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Aula 4

PCR e Primer Design

Agradecimento: Alguns destes slides foram


modificados da palestra ministrada por Li
Liu, M.D.
Centro Interdisciplinar para Pesquisas em
Biotecnologia.
Universidade da Florida
10 de Junho de 2003
PCR
PCR
PCR
PCR
Características desejáveis em um
Primer
• Temperatura de melting (Tm) na faixa de 52 ºC a 65 ºC.

• Ausência da capacidade de dimerização.

• Ausência significativa da formação de grampos (>3 bp).

• Inexistência de sítios secundários de anelamento dos primers.

• Baixa especificidade na ligação na extremidade 3' (ie. Menor


conteúdo de GC para promover mispriming).
Uniqueness
- Deve existir somente um sítio de pareamento no DNA molde
onde ocorra a ligação do primer, o que significa que a seqüência
dos primers é única na seqüência do DNA molde.
- Não devem existir sítios de anelamento em possíveis fontes de
contaminação, tais como o ser humano, rato, cobaia, etc. (busca
BLAST no genoma correspondente).
Template DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’
TGCTAAGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCT AGTTG
A

Primer candidate 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ NOT UNIQUE!


Primer candidate 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’ UNIQUE!
Comprimento
- O comprimento do primer influencia a uniqueness e as
temperaturas de melting e anelamento.
- Quanto maior o comprimento do primer, maior a
possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que
maiores serão as temperaturas de melting e anelamento.
- De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser
inferior a 15 bases para assegurar a uniqueness. Geralmente,
nós sintetizamos primers com 17-28 bases de comprimento.
- A existência desta faixa está baseada no fato de se buscar
unique primers que apresentem temperatura de anelamento
dentro da faixa considerada como a mais adequada.
Composição de Bases
- A composição de bases afeta a especificidade da hibridização, as
temperaturas de melting e anelamento, e a estabilidade interna.
- Composição de bases randômica é preferível. Sempre que possível
devem ser evitadas longas regiões ricas em (A+T) e (G+C).
Template DNA
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’
T
GCCCGATCATGCT
TGCCCG TGCCCG ATCATGC

- Geralmente, a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60%


para assegurar-nos as temperaturas de melting e anelamento
adequadas à reação de PCR, e, desta forma, fornecer estabilidade na
hibridização. Porém, as temperaturas de melting e anelamento e a
estabilidade na hibridização são afetadas por outros fatores, os quais
nós discutiremos mais tarde.
• Therefore, (G+C) content is allowed to change.
Temperatura de Melting
-Temperatura de Melting, Tm – É a temperatura na qual metade
das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade
na forma de dupla hélice.
- Tm é dependente da composição do DNA, de modo que
aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm
ocasionado pelo maior número de ligações de H.
Determinação
(Composição de Base): Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) - 600/comprimento
Outros métodos mais precisos são disponíveis.
Temperatura de Anelamento
Temperatura de anelamento, Tanneal – É a temperatura na
qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser
calculada a partir da Tm .

Tanneal = Tm_primer – 4°C

Para assegurar que o pareamento dos primers ao DNA molde


ocorra antes que as duas fitas se liguem uma a outra, é
necessário que: Tm_product – Tanneal ≥ 30 °C .
Estringência no Anelamento do
Primer
-A estringência determina a especificidade no produto de
DNA a ser amplificado.
-Tanneal é o fator mais significante que afeta a estringência no
anelamento do primer.
Tanneal : muito baixa  menor estringência  primer pareia
em qualquer lugar.
muito alta  maior estringência  primer pode não
parear.
Outros fatores:
• GC%: pares de GC são mais estringntes que pares de AT.
• Concentração de sais & tampão.
Estrutura Interna
Se os primers puderem parear com eles mesmos, ou parearem um
com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, então a
eficiência do PCR irá ser reduzida significativamente. Primers com
estas características devem ser evitados.

Entretanto, às vezes estas duas estruturas não são problemáticas,


uma vez que a ocorrência destas pode ser restringida através da
determinação da temperatura de anelamento. Por exemplo, alguns
dímeros ou grampos são formados a 30 °C, enquanto que durante o
ciclo do PCR a temperatura mais baixa seja de 60 °C.
Primer Pair Matching

- Primers trabalham em pares – forward primer e reverse primer.


