subcultivo, transferindo 50 L do inculo inicial para 50 mL de caldo Meller-Hinton, e incubando-o 37C/1h de modo a produzir uma leve turvao, de densidade visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, obtendo-se assim um inculo de concentrao final de 10-6 UFC/mL. Essa suspenso, inculo bacteriano, foi semeada aproximadamente 15 a 20 minutos aps sua preparao (BAUER et al., 1966; DRUTZ, 1987; CLEELAND; SQUIRES, 1991; SANTOS FILHO, 2003; NCCLS, 2004).

4.3.7 Isolamento e identificao de leveduras Foram selecionadas cepas de C. albicans, isoladas de amostras clnicas de pacientes portadores de infeces superficiais e/ou profundas. Os cultivos foram realizados em Agar Sabouraud Dextrose (ASD), incubados a 35C e observados por um perodo de 2 a 3 dias, a fim de evidenciar o crescimento fngico. As caractersticas macromorfolgicas, microscpicas e bioqumicas dos cultivos foram estudadas segundo a chave de identificao proposta por GUHO et al.,1994.

4.3.8 Suspenso de leveduras A partir das culturas mantidas em ASD, a 35C/24-72 horas, foi realizado o preparo e padronizao do inculo, em soluo salina de cloreto de sdio a 0,85%, estril obtendo-se assim uma suspenso com turvao comparativa com a do tubo 0,5 da escala de McFarland. A mesma foi ajustada no espectrofotmetro (LeitzPhotometer 340-800), para 90%T (530nm), correspondendo aproximadamente uma concentrao final de 106 UFC/mL (CASALS, 1979; FROMTLING, 1983; ODDS, 1989; CLEELAND; SQUIRES, 1991).

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4.3.9 Determinao da atividade antimicrobiana Triagem Mtodo de difuso em meio slido para bactrias Para a determinao da atividade das riparinas sobre microrganismos, foi realizada, inicialmente, uma triagem da atividade antimicrobiana, pelo mtodo de difuso em meio slido, processo cavidade-placa (BAUER et al., 1966; COURVALIN, et al., 1985; CLEELAND; SQUIRES, 1991; HADACEK; GREGER, 2000; NCCLS, 2004; CLSI, 2005). Para realizao do teste de difuso, foram utilizadas placas de Petri (90 x 15 mm) descartveis, estreis, contendo 20 mL do meio de cultura Agar Meller-Hinton, que foram inoculadas pela tcnica de espalhamento em superfcie (NCCLS, 2004; CLSI, 2005), com auxlio de swabs estreis mergulhados na suspenso contendo o inculo, eliminando-se o excesso de lquido por presso nas paredes do tubo. O inculo foi semeado sobre toda a superfcie do agar de modo a se obter um crescimento uniforme e semi-confluente. As placas foram colocadas para secar, durante 3 a 5 minutos. Em seguida, foram realizadas as perfuraes das cavidades com 6 mm de dimetro, com o auxlio de perfuradores descartveis estreis. Em cada cavidade, foi adicionado 50 L da soluo do produto testado, para verificar a presena ou no de atividade antimicrobiana. Os produtos foram previamente solubilizados com dimetil-sulfxido (DMSO a 2%) e utilizados inicialmente na concentrao de 400 g/mL. Foi utilizado, como controle, em uma das cavidades, 50 L da soluo de DMSO a 2% usada como solvente. As placas foram incubadas a 35C por 24 horas. Aps este perodo de incubao os resultados foram notificados e foram considerados positivos aqueles produtos que inibiram o crescimento microbiano, produzindo halos de inibio igual ou superior a 8 mm de dimetro (WONG-LEUG, 1988; SAKAR et al., 1988; NAQVI et al., 1991). Os ensaios foram realizados em triplicata e o resultado final foi determinado pela mdia aritmtica dos halos de inibio.

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Determinaes da CIM e da CBM Tcnica de microdiluio em placas A CIM das riparinas frente s cepas ensaiadas foi determinada pela tcnica

de microdiluio em placa (NCCLS, 2004). Foram utilizadas microplacas estreis de 96 cavidades de fundo chato e tampa da marca CRALPLAST Ltda. (Figura 6), nas quais foram distribudos assepticamente, 100 L de Caldo Meller-Hinton. Na cavidade da linha A da placa, adicionou-se 100 L da soluo aquosa de riparina em estudo, pr-solubilizada com DMSO a 2%, na concentrao de 400 g/mL. Em seguida foram realizadas diluies seriadas, transferindo-se 100 L da linha A at a linha G da placa. Aps as diluies, adicionou-se 10 L do inculo bacteriano, nas linhas horizontais (numeradas de 1 a 12), em todas as cavidades at a linha G. Cada uma das linhas numeradas correspondeu a uma cepa bacteriana. A linha H foi utilizada como controle positivo do crescimento bacteriano (viabilidade de cada cepa ensaiada). As placas foram tampadas, seladas e incubadas por 37C/24h.

Controle de crescimento

Figura 6. Placa de microdiluio Aps esse perodo de incubao, adicionou-se 20 L da soluo aquosa de resazurina (Sigma-Aldricht) a 0,01% em cada cavidade, como indicador colorimtrico de xido-reduo para caracterizar a viabilidade celular. As placas foram mantidas a temperatura ambiente por 2 h e lidas aps esse tempo.

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A leitura realizada de forma visual foi caracterizada pela mudana de cor nas cavidades. Onde houve mudana da cor azul da soluo de resazurina, para rosa, caracterizou a reduo deste corante indicando viabilidade bacteriana, ou seja, nessa cavidade a concentrao do produto no foi capaz de matar as bactrias. Nas cavidades em que no houve mudana de cor, ou seja, permaneceu azul, significou que a resazurina no foi reduzida indicando, portanto, inviabilidade das clulas bacterianas. A resazurina atua como substrato cromognico de enzimas da cadeia de transporte de oxignio, desidrogenases, agindo como indicadora de oxi-reduo, sendo reduzidas (ganho de eltrons) por flavinas ligadas a enzimas da cadeia de transporte de oxignio durante o metabolismo celular (KOMEMAN, 2001). Considerou-se como CIM a menor concentrao de riparina capaz de inibir o crescimento da cepa bacteriana ensaiada e como CBM, a primeira concentrao anterior a CIM (MANN; MARKHAN, 1998; SALVAT et al., 2001; BURT; REINDERS, 2003; ALVES, 2006). Mtodo de difuso em agar para leveduras e determinao da CFM Este mtodo foi empregado para avaliar a atividade antifngica das riparinas I, II e III, sobre cepas de C. albicans e simultaneamente determinar a possvel CFM destas substncias (McGINNIS, 1980; SHADOMY et al., 1985; PLEMPEL et al., 1986; CLEELAND; SQUIRES, 1991; CANTN; PEMN, 1999; HADACEK; GREGER, 2000). Em placas estreis, descartveis, depositou-se 1mL da suspenso fngica, padronizada pelo tubo 0,5 da escala de McFarland correspondendo aproximadamente a 106 UFC/mL Em seguida, adicionou-se 20 mL de ASD fundido a 50C. Aps solidificao do agar, foram feitas cavidades de 6 mm de dimetro com o auxlio de perfuradores descartveis estreis, onde se depositou 50 l de cada soluo de riparina solubilizada em DMSO a 2%, nas concentraes de 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 g/mL. Controles foram realizados com cetoconazol (50 g/mL). A incubao foi a 35C/24-48 horas. Os ensaios foram realizados em triplicata e o resultado final foi determinado pela mdia aritmtica do tamanho dos halos de inibio de crescimento (mm) dos valores obtidos nos ensaios. Foi considerada como CFM quela concentrao de riparina que quando em interao com a cepa microbiana ensaiada, foi capaz de desenvolver um halo de inibio do

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crescimento igual ou superior a 10 mm (NAQVI et al., 1991; COLE, 1994; LIMA et al., 1993; ALVES et al., 2000; SOUZA et al, 2005).

4.3.10 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica bacteriana A cintica bacteriana um mtodo experimental que pode determinar a viabilidade dos microrganismos testados aps exposio destes s substncias de interesse por um tempo determinado (MAY et al., 2000). A determinao da curva de crescimento e/ou mortalidade em funo do tempo de exposio a um determinado produto uma das inmeras ferramentas de trabalho utilizadas para determinar os efeitos de antimicrobianos sobre as bactrias (CANTN; PEMN, 1999). Trs amostras representativas foram selecionadas para a realizao da cintica bacteriana, frente s riparinas: S. aureus ATCC 25923 - recomendada pelo NCCLS quando se avalia sensibilidade aos antimicrobianos e as linhagens bovinas de S. aureus 319U e S. aureus 122U, por possurem plasmdeo penicilinase. Foram determinadas as curvas bactericidas dos substratos sintticos, riparina I, II e III, obtidos a partir da A. riparia (Nees) Mez, sobre as amostras selecionadas de S. aureus, estabelecendo-se a concentrao relacionada CIM (200 g/mL), em diferentes tempos de incubao, segundo o mtodo proposto por Peyret et al., (1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI), incubadas a 37C/1824h. Aps este perodo, foram cultivadas, transferindo-se 50 L do inculo inicial para 50 mL de caldo Mueller-Hinton, e incubando-o 37C/1h de modo a produzir uma leve turvao, de densidade visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, correspondendo aproximadamente a 106 UFC/mL. Transferiu-se 9,0 mL, desta cultura bacteriana, para um tubo teste (T), e 9,0 mL para um tubo controle (C). Ao tubo T, adicionou-se 1,0 mL do produto a ser testado e ao tubo C, adicionou-se 1,0 mL de gua destilada estril. Os tubos (T e C) foram mantidos na estufa 37C e alquotas foram retiradas aps 2, 4, 6, 8, 10, 24 e 48 horas de incubao e semeadas em agar BAB. As leituras das placas foram efetuadas aps incubao por 24 e 48 horas a 37C, pelo mtodo padro de contagem em placas (Figura 7). Os ensaios foram realizados em triplicata e o resultado final (UFC/mL) foi determinado pela mdia aritmtica dos valores encontrados.