Uma vez que eles são usados na mesma reação de PCR, será
preciso que as condições do PCR estejam adequadas ao
funcionamento de ambos.
- Um ponto crítico são suas temperaturas de anelamento, as quais
deverão ser compatíveis entre si. A máxima diferença que pode ser
obervada entre elas é de 3 °C. The closer their Tanneal are, the
better.
Resumo ~ Quando um primer é
um primer?
5’ 3’

5’
3’

5’ 3’

3’
5’
Resumo ~ Critérios para Primer
Design
1. Uniqueness: assegurar o pareamento correto dos primers;
2. Comprimento: 17-28 bases. Esta faixa é variável;
3. Composição de bases: a quantidade de (G+C) deve estar em torno de
50-60%; se possível devem ser evitadas longas regiões ricas em
(A+T) e (G+C);
4. Otimizando o pareamento de bases: é crítico que a estabilidade da
extremidade 5’ seja maior que a da 3’ para minimizar erros no
pareamento.
5. Tm entre 55-80 °C é desejável;
6. Esteja certo que os primers a serem usados em uma mesma reação de
PCR tenham temperaturas de anelamento com uma diferença entre
elas que não seja superior a 2 – 3 °C.
7. Minimizar estruturas secundárias internas: grampos e dímeros não
são desejáveis.
Computer-Aided Primer Design
Primer design is an art when done by human beings, and a
far better done by machines.
machines

Alguns programas para primer design que nós utilizamos:


- Oligo: Life Science Software, standalone application.
- GCG: Accelrys, ICBR maintains the server.
- Primer3: MIT, standalone / web application
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
- BioTools: BioTools, Inc. ICBR distributes the license.
- Others: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program,
etc.

Software para determinação da temperatura de melting:


- BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
Task
Desenhar um par de primers para a seqüência “NM_203378”
no NCBI GenBank, então a seqüência que codifica a “human
myoglobin” será amplificada usando PCR.
Entre 156..620
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Primers Universais
Primers podem ser desenhados para amplificarem apenas um
produto.
Primers também podem ser desenhados para amplificarem múltiplos
produtos. Nós chamamos tais primers de “primers universais”.
Por exemplo, os primers desenhados para amplificarem todos os
genes HPV.
Estratégia:
1. Alinhar grupos de seqüências que você quer amplificar.
2. Encontrar a região mais conservada entre as extremidades 5’ e 3’.
3. Desenhar o forward primer na região conservada na porção 5’.
4. Desenhar o reverse primer na região conservada na porção 3’.
5. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par.
6. Garantir uniqueness em todas as seqüências molde.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primers Semi-Universais
Primers podem ser desenhados para amplificarem apenas um subgrupo de
seqüências-molde pertencentes a um grande grupo de seqüências
similares. Por exemplo, desenhar um primer para amplificar o gene
HPV tipos 1e 6, e não amplicar os demais.
Estratégia:
1. Alinhar todos os tipos de genes HPV.
2. Identificar um subgrupo de genes que são mais similares entre si que
em relação a outros subgrupos. Neste caso, os tipos 1 e 6.
3. Encontrar as regiões 5’ e 3’ que são mais conservadas entre o tipo 1 e
o tipo 6, mas que sejam variáveis nos outros tipos.
4. Desenhar forward primers na região 5’ e reverse primers na região 3’.
5. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par.
6. Garantir uniqueness em todas as seqüências molde.
7. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primers Degenerados /Guessmer
- Em alguns casos, as seqüências de DNA não estão
disponíveis ou são difíceis de serem alinhadas. Então, uma ou
um grupo de proteínas podem ser escritas como uma
seqüência de nucleotídeos e utilizadas como molde para
desenhar primers/probes. Nós denominamos estes primers de
guessmer.

- Transcrever proteínas em nucleotídeos é problemático e, ao


mesmo tempo, é o recurso disponível em alguns casos. Uma
vez que o código genético é degenerado, diferentes organismos
apresentam preferential biases no códon correntemente
usado, os quais podem ser usados para minimizá-los quando
da conversão da seqüência de aminoácidos na de nucleotídeos.
Guessmer
Estratégia:
• Transcrever proteínas em nucleotídeos usando o código
correspondente da tabela de códons. Identificar regiões 5’ e 3’
que apresentem a menor variabilidade possível.
• Design e match forward/reverse primers como visto
anteriormente.
•Os primers deverão possuir em torno de 30 bases de
comprimento em contrapartida das bases mismatched
reduzirem a especificidade na hibridização.
• Utilize elevada temperatura de anelamento para aumentar a
estringência do primer durante o pareamento.
Resumo ~ Primer Design
Avançado
Primers podem ser desenhados no intuito de serem empregados
com diferentes propósitos.
Primer universal, primer semi-universal e guessmers são alguns
deles.
Existem outras várias situações onde a experiência em primer
design são requeridas, tais como real-time PCR (PCR em tempo
real), estudo de polimorfismo em populações (microsatellite,
AFLP, SNP …), e internal probe design, dentre outros.

Entretanto, as regras básicas a serem sempre empregadas são:


Conseguir que a estabilidade e a especificidade na hibridização sejam
adequadas.