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Amostra microbiana
(cepa bacteriana) Repique

Caldo BHI
(5,0 mL) Incubao (18 - 24h/37C)

Sub-cultivo
(50 mL de caldo Meller- Hinton + 50 L da suspenso bacteriana aps 18-24h de incubao)

Incubao (1h/37C)

Transferir 9,0 mL do sub-cultivo para 2 tubos

(C = Controle e T = Teste)

Tubo C

Controle de crescimento

Tubo T

Adicionar 1,0 mL de H2O destilada estril

Adicionar 1,0 mL do produto a ser testado (CIM)

Fazer diluies seriadas em NaCl 0,85%

(10-1 ...... 10-6)

Fazer diluies seriadas em NaCl 0,85%

(10-1 ...... 10-6)

Semear 100 L de cada diluio em placas BAB

(T0 = Tempo 0 e a cada 2h) Incubao (24h/37C)

Semear 100 L de cada diluio em placas BAB

(T0 = Tempo 0) e a cada 2h

Leitura e contagem do n de UFC/mL

Leitura e contagem do n de UFC/mL

Figura 7. Fluxograma da cintica bacteriana

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4.3.11 Estudo do efeito das riparinas sobre a cintica fngica As curvas fungicidas foram determinadas atravs do mtodo de contagem de clulas viveis, para realizar o estudo da interferncia dos substratos sintticos, riparinas I, II e III, obtidos a partir da A. riparia sobre a amostra selecionada de C. albicans ATCC 76643. Estabeleceu-se a concentrao de 200 g/mL, como sendo a CIM desses produtos. O procedimento tcnico realizado seguiu os mesmos parmetros daqueles anteriormente citados na cintica bacteriana, em diferentes tempos de incubao (PEYRET et al., 1990; CANTN; PEMN,1999; HADACEK; GREGER, 2000) (Figura 8).

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Amostra microbiana
(C. albicans ATCC 76643) Repique

Semeio em ASD
Incubao 24 48h/35C

Preparo do inculo
(Suspenso fngica = colnias + Caldo Sabouraud) Turbidez = Escala 0,5 de McFarland Incubao (1h/35C)

Transferir 9,0 mL da suspenso para 2 tubos

(C = Controle e T = Teste)

Tubo C

Controle de crescimento

Tubo T

Adicionar 1,0 mL de H2O destilada estril

Clculo do T0

Adicionar 1,0 mL do produto a ser testado [MIC]

Fazer diluies seriadas em NaCl 0,85%

(10 ...... 10 )
-1 -6

Fazer diluies seriadas em NaCl 0,85%

(10-1 ...... 10-6)

Semear 100 L de cada diluio em placas ASD

(T0 = Tempo 0 e a cada 2h)

Semear 100 L de cada diluio em placas ASD

(T0 = Tempo 0 e a cada 2h)

Incubao (24 48h/35C)

Leitura e contagem do n de UFC/mL

Leitura e contagem do n de UFC/mL

Figura 8. Fluxograma da cintica fngica

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4.3.12 Determinao da caracterizao fenotpica dos padres de resistncia aos antimicrobianos Perfil de sensibilidade A determinao do perfil de sensibilidade ou teste de sensibilidade aos antimicrobianos (antibiograma) foi realizada pelos mtodos de disco-difuso (BAUER et al., 1966) usando-se discos de antibiticos da Cefar, seguindo-se as recomendaes do fabricante e a padronizao do NCCLS (2004) e CLSI (2005), para todas as cepas de S. aureus ensaiadas e pelo E-test, mtodo de gradiente predefinido de determinao da concentrao inibitria mnima (CIM), seguindo-se as recomendaes do fabricante (BROWN; BROWN, 1991). Apenas duas cepas, S. aureus 319U e 122U, foram selecionadas para esta etapa, por terem seu perfil plasmidial, de resistncia aos antimicrobianos, penicilina e eritromicina, previamente determinados por Pereira; Siqueira (1995) atravs CIM pelo mtodo da diluio em placas.

4.3.13 Tratamento por riparinas I, II e III, obtidas a partir da A. riparia Avaliao da atividade curagnica A avaliao da atividade curagnica das riparinas I, II e III, sobre S. aureus resistentes a drogas, foi determinada, utilizando-se o valor mdio da concentrao subinibitria (1/2 CIM = 100 L/mL). Todas as amostras bacterianas foram inoculadas em 10 mL de caldo BHI a 37C por 18-24horas e diludas 100 vezes no mesmo meio, adicionado da concentrao subinibitria de cada produto ensaiado. Aps incubao a 37C/24horas, sob agitao, as culturas foram convenientemente diludas em soluo salina esterilizada (NaCl 0,85%) e alquotas de 0,1 mL foram semeadas em BAB (Difco) para determinao do ttulo (nmero de colnias/mL). A perda da resistncia a drogas foi determinada por rplica para meios de cultura, acrescidos de cada droga estudada (LEDEBERG; LEDEBERG, 1952; PEREIRA, 2000). As confirmaes da ocorrncia de eliminao de plasmdeos nas variantes possivelmente curadas foram realizadas em placas com meio slido (BAB) contendo os antibiticos pr-selecionados, penicilina e eritromicina (Figura 9). Experimentos controle para a determinao de eliminao espontnea de plasmdeos, foram realizados anteriormente, utilizando-se os mtodos de diluio em placas e eletroforese em gel de agarose aps lise com lisostafina (GOERING; RUFF, 1983; PEREIRA; SIQUEIRA, 1995).

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Amostra microbiana
(Cepa bacteriana)

Repique
Caldo BHI
(5,0 mL)

18 24h/37C
Suspenso bacteriana

Preparo do Inculo
Inculo bacteriano
(10,0 mL de caldo MH + 1,0 mL do produto [1/2CIM] a ser testado +0,1 ml da suspenso bacteriana)

Incubao 24h/37C em BM com agitao

Diluio do Inculo em NaCl 0,85%
(10 ...... 10 )
-1 -6

Plaqueamento em BAB das diluies, usando 50 l e 100 l do cultivo bacteriano

Incubao (24h/37C)
Escolher a melhor diluio pra leitura e contar n de colnias/mL (UFC/mL). Determinar a placa

Rplica
( partir da placa matriz em BAB + antibitico)

Incubao (24h/37C)
Leitura da placa rplica (comparar com a placa matriz e observar se houve cura) Determinar o % de colnias curadas

Selecionar as variantes (possivelmente curadas). Confirmar a cura

(semeando em BAB com antibitico)

Estocar as variantes curadas para realizao de novos testes (CIM e/ou Eletroforese)

Determinar a CIM das colnias curadas

(E-test)

Figura 9. Fluxograma para avaliao da atividade curagnica

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4.3.14 Estudo da relao estrutura/atividade antimicrobiana das riparinas O estudo da relao estrutura/atividade antimicrobiana das riparinas I, II e III foi determinado em funo da observao e comparao dos efeitos dessas substncias frente s cepas escolhidas para esse estudo; atravs da avaliao do perfil de sensibilidade, visualizado atravs da presena de halos de inibio de crescimento, com dimetros iguais ou superiores a 8 mm, da cintica microbiana e da atividade curagnica.

4.3.15 Anlise estatstica Foram realizadas anlises de estatstica descritiva bsica determinando-se valores mdios, mnimos, mximos e desvio padro das cinticas bacterianas. Esses parmetros foram avaliados separadamente para cada uma das riparinas testadas usando-se utilitrios de computador, Microsoft Office Excel 2003, e considerado como aceitvel o a relao percentual entre o desvio padro e a mdia aritmtica dos ensaios, inferior a 10%.

5 RESULTADOS E DISCUSSO

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5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Resistncia antimicrobiana A resistncia antimicrobiana um dos principais problemas de sade pblica mundial, despertando preocupao na busca contnua por novos antimicrobianos, uma vez que, a potncia efetiva dos antimicrobianos existentes, vem sendo gradativamente reduzida ou mesmo anulada pelo desenvolvimento de cepas que se apresentam resistentes aos mesmos. Essas cepas so freqentemente indicadas como os principais agentes etiolgicos de infeces humanas e animais, alm de serem tambm comumente encontradas em infeces hospitalares (XU; LEE, 2001). A versatilidade gentica das bactrias so fatores que contribuem para eficincia do fenmeno de resistncia que tem se disseminado entre diferentes gneros e espcies bacterianas (PONTES et al., 2004). sobre essa variabilidade gentica que o homem vem, paradoxalmente, exercendo alta presso seletiva (hospital, comunidade, agropecuria, meio ambiente) favorecendo os gentipos resistentes (CHARTONE-SOUZA, 2004). Os estudos de produtos naturais e sintticos bioativos tm-se mostrado como uma alternativa teraputica frente a crescente resistncia aos antimicrobianos sintticos e semi-sintticos e vrias pesquisas esto sendo realizadas no intuito de avaliar as propriedades de atividade antimicrobianas de sustncias de origem vegetal. Dentro dessa perspectiva, o interesse em plantas com propriedades medicamentosas tem evoludo bastante em todo o mundo. Vrios trabalhos descritos na literatura buscam avaliar produtos de plantas que possuam atividade antimicrobiana (LIMA et al., 1993; THUILLE et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2003; PETRONE et al., 2004; GONTIJO et al., 2004; BRAGA et al., 2005; SOUZA et al., 2005; ALVES, 2006). A Tabela 2 apresenta o comportamento das amostras de S. aureus com o intuito de conhecer o perfil de sensibilidade frente a 15 antimicrobianos usados rotineiramente na clnica mdica humana e veterinria. Observou-se nesse estudo que a maioria (15/22) das cepas apresentou resistncia a penicilina G e a ampicilina e que as cepas 129FN, 233FN, 322FN (origem animal) e as cepas 8 e 18 (origem humana) foram sensveis a todos os antimicrobianos testados. Apenas duas cepas

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171c (humana) e 2A (ambiental) apresentaram resistncia a oxacilina, sendo classificadas como MRSA. Todas as cepas foram sensveis a vancomicina, cloranfenicol, ciprofloxacina e amplicilina/sulbactan. Esse estudo prvio de avaliao do perfil de sensibilidade permitiu classificar as cepas pelo seu antibiotipo, mostrando que a diversidade fenotpica observada em relao aos antimicrobianos, independe da sua origem. Das 22 cepas ensaiadas, 7 foram sensveis a todos os antimicrobianos testados, as demais apresentaram multirresistncia que variou de 2 a 7 antimicrobianos, sendo 6 cepas resistentes apenas penicilina G e ampicilina. As cepas mais resistentes foram 171c, 46c e 2A, respectivamente, resistentes a 7, 6 e 5 tipos de antimicrobianos. As cepas resistentes penicilina foram consideradas como produtoras de plasmdeo penicilinase. Tabela 2. Comportamento das cepas de S. aureus frente aos antimicrobianos
ANTIMICROBIANOS TESTADOS (concentrao do disco) Estreptomicina (10 g) S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S Sulfametozaxol + Trimetoprima (25 g)* Ciprofloxacino (5 g) Cloranfenicol (30 g) Vancomicina (30 g) Gentamicina (10 g) Eritromicina (15 g) Azitromicina (15 g) Clindamicina (2 g) Penicilina G (10 g) Tetraciclina (30 g) Ampicilina + Sulbactan (20 g)** Ampicilina (10 g) Amicacina (30 g) Oxacilina (1 g) RM n Antibiticos 3 2 2 2 2 0 0 0 7 0 0 2 4 4 6 3 2 4 4 0 0 5

122 U 146 U 223 U 312 U 319 U 129 FN 233 FN 322 FN 171c 8c 18c 43c 44c 45c 46c 47c 48c 49c 50c ATCC 1 2A
Legenda:

Cepas

R R R R R S S S R S S R R R R R R R R S S R

R I S S I S S S R S S S I I I I S R R S S R

S S S S S S S S R S S S R R R R S S S S S R

R R R R R S S S R S S R R R R R R R R S S R

S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

S S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S R

S S S S S S S S I S S S S S R S S S S S S S

S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S

S S S S S S S S R S S S R S S S S R R S S S

S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S

S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S

I S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S

S = sensvel, I = intermedirio, R = resistente, U = bere, FN = fossas nasais, c = clnica, A = ambiental, ATCC = American Type Culture Collection; RM = Resistncia Mltipla; * Sulfametoxazol 23,75 g + Trimetoprima 1,25 g; ** Ampicilina 10 g + Sulbactan 10 g.

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5.2 Atividade antimicrobiana in vitro de riparinas 5.2.1 Frente s cepas padres ATCC Na Tabela 3 esto apresentados os resultados da avaliao da atividade antimicrobiana, pelo mtodo de diluio em agar, das solues aquosas de riparinas I, II e III, na concentrao inicial de 200 g/mL, sobre cepas E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923 e C. albicans ATCC 76643. As riparinas I e II no apresentaram halos de inibio de crescimento para nenhuma das cepas ATCC ensaiadas. Apenas a riparina III, apresentou atividade antimicrobiana, frente cepa de S. aureus ATCC 25923, apresentando halo de inibio de crescimento de 18 mm de dimetro. O mtodo de difuso em gar amplamente utilizado, reconhecido como preciso e seguro, ainda que produza resultados semi-quantitativos (JANSSEN et al., 1987) ou apenas qualitativos (KALODERA et al.,1997). A soluo de DMSO a 2% foi tambm testada, isoladamente, para observar se esta substncia apresentava alguma atividade antimicrobiana que pudesse interferir nos resultados das riparinas analisadas. Entretanto, no foi observada nenhuma ao do DMSO frente s cepas ensaiadas, de modo que essa soluo foi usada como controle negativo, ou seja, controle de um produto sem atividade antimicrobiana (Tabela 3). Tabela 3. Determinao da atividade antimicrobiana in vitro de riparinas frente s cepas padres ATCC
Produtos Testados (Concentrao)
Riparina I (200 g/mL) Riparina II (200 g/mL) Riparina III (200 g/mL) DMSO a 2%
Legenda: 0 = Ausncia de halo.

S. aureus ATCC 25923

0 0 18 0

Microrganismos ensaiados E. coli P. aeruginosa ATCC 25922 ATCC 27853 Dimetro dos halos de inibio (mm)
0 0 0 0 0 0 0 0

C. albicans ATCC 76643

0 0 0 0

5.2.2 Frente s Cepas de S. aureus A Tabela 4 apresenta o comportamento de 22 cepas de S. aureus de diferentes origens (animal, humana e ambiental), caracterizadas fenotipicamente

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como sensveis (MSSA) e resistentes a meticilina (MSRA) frente s riparinas I, II e III. A avaliao da atividade antimicrobiana, desses produtos foi determinada em funo dos dimetros dos halos de inibio de crescimento que variaram de 8 a 18 mm, sendo o maior deles apresentado pela cepa S. aureus ATCC 25923, frente riparina III. Esses halos esto de acordo com os dimetros pr-estabelcidos por Wong-Leung (1988); Sakar et al. (1988), que consideraram com atividade antimicrobiana todos os produtos que apresentaram halo 8 mm. A determinao da atividade antimicrobiana pela mensurao dos dimetros dos halos de inibio, deve ser estudada caso a caso, principalmente quando se trata de estudos preliminares em novos produtos naturais ou sintticos. Tabela 4. Perfil de suscetibilidade in vitro das cepas de S. aureus frente s riparinas
Origem das cepas Padro n=1 Cepas testadas (n=22) S.aureus ATCC 25923 122 U (MSSA) 146 U (MSSA 223 U (MSSA) 312 U (MSSA) 319 U (MSSA) 129 FN (MSSA) 233 FN (MSSA) 322 FN (MSSA) 171c (MRSA) 8c (MSSA) 18c (MSSA) 43c (MSSA) 44c (MSSA) 45 (MSSA) 46c (MSSA) 47c (MSSA) 48c (MSSA) 49c (MSSA) 50c (MSSA) 1A (MSSA) 2A (MRSA) I Riparinas (200 g/mL) II III Dimetro dos halos de inibio (mm) 0 0 12 0 0 0 9 9 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 22/6 (27,3%) 18 10 14 9 9 14 13 11 13 0 8 8 8 8 11 12 9 9 8 13 14 0 22/20 (90,9%)

0 0 10 0 0 0 9 9 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 22/5 (22,7%)

Animal n=8

Humana n = 11

Ambiental n=2

Total de cepas/Sensveis (% de sensibilidade)

Legenda: U = bere; FN = fossas nasais; c = clnica humana; A = ambiental; MSSA = sensvel meticilina; MRSA = resistente meticilina; 0 = Ausncia de halo.

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interessante observar, considerando o padro de resistncia dessas linhagens, que as cepas MRSA, apresentaram resistncia a todas as riparinas, enquanto que as cepas MSSA mostraram-se mais susceptveis. Esse comportamento pode ser explicado, em parte, pela presena do gene mecA, nas cepas MRSA, responsvel por diferentes mecanismos de resistncia capazes de interagirem entre si ( SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005). Analisando o resultado do comportamento das 22 cepas de S.aureus ensaiadas nesse experimento, observou-se que as riparinas I e II apresentaram atividades semelhantes, inibindo 5 (22,7%) e 6 (27,3%) das cepas. A riparina III foi o produto que inibiu o maior nmero de cepas 20 (90,9%). Estes resultados esto em concordncia com relatos anteriores de Cato et al (2005), que registraram 11(91,7%) cepas de S. aureus sensveis a essa riparina. Em funo da origem das cepas, se observou que as linhagens de origem animal mostraram-se mais susceptveis que as de origem humana e ambiental. Das 8 cepas de S. aureus de origem animal, 4 (50%) apresentaram sensibilidade para as riparinas I, e II, com halos de inibio de crescimento, variando de 9 a 13 mm. O total de 8 (100%) das cepas apresentou sensibilidade para a riparina III com halos que variaram de 9 a 14 mm. Nenhuma das cepas de S. aureus de origem humana, 11 (100%), apresentou sensibilidade para as riparinas I e II, enquanto que 10 (90,9%) foram sensveis para riparina III. As 2 cepas ambientais, 1A (MSSA) e 2A (MRSA), apresentaram comportamentos opostos frentes as riparinas; a linhagem 1A, sensvel todas as riparinas, apresentou halos de inibio de crescimento de 12, 9 e 14 mm, respectivamente para as riparinas I, II e III, enquanto que para a linhagem 2A esses produtos foram ineficazes. Todas as cepas MSSA, independente da sua origem (animal, humana ou ambiental), apresentaram sensibilidade para a riparina III, no entanto as cepas MRSA (171c e 2A) mostraram-se resistentes a todas as riparinas testadas. provvel que essa diferena de comportamento esteja relacionada a peculiaridades intrnsecas de cada cepa tais como esse fato esteja relacionado heterogeneidade dos mecanismos de resistncia plasmidial e cromossomial desenvolvidos pelas linhagens MRSA (KURODA et al., 2001; YAMADA et al., 2006; COELHO et al., 2007), como tambm pelos mecanismos de ao, ainda no elucidados, pelos quais as riparinas atuam nessas linhagens.

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5.2.3 Frente s cepas de E. coli A Tabela 5 mostra o resultado do comportamento das cepas de E. coli testadas frente s riparinas. Foi constatada a ausncia de halos de inibio de crescimento para todas as cepas ensaiadas, sugerindo ineficcia destes produtos sobre o crescimento da referida bactria. Tabela 5. Comportamento das cepas de E. coli frente s riparinas
Cepas ensaiadas E.coli ATCC 25922 1c 2c 3c 4c 5c 6c 7c 8c 9c Total de cepas ( % de Sensibilidade) I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Riparinas (200 g/mL) II III Dimetro dos halos de inibio (mm) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 (0%) 10 (0%)

10 (0%)

Legenda: c = amostra clnica de origem humana; 0 = Ausncia de halo.

Estes resultados, em parte, esto de acordo com os citados anteriormente por Cato et al., (2005), que relataram a presena de pequenos halos de inibio de crescimento (7 mm) para 3 (21,4%) cepas de E. coli. Segundo Wong-Leung (1988), substncias que produzam halos de inibio de crescimento entre 6,5 e 7,75 mm podem ser consideradas com baixa atividade antimicrobiana. De modo que a diferena encontrada entre a ausncia e presena pequenos halos, pode est relacionada no s a pouca atividade das riparinas nessas linhagens, como tambm a particularidades relacionadas aos diferentes mecanismos de resistncia, das linhagens em estudo, fator determinante do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos.

5.3 Determinao da CIM e da CBM A determinao da CIM foi realizada simultaneamente pelos mtodos de cavidade-placa (difuso em meio slido) e microdiluio em placa de polietileno de 96 cavidades. O uso de dois ou mais mtodos para o estudo da atividade

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antimicrobiana, permite obter resultados mais seguros. Foram escolhidas para esse ensaio, as cepas padro (E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 e S. aureus ATCC 25923) e dentre as 22 cepas de S. aureus avaliadas frente s riparinas I, II e III, foram includas quelas com perfil plasmidial conhecido (122U e 319U) e as que apresentaram suscetibilidade simultnea a todas as riparinas (146U, 122FN, 233FN, 322FN e 1A). A Tabela 6 contm os resultados encontrados para essas cepas quando testadas frente a diferentes concentraes (400 g/mL, 200 g/mL, 100 g/mL e 50 g/mL) para cada uma das riparinas ensaiadas, para determinao da CIM pelo mtodo cavidade-placa, ou seja, difuso em meio slido. Os halos de inibio de crescimento variaram de 19 a 8 mm, decaindo em funo da concentrao. Na maioria das cepas observou-se a presena de halos nas duas primeiras concentraes. Apenas as cepas ATCC 25923, 233FN e 1A apresentaram halos na concentrao de 100 g/mL para a riparina III, de modo que foi determinado 200 g/mL como sendo a CIM e 400 g/mL como sendo a CBM, para esses produtos. Tabela 6. Determinao da CIM e da CBM das riparinas frente s cepas de E. coli, P. aeruginosa e S. aureus por difuso em meio slido
Riparinas [g/mL]

Microrganismos testados Dimetro dos halos de inibio (mm)

E. coli P. aeruginosa ATCC 25922 ATCC 27853 0 0 0 0 0 0 0 0 Staphyloccus aureus ATCC 25923 9 0 0 0 122U 0 0 0 0 319U 0 0 0 0 146FN 12 10 0 0 129FN 10 9 0 0 233FN 10 9 0 0 322FN 14 13 0 0 1A 13 12 0 0

400 200

I
100 50

400 200

0 0 0 0

0 0 0 0

9 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

13 12 0 0

10 9 0 0

10 9 0 0

14 13 0 0

10 9 0 0

II

100 50

400

0 0 0 0

0 0 0 0

19 18 10 0

11 10 0 0

15 14 0 0

15 14 0 0

14 13 0 0

12 11 8 0

14 13 0 0

15 14 8 0

III

200 100 50

Legenda: 0 = Ausncia de halo

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Em ambas as metodologias, determinou-se como CIM 200 g/mL, visto que foi a concentrao que, seguramente, conseguiu apresentar halo de inibio em um maior nmero de cepas, no mtodo cavidade-placa, bem como de inibir o crescimento da maioria das cepas ensaiadas pelo mtodo de microdiluio em placa. Nas linhagens de S. aureus ensaiadas, no se observou grandes diferenas entre os tamanhos dos halos de inibio de crescimento, em relao CIM e a CBM, visto que na CIM para as riparinas I e II os halos variaram entre 13 a 9 mm de dimetro enquanto que na CBM, os halos variaram entre14 a 9 mm de dimetro. A riparina III foi a que demonstrou melhor atividade antimicrobiana para as cepas de S. aureus, em especial a ATCC 25923, apresentando halos de inibio de crescimento, que variam de 19 a 10 mm, em funo das diferentes concentraes utilizadas, 400 g/mL, 200 g/mL, 100 g/mL e 50 g/mL. As riparinas I e II s apresentaram halo de 9 mm na mais alta concentrao (Figura 10).

Figura 10. Perfil de suscetibilidade por difuso em meio slido, da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas I, II e III nas concentraes de 400(1), 200(2), 100(3) e 50(4) g/mL

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Esses resultados esto em concordncia com May et al. (2000), que ralataram a atividade antimicrobiana in vitro, avaliada pela mensurao da CIM, pode ser realizada pela tcnica de medio de halos ou pela determinao dos nveis de resistncia. Entretanto estes procedimentos no determinam o tempo de ao do agente sobre os microrganismos, o que permite que outros parmetros farmacodinmicos possam ser usados para determinar a eficcia dessas substncias. A Figura 11 apresenta o comportamento de 12 cepas de S. aureus utilizadas nas determinaes da CIM e da CBM para a riparina III, pelo mtodo da microdiluio em placas, complementado com o auxlio da resazurina. Destas cepas, 8 (75%) apresentaram CIM = 200 g/mL, apenas as cepas ATCC 25923, 233FN e 1A, foram mais sensveis, apresentando CIM = 100 g/mL. Esse comportamento tambm foi observado na determinao da CIM o pelo mtodo de difuso em meio slido apresentado na Tabela 6.

Figura 11. Determinao da CIM e CBM da riparina III frente a linhagens de S. aureus ATCC 25923 (1), 122U (2), 146U (3), 223U (4), 312U (5), 319U (6), 129FN (7), 233FN (8), 322FN (9), 1A (10), 46c (11), 50c (12) nas concentraes de 400(A), 200 (B), 100 (C), 50 (D), 25 (E) e 12,5 (F) g/mL
Legenda: G = Controle Positivo (crescimento bacteriano); H = Controle Negativo (riparina III)

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De acordo com os resultados obtidos, considerou-se que houve similaridade entre os dois mtodos utilizados para determinao da CIM, quanto sua sensibilidade. No entanto, de acordo com diversos pesquisadores (HADACEK; GREGER, 2000; TELLES; MOSCA, 2000; KALEMBA; KUNICKA, 2003; HOOD et al., 2003), o mtodo de microdiluio em placas apontado por como mais preciso inclusive, podendo tambm, ser utilizado para determinao da atividade antimicrobiana de leos essenciais e fitoconstituintes (ALVES, 2006); uma metodologia bastante prtica e pode ser utilizada, para testar a sensibilidade microbiana, simultaneamente, a diferentes frmacos. Essas metodologias, aqui citadas, podem ser facilmente ser utilizadas, em larga escala, por laboratrios com poucos recursos tecnolgicos. relevante registrar, que a determinao do tamanho dos halos de inibio de crescimento, sofre vrias interferncias, entre elas, a difusibilidade dos novos frmacos ainda em estudo, no meio de cultura. No entanto, vrios autores relatam boa correlao entre os diversos mtodos fenotpicos de identificao e avaliao de resistncia antimicrobiana (DEVIA et al., 1988; SAKOULAS, et al.; 2001; PREZROTH et al., 2002; BRAOIOS, 2005; PACKER; LUZ, 2007).

5.4 Classificao do perfil fenotpico das cepas de S. aureus A Tabela 7 mostra que todas as amostras de S. aureus estudadas apresentaram as mesmas caractersticas fenotpicas, em relao produo das enzimas catalase e coagulase, fermentao do manitol e produo de hemlise em Agar sangue. A variao fenotpica ocorreu apenas em funo do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, onde o fentipo ou antibiotipo mais encontrado foi chamado de F1, no qual se detectou resistncia penicilina e ampicilina, comum na maioria das amostras de S. aureus. Este comportamento tambm foi observado por ZavadinackNetto et al. (2001) os quais comprovaram que a penicilina assim como a ampicilina so eficazes apenas para 8,5% das cepas de S. aureus isolados de infeces comunitrias, fato que restringe o uso destes antimicrobianos. De modo que, o conhecimento do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, associado avaliao da relao gentica existente entre as cepas pode fornecer valiosos dados na alternativa da profilaxia ou tratamento destas infeces (BRAOIOS, 2005).

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Tabela 7. Classificao dos perfis fenotpicos das cepas de S. aureus

C a r a c t e r s t i c a s Fentipos de resistncia - Antibiotipo Cepas F1 122 U 146 U 223 U 312 U 319 U 129FN 233FN 322FN 171c 8c 18c 43c 44c 45c 46c 47c 48c 49c 50c ATCC 1 2 PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP PEN-AMP TET* ERI- OXA-AZI ERI- SUF ERI- SUF TET TET* TET* TET ERI- AMIGEN-EST ERI-TET- OXAAZI-SFT F2 ERI F3 F4 F5 F6 f e n o t p i c a s Fermentao do Manitol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Hemlise em Agar Sangue + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Coagulase Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Legenda: U = bere; FN = fossas nasais; c = clnica; A= ambiental; (+) = positivo; (-) = cepas sensveis a todos os antimicrobianos testados; * resistente a clindamicina; PEN = penicilina G; AMP = apicilina; TET = tetraciclina; ERI = eritromicina; OXA = oxacilina; AZI = azitromicina; SFT = sulfametoxazol-trimetoprima; GEN = gentamicina; AMI = amicacina; EST = estreptomicina.

A resistncia penicilina G tem sido observada na maioria das cepas de S. aureus, essa ocorrncia tambm foi observada nesse estudo, tanto nas linhagens de origem humana quanto nas de origens animal e ambiental. Esse fato, preocupante, provavelmente reflexo do uso indiscriminado desse antimicrobiano, to discutido nos ltimos anos por diversos pesquisadores (ZAVADINACK-NETTO et al., 2001; BRAOIOS, 2005; FERREIRA et al., 2006; COELHO et al., 2007).

5.5 Avaliao da relao estrutura-atividade antimicrobiana das riparinas Na Tabela 8 esto registradas as nomenclaturas qumicas das riparinas I, II e III e a relao estrutura-atividade antimicrobiana em funo do nmero e percentual de cepas de S. aureus sensveis a essas substncias.

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Tabela 8. Apresentao da relao estruturaatividade antimicrobiana de riparinas frente a S. aureus (n = 22)

Riparinas
(200 g/mL)

Nomenclatura qumica OMetilN (benzoil)tiramina ou N-[8-(4-metoxifeniletil)]-benzoilamida

MeO

Estrutura qumica

Cepas sensveis n (%)

NH O

5 (22,7%)

II

OMetilN(2 hidroxibenzoil) tiramina ou N-[8-(4-metoxifeniletil)]-2-hidroxibenzoilamida OMetilN(2,6-dihidroxibenzoil) tiramina ou N-[8-(4-metoxipfeniletil)]-2,6-dihidroxibenzoilamida

NH MeO O OH
6 (27,3%)

HO NH MeO O OH

III

20 (90,9%)

Foi observado, nesse experimento que apesar da semelhana estrutural, as riparinas possuem atividades antimicrobianas distintas. A diferena entre as riparinas I e II, reside no fato da segunda apresentar um grupo OH no C2. Provavelmente, essa hidroxila responsvel pelo discreto aumento da ao antimicrobiana desse produto frente s cepas de S. aureus ensaiadas. Em relao riparina III, o acrscimo de mais um grupo OH no C6, foi capaz de potencializar a ao desse produto que apresentou atividade para 20 (90,9%) das cepas de S. aureus ensaiadas. Para essas cepas a relao estrutura-atividade antimicrobiana pode ser demonstrada como riparina III > riparina II > riparina I. A estrutura qumica e a atividade biolgica de compostos biologicamente ativos, esto intimamente relacionadas, porm o grande impulso em estudos nessa rea ocorreu quando Hansch; Fujita (1964) propuseram um mtodo voltado para o estudo de relaes quantitativas entre estrutura qumica e atividade biolgica (MASUNARI; TAVARES, 2006). Os avanos dos estudos preditivos da atividade biolgica de compostos anlogos ainda desconhecidos, constitui, sem dvida, uma alternativa vivel para o desenvolvimento de novos frmacos com atividade antimicrobiana. Porm, ainda no so auto-suficientes a ponto de se dispensar dados experimentais (MASUNARI; TAVARES, 2006).

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A Tabela 9 e o Grfico 1 contm os resultados diferenciais da relao estrutura-atividade antimicrobiana das riparinas I, II e III frente s cepas de S. aureus e E. coli pelo mtodo de cavidade-placa, avaliada em funo da presena ou ausncia de halos de inibio de crescimento. As riparinas apresentaram diferentes percentuais de atividade antimicrobiana para as cepas de S. aureus ensaiadas, que foram respectivamente de 22,7%, 27,3% e 90,9% para as riparinas I, II e III; enquanto que para as cepas de E. coli, todas as riparinas foram consideradas ineficazes, nas concentraes ensaiadas, por no apresentarem halos de inibio de crescimento. Essa diferena de ao das riparinas sobre as cepas de S. aureus e E. coli, provavelmente est relacionada s diferenas estruturais de suas membranas celulares. Tabela 9. Avaliao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e E. coli Riparinas [200 g/mL] I II III Microrganismos ensaiados (n e % de Cepas sensveis) S. aureus (22/100%) E. coli (10/100%) 5 (22,7%) 6 (27,3%) 20 (90,9%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

S. aureus
100 90

E. coli
90,9%

% de cepas sensveis

80 70 60 50 40 30 20 10 0 I II III 0% 0% 0% 22,7% 27,3%

Riparinas

Grfico 1. Comparao do efeito das riparinas frente s cepas de S. aureus e E. coli

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Esses resultados esto em concordncia com os relatados anteriormente por Cato et al. (2005), que alm das riparinas I e III, tambm pesquisaram a atividade antimicrobiana da riparina XIII (O-metil-N-(3,4,5-trimetoxibenzoil-tiramina)) e consideraram a riparina III como o produto mais ativo da srie, frente a linhagens de S. aureus multirresistentes, de origem humana, apresentando atividade para 11(91,7%) das cepas ensaiadas. Com relao atividade antimicrobiana dessas riparinas frente s cepas de E. coli, esses autores verificaram a presena de discretos halos de inibio de crescimento, apresentando 7 mm. provvel que essa diferena comportamental encontrada em E. coli, esteja relacionada s caractersticas fenotpicas de resistncia das linhagens nos dois experimentos.

5.6 Avaliao da cintica bacteriana As tabelas 10, 11 e 12 a seguir, apresentam respectivamente, os resultados dos valores mdios dos efeitos das riparinas I, II e III sobre as linhagens de S. aureus ATCC 25923, 319U e 122U, determinando-se o nmero de clulas viveis atravs do nmero de Unidades Formadoras de Colnias - UFC/mL, em funo do tempo de exposio desses microrganismos s riparinas. Foi observado, na linhagem ATCC 25923, que as riparinas I e II mantiveram lentido na taxa de multiplicao celular nas primeiras 4 horas de exposio, em relao ao que inculo inicial de 2,17 x 106 UFC/mL, quando comparado com o controle de crescimento sem adio de riparinas. Observou-se nesse controle de crescimento, que a viabilidade celular, atingiu o valor mximo de 1012 UFC/mL aps 10 horas de incubao, apresentando relao percentual entre o desvio padro (DP) e a mdia aritmtica (M) dos ensaios (DP/M) de 5,59% (Apndice A). No entanto, quando em contato com as riparinas, houve uma reduo na taxa de crescimento bacteriano, representada por 2,70 x 108 UFC/mL, 4,10 x 107 UFC/mL e 1,32 x 103 UFC/mL, respectivamente, para as riparinas I, II e III. Observou-se ainda que a riparina III, conseguiu gradativamente diminuir ainda mais, o nmero de clulas viveis, passando para valores mdios de 2,50 x 102 UFC/mL e 0 UFC/mL, aps exposio por 24 e 48h/37C, respectivamente (Tabela 10).

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Tabela 10. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923, frente s riparinas
Tempo de exposio ao produto
(Horas/37C)

Controle de crescimento
(UFC/mL)

Riparinas (200 g/mL) I

(UFC/mL)

II
(UFC/mL)

III
(UFC/mL)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

2,17E+06 6,00E+06 2,10E+07 4,00E+08 2,00E+10 1,00E+12 2,40E+10 2,80E+09

2,17E+06 2,47E+06 2,57E+06 3,70E+07 4,60E+07 2,70E+08 3,10E+08 1,00E+08

2,17E+06 6,20E+06 3,90E+06 2,30E+07 8,60E+07 4,10E+07 7,20E+08 1,00E+08

2,17E+06 7,90E+05 8,24E+05 9,72E+04 3,22E+04 1,32E+03 2,50E+02 0,00

Os resultados apresentados no Grfico 2 constataram que as riparinas I e II apresentaram comportamentos semelhantes e compatveis com ao bacteriosttica, enquanto que a riparina III apresentou ao considerada como bactericida, para a linhagem em estudo (ATCC 25923).
Controle de Crescimento
1,0E+12 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 Log(UFC/mL) 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 0h 2h 4h 6h 8h Tem po (horas) 10h 24h 48h

Riparina I

Riparina II

Riparina III

Grfico 2. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus ATCC 25923 frente s riparinas Em relao s linhagens de S. aureus 319U e 122U, tambm foram observados comportamentos semelhantes aos da cepa ATCC 25923; no entanto, o tempo considerado como ponto mximo de viabilidade dessas linhagens sem adio das riparinas foi de 8h de exposio, onde a linhagem 319U atingiu um crescimento populacional com valor mdio de 3,3 x 1012 UFC/mL, com relao percentual do

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DP/M de 3,03% (Apndice B) e quando exposta s riparinas I, II e III essa taxa de contagem passou, respectivamente para 5,24 x 107 UFC/mL, 2,03 x 107 UFC/mL e 3,01 x 105 UFC/mL. Aps incubao por 48h/37C, apenas a riparina III reduziu a zero o nmero de UFC/mL, as riparinas I e II, mantiveram basicamente o mesmo valor de UFC/mL do inculo inicial (Tabela 11 e Grfico 3). Tabela 11. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s rparinas
Tempo de exposio ao produto
(Horas/37C)

Riparinas (200 g/mL) Controle de crescimento

(UFC/mL)

I
(UFC/mL)

II
(UFC/mL)

III
(UFC/mL)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

2,27E+06 6,62E+07 3,30E+08 2,50E+09 3,30E+12 1,00E+11 1,00E+10 2,28E+09

2,27E+06 5,13E+06 2,39E+06 3,85E+07 5,24E+07 4,73E+07 5,57E+06 4,67E+06

2,27E+06 1,62E+07 1,26E+08 7,93E+07 2,03E+07 1,52E+07 1,88E+06 3,97E+06

2,27E+06 2,85E+06 3,27E+06 7,54E+05 3,01E+05 2,94E+04 1,24E+03 0,00

Controle de Crescimento
1,0E+13 1,0E+12 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 Log (UFC/mL) 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 0h 2h 4h

Riparina I

Riparina II

Riparina III

6h

8h

10h

24h

48h

Tempo (horas)

Grfico 3. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 319U frente s riparinas A linhagem 122U, atingiu o ponto mximo de viabilidade, 3,2 x 1011 UFC/mL, tambm aps 8 horas de inoculao, com relao percentual do DP/M de 3,13% (Apndice C) e quando exposta s riparinas I, II e III essa contagem passou, respectivamente para 1,67 x 107 UFC/mL, 3,80 x 107 UFC/mL e 2,26 x 104 UFC/mL. Os efeitos apresentados pelas riparinas, foram de interferncia no crescimento

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bacteriano, impedindo ou retardando a multiplicao celular (riparina I e II) e morte celular (riparina III) aps 48h de inoculao (Tabela 12 e Grfico 4). Tabela 12. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas
Tempo de exposio do produto
(Horas/37C)

Riparinas (200 g/mL) Controle de crescimento

(UFC/ml)

I
(UFC/mL)

II
(UFC/mL)

III
(UFC/mL)

0h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h

3,60E+06 1,74E+07 2,60E+09 4,80E+09 3,20E+11 4,67E+10 1,00E+10 1,87E+09

3,60E+06 5,33E+06 6,67E+06 6,17E+06 1,67E+07 4,53E+07 5,71E+07 3,37E+07

3,60E+06 7,77E+06 8,49E+06 1,24E+07 3,80E+06 4,50E+07 8,40E+05 9,23E+06

3,60E+06 4,60E+06 2,47E+05 3,70E+04 2,26E+04 4,80E+03 3,97E+02 0,00

Controle de Crescimento
1,0E+12 1,0E+11 1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 Log (UFC/ml) 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 1,0E-01 0h 2h 4h

Riparina I

Riparina II

Riparina III

6h

8h

10h

24h

48h

Tem po (horas)

Grfico 4. Cintica bacteriana da cepa de S. aureus 122U frente s riparinas Os resultados apresentados so bastante significativos, visto que a atividade bactericida da CIM da riparina III sobre as cepas de S. aureus ensaiadas, ficaram bem caracterizados aps 6h, 8h e 10h de incubao, quando se observou reduo de 2 log 10 UFC/mL do inculo inicial, atingindo a reduo de 4 log 10 UFC/mL em 24h, respectivamente para as cepas ATCC 25923 e 122U; e 3 log 10 UFC/mL para a cepa 319U. As riparinas I e II mantiveram o inculo bacteriano, sempre prximo ao valor do inculo inicial, por todo o perodo de tempo avaliado, mostrando graus

87

menores de interferncia na morte celular. De alguma forma as riparinas I e II impediram a multiplicao celular, apresentando efeito bacteriosttico sobre linhagens de S. aureus. Porm, o modo como atuam ainda precisa ser esclarecido. Segundo May et al. (2000), o efeito bactericida pode ser observado pela diminuio de 3 log 10 UFC/mL ou 99% de morte celular, partir do inculo inicial, sobre um tempo determinado, enquanto que, Jones et al. (2002) e Shelburne et al. (2004), consideram significativamente satisfatria, a cintica bactericida de um produto, quando este capaz de reduzir o inculo inicial, respectivamente, para valores iguais ou superiores a 2 log 10 UFC/mL e 3 log 10 UFC/mL, em um tempo menor ou igual a 24 horas de incubao e consideram graus menores de morte celular como efeito bacteriosttico. De acordo com estas definies, pode-se considerar que as riparinas I e II apresentam efeito bacteriosttico e a riparina III, efeito bactericida para as linhagens de S. aureus ensaiadas. O efeito bactericida da riparina III est apresentado nas Figuras 12 e 13 sob dois aspectos: visualizao da reduo gradual do nmero de microrganismos (UFC/mL) e ausncia de viabilidade celular. A Figura 12 mostra de forma comparativa a evoluo do crescimento bacteriano, da linhagem 319U inoculada com e sem adio da riparina III, comprovando o efeito bactericida dessa riparina aps exposio por diferentes intervalos de tempo de incubao a 37C, pela reduo do nmero de microrganismos. A Figura 13 apresenta a leitura colorimtrica desse efeito, bactericida, produzido pela riparina III, sobre as linhagens 319U e 122U utilizadas na cintica, visualizado aps adio de 0,5 mL de resazurina (0,1%) s suspenses bacterianas, incubadas por 24/37C, indicando inviabilidade celular.

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(a) (b) Figura 12. Demonstrao do crescimento bacteriano (a) e do efeito da riparina III sobre a cepa de S. aureus 319U (b) em diferentes espaos de tempo

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Figura 13. Efeito bactericida da riparina III sobre S. aureus aps exposio por 24h/37C
Legenda: Tubos C (319U e 122U) = Controle de crescimento (suspenso bacteriana sem riparina = Presena de clulas viveis); Tubos Rip III (319U e 122U) = Inculo bacteriano (suspenso bacteriana contendo riparina III = Morte bacteriana).

Diante do problema da resistncia aos antimicrobianos, vrias pesquisas sobre a cintica bacteriana tm sido realizadas buscando-se novos produtos que apresentem eficcia sobre os microrganismos, oportunistas, emergentes ou reemergentes. Produtos naturais tais como, extrato de Punica granatum Linn. (rom) (SILVA, 2004a: CATO et al., 2006; PACKER; LUZ, 2007), Anacardium occidentale Linn. (cajueiro) (SILVA, 2004b), prpolis (ADELMANN, 2005), Rosmarinus officinalis Linn. (MARTINS, 2005), Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. (jurema-preta) (PADILHA, 2006), Ocotea duckei (ANTUNES et al., 2006), Abarema cochliocarpos (Gomes) Barneby & Grimes (barbatimo) (SANTOS et al., 2007), e leos essenciais de Mentha x villosa (ARRUDA et al., 2006) e Baccharis dracunculifolia D.C. (leo de vassoura) (FERRONATTO et al., 2007), tambm apresentam atividade bactericida sobre S. aureus e podem se tornar possveis campos de desenvolvimento de novas estratgias no tratamento de infeces promovidas por esses micorganismos, incluindo amostras multirresistentes (BRITO, 2003). A maioria desses extratos e leos essenciais apresenta efeitos bactericidas sobre cepas de S. aureus num menor espao de tempo, em mdia, entre as oito primeiras horas de contato com as amostras. No entanto, essa diferena de tempo, para a reduo do nmero de

90

microrganismos no diminui a eficcia da riparina III, sobre esses microrganismos, que conseguiu reduzir a 0 UFC/ml aps 48 horas de contato. relevante ressaltar que o efeito bactericida ou bacteriosttico que esses produtos possam causar est relacionado no s ao tempo de exposio, a concentrao de cada produto como tambm, as caractersticas fenotpicas das linhagens em estudo.

5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de riparinas sobre linhagens de Candida albicans As riparinas I, II e III, no apresentaram halo de inibio sobre o crescimento fngico, pelo mtodo de cavidade-placa, para nenhuma das 6 cepas de C. albicans ensaiadas neste estudo (Tabela 13). A ausncia de atividade antifngica encontrada neste estudo contradiz os resultados citados por Marques (2001) que mostrou atividade antibitica, in vitro, de um extrato dos frutos e dos clices persistentes de A. riparia contra C. albicans. provvel que a divergncia entre esses resultados, esteja relacionada ao fato de que nos extratos encontram-se vrias substncias e que juntas, atuem interagindo entre si, podendo potencializar a ao antimicrobiana; no se podendo afirmar, no entanto, qual delas, isoladamente, realmente apresenta tal atividade.

Tabela 13. Perfil de suscetibilidade das cepas de C. albicans frente s riparinas Cepas ensaiadas
C.albicans ATCC 76643 C.albicans 01 C.albicans 02 C.albicans 03 C.albicans 04 C.albicans 05 Total de cepas testadas/ % de sensibilidade

Dimetros dos halos de inibio (mm) Riparinas (200g/mL) I II III

0 0 0 0 0 0 6 (0%) 0 0 0 0 0 0 6 (0%) 0 0 0 0 0 0 6 (0%)

Legenda: (0) = Ausncia de halo de inibio de crescimento fngico.

91

5.8 Avaliao da cintica fngica Mesmo no tendo apresentado atividade antifngica in vitro, observada atravs da ausncia de halos de inibio de crescimento, realizou-se a avaliao do efeito da riparina III frente cepa e C. albicans ATCC 76643, em diferentes tempos de incubao por at 72 horas de exposio, para avaliao da cintica fngica estabelecendo-se a concentrao de 200 g/mL igual a usada nos ensaios bacterianos como sendo a concentrao padro para esse ensaio, visto que segundo Cantn; Pemn (1999), as curvas de crescimento/morte tanto para as leveduras quanto para as bactrias, so determinadas do mesmo modo, ainda que nem todas as definies usadas em bacteriologia sirvam para a micologia. Foi observado que as riparinas no influenciaram na multiplicao fngica nos tempos pr-estabelecidos. Esse resultado est baseado no comportamento da cepa de C. albicans ATCC 76643, que se manteve vivel por todo o perodo de exposio ao produto, apresentando a mesma taxa de crescimento do teste controle, sem adio da riparina (Tabela 14) Tabela 14. Cintica fngica e efeito in vitro da riparina III sobre C. albicans ATCC 76643
Tempo de exposio ao produto (Horas/35C) Controle de crescimento (UFC/mL) Riparina III (200 g/mL)

0 2 4 6 8 10 24 48 72

7,8 x 105 8,5 x 106 9,2 x 107 3,2 x 108 5,9 x 108 7,3 x 109 2,8 x1010 2,3 x1010 >1010

7,8 x 105 9,8 x 106 8,8 x 107 6,3 x 108 5,5 x 108 6,2 x 109 1,9 x 010 2,3 x1010 >1010

O Grfico 5 apresenta comparativamente o comportamento da multiplicao celular da cepa de C. albicans ATCC 76643, aps inoculao em caldo Sabouraud contendo riparina III. O resultado da cintica fngica mostra que a riparina III no foi capaz de causar nenhum efeito inibitrio sobre o crescimento populacional nessa linhagem visto que no houve decaimento em nenhum dos tempos de exposio.

92

Esse resultado coincide com o resultado da atividade antifngica por difuso em meio slido (cavidade-placa).
Controle de Crescimento
1,00E+11

Riparina III

1,00E+10

Log (UFC/mL)

1,00E+09

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06 0 2 4 6 8 Horas/35C 10 24 48 72

Grfico 5. Cintica fngica da cepa de C. albicans ATCC 76643 frente riparina III Apesar do mecanismo de ao da atividade antimicrobiana das riparinas ainda no ter sido elucidado, provvel que essas substncias atuem de forma semelhante maioria dos frmacos que apresentam atividade antimicrobiana de forma seletiva, ou seja, quando apresentam atividade antibacteriana, geralmente no apresentam atividade antifngica. Esse resultado comprova a grande diferena de ao existente entre substncias antibacterianas e antifngicas que est relacionada no s estrutura molecular desses compostos como tambm, e principalmente, as diferenas celulares existentes entre os dois grupos microbianos estudados.

5.9 Avaliao da atividade curagnica As duas amostras representativas de S. aureus (linhagens 319U e 122U), com marcas de resistncia para penicilina (plasmdeos penicilinase) e para eritromicina selecionadas para esse estudo, apresentaram, respectivamente, CIM de 16 g/mL e 128 g/mL para penicilina e 16 g/mL e 512 g/mL para eritromicina indicativo de resistncia a esses antibiticos.

93

Aps 24 horas de exposio s riparinas I, II e III, em concentraes subinibitrias (1/2 CIM = 100 g/mL), tiveram seu comportamento mais uma vez avaliados e observou-se que as riparinas I e II no causaram nenhum efeito sobre a eliminao da marca de resistncia a penicilina nessas linhagens, mantendo a CIM desses antimicrobianos inalterada. No entanto a riparina III, foi capaz de produzir reverso fenotpica em uma das linhagens (319U), que teve sua marca de resistncia penicilina eliminada ou inexpressada, passando a apresentar CIM de 0,064 g/mL, indicando sensibilidade a esse antibitico. De acordo com o NCCLS (2004), considerado como resistente cepas de S. aureus que apresentem CIM 0,25 g/mL. As riparinas no causaram efeitos sobre a eliminao da marca de resistncia eritromicina nessas linhagens. A reverso fenotpica pode ser influenciada por diversos fatores, dentre eles a ao de substncias capazes de eliminar e/ou impedir a expresso de um determinado gene (PEREIRA, 2000). Esse resultado indica que ocorreu alguma modificao relacionada ao gene da resistncia penicilina. A linhagem 122U no foi afetada pela ao das riparinas, em relao eliminao das marcas de resistncia penicilina nem a eritromicina, indicando nesse caso, que no foram eficazes para promover cura de plasmdeos (Tabela 15). Tabela 15. Linhagens de S. aureus com marcas de resistncia para penicilina e eritromicina
Linhagens Marca de resistncia Pen Eri Pen Eri CIM (g/mL) I 16 8 128 16 16 8 128 16 CIM* (g/mL) Riparinas (200g/mL) II 16 8 128 16 Resistncia** (g/mL) III 0,064 8 128 16 0,25 8 0,25 8

319U 122U

Legenda: Pen = penicilina G; Eri = eritromicina * CIM aps tratamento por riparinas; ** Referncia = NCCLS, 2004.

Na Tabela 16 e no Grfico 6 encontram-se os resultados da ao das riparinas na freqncia de eliminao da marca de resistncia penicilina (plasmdeos penicilinase). Observou-se aps tratamento com as riparinas I, II e III, que a amostra 122U no apresentou nenhuma variante sensvel, indicando ausncia de cura de plasmdeos com esses produtos, nessa linhagem. Tambm no foi

94

observada nenhuma variante sensvel aps tratamento com as riparinas I e II para a linhagem 319U. No entanto aps tratamento com riparina III, que mostrou ser a mais eficiente do grupo estudado, foi observada a eliminao de resistncia para penicilina na amostra 319U, numa freqncia de 61,7%. Essa freqncia foi calculada como a percentagem de colnias sensveis a esse antimicrobiano sobre o total de colnias ensaiadas (no mnimo, 200 colnias em cada experimento). A elevada freqncia encontrada nesse estudo, pela riparina III superior encontrada nos produtos tidos como padro curagnico como o caso do brometo de etidio e de outras substncias como rifampicina, novobiocina e coumermicina (PEREIRA et al., 2004). Diferentes percentuais de freqncia de cura podem ser encontrados em substncias de um mesmo grupo farmacolgico, de modo que esses resultados esto em concordncia com os relatados por Pereira et al. (2004), que encontraram diferentes percentuais de freqncia de cura de plasmdeos por fluorquinolonas e observaram que a ciprofloxacina eliminou resistncia para a penicilina na amostra 319U numa freqncia de 0,88% no eliminando para outras linhagens de S. aureus (223U e 233FN). Observaram tambm, que a norfloxacina eliminou resistncia para penicilina numa freqncia de 0,49% para a linhagem 223U, no eliminando para a 319U, indicando que a eliminao de resistncia por fluorquinolonas sofre variaes; fato semelhante ao encontrado nesse estudo, em relao ao comportamento das riparinas frente s linhagens 122U e 319U. Entretanto, a flutuao na eliminao de plasmdeos uma caracterstica que pode refletir peculiaridades genotpicas das linhagens em estudo (LACEY; CHOPRA, 1974).

Tabela 16. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em linhagens de S. aureus Riparinas [100g/mL] I II III n de colnias ensaiadas / n de variantes sensveis 319U 122U 520/0 491/0 311/192 218/0 293/0 392/0 Freqncia de cura (%) 319U 122U 0,00 0,00 61,7 0,00 0,00 0,00

95

70

Freqncia de cura (%)

60 50 40 30 20 10 0

II
Riparinas (100 g/mL)

III

Grfico 6. Freqncia da eliminao da marca de resistncia penicilina por riparinas em S. aureus linhagem 319U A confirmao fenotpica da eliminao da resistncia penicilina na linhagem 319U, aps tratamento com riparina III, foi observada por trs metodologias diferentes: por imprint ou rplica em placa de BAB com adio de penicilina, onde se observou ausncia de crescimento de algumas colnias, sensveis penicilina (Figura 14), pelo antibiograma para caracterizao do perfil de sensibilidade dessas variantes sensveis (Figura 15), e em seguida pelo E-test para determinao da CIM penicilina (Figura 16).

(a)

(b)

Figura 14. Variantes da linhagem 319U aps tratamento com riparina III, placa matriz BAB (a) e placa imprint - BAB-penicilina (b)

96

(a)

(b)

Figura 15. Antibiograma da linhagem 319U antes do tratamento de cura pela exposio riparina III (a) e de sua variante sensvel penicilina aps o tratamento (b)

(a)

(b)

Figura 16. E-test para penicilina da linhagem de S. aureus 319U antes (a) e aps exposio riparina III confirmao de cura (b)

97

A Figura 17 apresenta o resultado do E-test realizado para algumas variantes da linhagem 319U obtidas aps tratamento com a riparina III, as quais passaram a ser penicilina-sensveis apresentando CIM de 0,064 g/mL.

Figura 17. Determinao da CIM para penicilina por E-test em variantes 319U

6 CONCLUSES

99

6 CONCLUSES

Os resultados obtidos nos estudos de atividades microbiolgicas in vitro, permitiram concluir que: As riparinas I, II e III apresentam atividade antimicrobiana in vitro sobre a maioria das linhagens de S. aureus de origem animal. As riparinas I, II e III no apresentaram atividade antimicrobiana sobre as cepas: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 e C. albicans ATCC 76643, nem sobre as linhagens ambulatoriais, ensaiadas. Tambm no apresentaram atividade para as linhagens MRSA A riparina III apresenta maior potencial antimicrobiano in vitro sobre linhagens de S. aureus sensveis ou resistentes penicilina, de origem animal, humana e ambiental, qunado comparadas com as riparinas I e II. Estudos de cintica bacteriana demonstraram que as concentraes inibitrias mnimas das riparinas I e II exercem um efeito bacteriosttico e que a riparina III apresenta um efeito bactericida sobre as linhagens de S. aureus ensaiadas. A avaliao da estrutura-atividade antimicrobiana demonstrou que as riparinas I, II e III apresentam pequenas diferenas estruturais, porm distintos efeitos in vitro para as linhagens de S. aureus ensaiadas. A riparina III apresenta potencialidade sobre cura de plasmdeo penicilinase e/ou alterao no gene da expresso da resistncia penicilina. A freqncia de cura do plasmdeo penicilinase pela riparina III, foi superior encontrada na literatura para outros produtos curagnicos, tidos como padro ouro.

7 PERSPECTIVAS

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7 PERSPECTIVAS resistncia bacteriana um srio problema de sade pblica mundial e deve ser abordado sob vrios aspectos, entre eles o entendimento dos processos relacionados ao dos antimicrobianos e ao surgimento da resistncia, o planejamento, a sntese e a avaliao farmacolgica de novos agentes antimicrobianos mais potentes e sua possvel aplicao teraputica de forma racional. conveniente ressaltar tambm a importncia da adoo de medidas normativas para o controle de infeces nosocomiais. Os recentes avanos na identificao e compreenso dos novos mecanismos de ao dos antimicrobianos mostram que diversos fatores podem ser responsveis pela potncia de uma determinada substncia, contribuindo de maneira diferenciada para a atividade antimicrobiana. A compreenso dos mecanismos de defesa microbiana e dos fenmenos associados ao surgimento de resistncia a partir de transferncia gentica ou por mutaes espontneas ou por mutaes induzidas, permite o planejamento de estratgias para controlar e debelar linhagens resistentes. O desenvolvimento de novos agentes bactericidas pode ser alcanado pela elaborao racional de novas geraes de antimicrobianos visando suplantar a resistncia, atravs de programas direcionados ao descobrimento de produtos naturais e sintticos bioativos. Considerando o efeito bactericida in vitro que a riparina III apresentou sobre linhagens de S. aureus, nesse estudo, sugere-se que mais pesquisas sejam realizadas, como a determinao de sinergismo e/ou antagonismo entre agentes antimicrobianos, visando conhecer o mecanismo de ao dessa substncia assim como o(s) mecanismo(s) de resistncia; e determinao de sua potencialidade teraputica atravs de estudos in vivo, no sentido de encontrar mtodos alternativos de controle de patgenos.

REFERNCIAS

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APNDICES

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Apndice A - Estatstica descritiva da cintica bacteriana de S.aureus ATCC 25923 frente s riparinas
Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Controle de crescimento 1 2,17E+06 6,00E+06 2,10E+07 4,00E+08 2,00E+10 1,00E+12 2,40E+10 2,80E+09 2,17E+06 1,00E+12 Ensaios 2 2,00E+06 6,50E+06 2,20E+07 4,10E+08 1,90E+10 1,10E+12 2,30E+10 2,90E+09 2,00E+06 1,10E+12 3 2,35E+06 5,50E+06 2,00E+07 3,50E+08 2,10E+10 1,00E+12 2,50E+10 2,70E+09 2,35E+06 1,00E+12 Mdia (M) 2,17E+06 6,00E+06 2,10E+07 3,87E+08 2,00E+10 1,03E+12 2,40E+10 2,80E+09 2,17E+06 1,03E+12 Desvio Padro (DP) 0,175E+06 0,500E+06 0,100E+06 0,321E+08 0,100E+10 0,577E+11 0,100E+10 0,100E+09 0,175E+06 0,577E+11 DP/M* % 8,05 8,33 4,76 8,31 5,00 5,59 4,17 3,57 3,57 8,33

RIPARINA I 1 2,17E+06 2,47E+06 2,57E+06 3,70E+07 4,60E+07 2,70E+08 3,10E+08 1,00E+08 2,17E+06 3,10E+08 Ensaios 2 2,34E+06 2,64E+06 2,60E+06 3,90E+07 4,20E+07 2,59E+08 3,00E+08 1,02E+08 2,34E+06 3,00E+08 3 2,00E+06 2,30E+06 2,54E+06 3,50E+07 5,00E+07 2,81E+08 3,20E+08 1,00E+08 2,00E+06 3,20E+08 Mdia (M) 2,17E+06 2,47E+06 2,57E+06 3,70E+07 4,60E+07 2,70E+08 3,10E+08 1,01E+08 2,17E+06 3,10E+08 Desvio Padro (DP) 0,170E+06 0,170E+06 0,300E+05 0,200E+07 0,400E+07 0,110E+08 0,100E+08 0,115E+07 0,300E+05 0,110E+08 DP/M* % 7,83 6,88 1,17 5,41 8,70 4,07 3,23 1,15 1,17 8,70

RIPARINA II 1 2,17E+06 6,20E+06 3,90E+06 2,30E+07 8,60E+07 4,10E+07 7,20E+08 1,00E+08 2,17E+06 7,20E+08 Ensaios 2 2,14E+06 6,60E+06 4,00E+06 2,40E+07 8,90E+07 3,90E+07 6,90E+08 1,01E+08 2,14E+06 6,90E+08 3 2,20E+06 5,80E+06 3,80E+06 2,20E+07 8,30E+07 4,30E+07 7,50E+08 1,02E+08 2,20E+06 7,50E+08 Mdia (M) 2,17E+06 6,20E+06 3,90E+06 2,30E+07 8,60E+07 4,10E+07 7,20E+08 1,01E+08 2,17E+06 7,20E+08 Desvio Padro (DP) 0,300E+05 0,400E+06 0,100E+06 0,100E+07 0,300E+07 0,200E+07 0,300E+08 0,100E+07 0,300E+05 0,300E+08 DP/M* % 1,38 6,45 2,56 4,35 3,49 4,88 4,17 0,99 0,99 6,45

RIPARINA III 1 2,17E+06 7,90E+05 8,24E+05 9,72E+04 3,22E+04 1,32E+03 2,50E+02 0 0,00E+00 2,17E+06 Ensaios 2 2,14E+06 8,10E+05 8,80E+05 9,98E+04 3,30E+04 1,34E+03 2,30E+02 0 0,00E+00 2,14E+06 3 2,20E+06 7,70E+05 7,68E+05 9,46E+04 3,14E+04 1,30E+03 2,70E+02 0 0,00E+00 2,20E+06 Mdia (M) 2,17E+06 7,90E+05 8,24E+05 9,72E+04 3,22E+04 1,32E+03 2,50E+02 0,00E+00 0,00E+00 2,17E+06 Desvio Padro (DP) 0,300E+05 0,200E+05 0,560E+05 0,260E+04 0,800E+03 0,200E+02 0,200E+02 0,00E+00 0,00E+00 0,560E+05 DP/M* % 1,38 2,53 6,80 2,67 2,48 1,52 8,00 0,00 0,00 8,00

* DP/M - Relao percentual entre o desvio padro (DP) e a mdia aritmtica (M) dos ensaios

125

Apndice B - Estatstica descritiva da cintica bacteriana da linhagem de S.aureus 319U frente s riparinas
Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo CRESCIMENTO 1 2,20E+06 6,77E+07 3,50E+08 2,40E+09 3,40E+12 1,01E+11 1,00E+10 2,18E+09 2,20E+06 3,40E+12 Ensaios 2 2,20E+06 6,50E+07 3,00E+08 2,60E+09 3,20E+12 1,02E+11 1,00E+10 2,38E+09 2,20E+06 3,20E+12 3 2,40E+06 6,60E+07 3,40E+08 2,50E+09 3,30E+12 1,00E+11 1,03E+10 2,28E+09 2,40E+06 3,30E+12 Mdia (M) 2,27E+06 6,62E+07 3,30E+08 2,50E+09 3,30E+12 1,01E+11 1,01E+10 2,28E+09 2,27E+06 3,30E+12 Desvio Padro (DP) 0,115E+06 0,137E+07 0,265E+08 0,100E+09 0,100E+12 0,100E+10 0,173E+09 0,100E+09 0,115E+06 0,100E+12 DP/M* % 5,09 2,06 8,02 4,00 3,03 0,99 1,71 4,39 0,99 8,02

RIPARINA I 1 2,20E+06 5,10E+06 2,39E+06 4,00E+07 5,24E+07 4,73E+07 5,57E+06 4,67E+06 2,20E+06 5,24E+07 Ensaios 2 2,30E+06 5,10E+06 2,37E+06 4,00E+07 5,48E+07 4,56E+07 6,00E+06 4,69E+06 2,30E+06 5,48E+07 3 2,30E+06 5,20E+06 2,40E+06 3,56E+07 5,00E+07 4,90E+07 5,14E+06 4,65E+06 2,30E+06 5,00E+07 RIPARINA II 1 2,20E+06 1,64E+07 1,20E+08 7,93E+07 2,20E+07 1,52E+07 1,80E+06 3,92E+06 1,80E+06 1,20E+08 Ensaios 2 2,34E+06 1,60E+07 1,32E+08 7,90E+07 2,00E+07 1,50E+07 1,96E+06 4,00E+06 1,96E+06 1,32E+08 3 2,27E+06 1,62E+07 1,26E+08 7,96E+07 1,88E+07 1,54E+07 1,88E+06 3,99E+06 1,88E+06 1,26E+08 Mdia (M) 2,27E+06 1,62E+07 1,26E+08 7,93E+07 2,03E+07 1,52E+07 1,88E+06 3,97E+06 1,88E+06 1,26E+08 Desvio Padro (DP) 0,700E+05 0,200E+06 0,600E+067 0,300E+06 0,162E+06 0,200E+06 0,800E+05 0,436E+05 0,436E+05 0,600E+07 DP/M* % 3,08 1,23 4,76 0,38 7,98 1,32 4,26 1,10 1,10 7,98 Mdia (M) 2,27E+06 5,13E+06 2,39E+06 3,85E+07 5,24E+07 4,73E+07 5,57E+06 4,67E+06 2,27E+06 5,24E+07 Desvio Padro (DP) 0,577E+05 0,577E+05 0,153E+06 0,254E+08 0,240E+08 0,170E+07 0,430E+07 0,200E+05 0,153E+05 0,254E+07 DP/M* % 2,55 1,12 0,64 6,59 4,58 3,59 7,72 0,43 0,43 6,59

RIPARINA III 1 2,20E+06 2,80E+06 3,20E+06 7,58E+05 3,00E+05 2,94E+04 1,20E+03 0,00 0,00 3,20E+06 Ensaios 2 2,33E+06 2,85E+06 3,27E+06 7,50E+05 3,02E+05 2,98E+04 1,24E+03 0,00 0,00 3,27E+06 3 2,28E+06 2,90E+06 3,34E+06 7,54E+05 3,01E+05 2,90E+04 1,28E+03 0,00 0,00 3,34E+06 Mdia (M) 2,27E+06 2,85E+06 3,27E+06 7,54E+05 3,01E+05 2,94E+04 1,24E+03 0,00 0,00 3,27E+06 Desvio Padro (DP) 0,656E+05 0,500E+05 0,700E+05 0,400E+04 0,100E+04 0,400E+03 0,400E+02 0,000E+00 0,000E+00 0,700E+05 DP/M* % 2,89 1,75 2,14 0,53 0,33 1,36 3,23 0,00 0,00 3,23

* DP/M - Relao percentual entre o desvio padro (DP) e a mdia aritmtica (M) dos ensaios

126

Apndice C - Estatstica descritiva da cintica bacteriana da linhagem de S.aureus 122U frente s riparinas
Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo Tempo exposio ao produto (Horas/37C) 0 2 4 6 8 10 24 48 Mnimo Mximo CRESCIMENTO 1 3,60E+06 1,73E+07 2,60E+09 4,80E+09 3,10E+11 4,80E+10 1,00E+10 1,90E+09 3,60E+06 3,10E+11 Ensaios 2 3,58E+06 1,75E+07 2,80E+09 4,70E+09 3,30E+11 4,60E+10 1,01E+10 1,86E+09 3,58E+06 3,30E+11 3 3,62E+06 1,75E+07 2,40E+09 4,90E+09 3,20E+11 4,60E+10 1,00E+10 1,84E+09 3,62E+06 3,20E+11 RIPARINA I 1 3,60E+06 5,40E+06 6,90E+06 6,17E+06 1,60E+07 4,30E+07 5,74E+07 3,20E+07 3,60E+06 5,74E+07 Ensaios 2 3,58E+06 5,40E+06 6,80E+06 6,00E+06 1,80E+07 4,50E+07 5,80E+07 3,30E+07 3,58E+06 5,80E+07 3 3,62E+06 5,20E+06 6,30E+06 6,34E+06 1,60E+07 4,80E+07 5,60E+07 3,60E+07 3,62E+06 5,60E+07 Mdia (M) 3,60E+06 5,33E+06 6,67E+06 6,17E+06 1,67E+07 4,53E+07 5,71E+07 3,37E+07 3,60E+06 5,71E+07 Desvio Padro (DP) 0,200E+05 0,115E+06 0,321E+06 0,170E+06 0,115E+07 0,252E+07 0,103E+07 0,208E+07 0,200E+05 0,252E+07 DP/M* % 0,56 2,17 4,82 2,76 6,93 5,55 1,80 6,18 0,56 6,93 Mdia (M) 3,60E+06 1,74E+07 2,60E+09 4,80E+09 3,20E+11 4,67E+10 1,00E+10 1,87E+09 3,60E+06 3,20E+11 Desvio Padro (DP) 0,200E+05 0,115E+06 0,200E+09 0,100E+09 0,100E+11 0,115E+00 0,577E+08 0,306E+08 0,200E+07 0,100E+11 DP/M* % 0,56 0,66 7,69 2,08 3,13 2,47 0,58 1,64 0,56 7,69

RIPARINA II 1 3,60E+06 7,90E+06 8,56E+06 1,22E+07 3,80E+06 4,48E+07 8,60E+05 9,20E+06 8,60E+05 4,48E+07 Ensaios 2 3,58E+06 7,60E+06 8,30E+06 1,30E+07 3,70E+06 4,50E+07 8,20E+05 9,40E+06 8,20E+05 4,50E+07 3 3,62E+06 7,80E+06 8,60E+06 1,20E+07 3,90E+06 4,52E+07 8,40E+05 9,10E+06 8,40E+05 4,52E+07 Mdia (M) 3,60E+06 7,77E+06 8,49E+06 1,24E+07 3,80E+06 4,50E+07 8,40E+05 9,23E+06 8,40E+05 4,50E+07 Desvio Padro (DP) 0,200E+05 0,153E+06 0,163E+06 0,529E+06 0,100E+06 0,200E+06 0,200E+05 0,153E+06 0,200E+06 0,529E+06 DP/M* % 0,56 1,97 1,92 4,27 2,63 0,44 2,38 1,65 0,44 4,27

RIPARINA III 1 3,60E+06 4,70E+06 2,40E+05 3,70E+04 2,18E+04 4,82E+03 3,96E+02 0,00 0,00 4,70E+06 Ensaios 2 3,58E+06 4,50E+06 2,55E+05 3,90E+04 2,20E+04 4,81E+03 4,00E+02 0,00 0,00 4,50E+06 3 3,62E+06 4,60E+06 2,45E+05 3,50E+04 2,40E+04 4,77E+03 3,96E+02 0,00 0,00 4,60E+06 Mdia (M) 3,60E+06 4,60E+06 2,47E+05 3,70E+04 2,26E+04 4,80E+03 3,97E+02 0,00 0,00 4,60E+06 Desvio Padro (DP) 0,200E+05 0,100E+06 0,764E+04 0,200E+04 0,122E+04 0,265E+02 0,231E+00 0,000E+00 0,000E+00 0,100E+06 DP/M* % 0,56 2,17 3,10 5,41 5,38 0,55 0,58 0,00 0,00 5,41

* DP/M - Relao percentual entre o desvio padro (DP) e a mdia aritmtica (M) dos ensaios