-1METHODES DETUDE DES ACIDES NUCLEIQUES 1.

Techniques dextraction et de purification

1.1. Prparation dextrait !r"t a#e$$"$aire 1.%. P"ri&i#ation par extra#tion p'no$-#'$oro&or(e 1.). Miniprparation de p$a (ide 1.*. Con#entration par pr#ipitation + $t'ano$ &roid en pr en#e de #ation 1.,. P"ri&i#ation par #entri&"-ation "r #'$or"re de # i"( 1.,.1. Sparation ADN . A/N 0 #entri&"-ation i op1#ni2"e "r -radient de #'$or"re de # i"( 1.,.%. Maxiprparation de p$a (ide par #entri&"-ation i op1#ni2"e "r #'$or"re de # i"( en pr en#e de 3ET 1.4. P"ri&i#ation par #'ro(ato-rap'ie 1.4.1. La #'ro(ato-rap'ie dad orption "r #o$onne de i$i#e 1.4.%. La #'ro(ato-rap'ie "r #o$onne d5#'an-e d5anion 1.4.). P"ri&i#ation de A/N (e a-er e"#ar1ote par #'ro(ato-rap'ie da&&init

2. Conservation des acides nucliques

%.1. Con er6ation de $ADN %.%. Con er6ation de $A/N

3. Quantification des acides nucliques

).1. A! orptio(trie U7 ).%. 8$"ori(trie ).). L5$e#trop'or9 e "r -e$ et #o$oration a" !ro("re d5t'idi"(

4. Mthodes dtude du gno e ! techniques de "ase

*.1. Le en:1(e de re tri#tion *.%. E$e#trop'or9 e 0 ana$1 e de &ra-(ent da#ide n"#$i2"e *.%.1. Prin#ipe -nra$ de $5$e#trop'or9 e ana$1ti2"e *.%.%. E$e#trop'or9 e en #'a(p p"$ ;P8<E= *.). L'1!ridation (o$#"$aire 0 #on#ept de !a e *.).1. D&inition ;'1!ridation et T(= *.).%. Condition de $'1!ridation (o$#"$aire *.).). Ca$#"$ de $a T( *.).*. Di&&rente (t'ode d'1!ridation 0 en (i$ie" $i2"ide> "r "pport o$ide> in it" *.*. La PC/ ? @ Polymerase Chaine Reaction A 0 a(p$i&i#ation de 2"en#e dADN *.,. Le 2"enBa-e de $ADN 0 dter(ination de $a 2"en#e d"n a#ide n"#$i2"e *.4. Le (t'ode de re#'er#'e de 2"en#e n"#$otidi2"e *.4.1. Le So"t'ern !$ot *.4.%. Le p"#e + ADN *.4.). Le dot !$ot

-%-

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1. Techniques dextraction et de purification

I$ exi te di&&rent proto#o$e expri(enta"x po"r extraire les acides nucliques> 2"i "i6ent approxi(ati6e(ent $e - e sch a de principe 0 - L1 e de #e$$"$e - E$i(ination de protine et de $ipide - E$i(ination d"n a#ide n"#$i2"e donn 0 en e&&et> "n @ extrait a#ide n"#$i2"e A !r"t #ontient en ($an-e A/N> ADN -no(i2"e et ADN p$a (idi2"e po"r $e !a#trie . I$ exi te a"Do"rd5'"i de .its co erciaux per(ettant de ra$i er rapide ent $extra#tion et $a p"ri&i#ation + $5aide de ractifs pr-ts / l0e ploi.

1.1. 1rparation dextraits "ruts acellulaires

L1 e de #e$$"$e Po"r l2ser $e #e$$"$e on pe"t "ti$i er oit "n s2st3 e "i6ant $e t1pe de #e$$"$e #on#ern. canique oit "n s2st3 e chi ique

,2se canique 0 Po"r $a $1 e (#ani2"e> on "ti$i e de pr&ren#e de thodes ou s2st3 es 2"i ne dnat"rent pa $5ADN> entendre qui ne 4 cassent 5 pas les olcules d)&+. I$ &a"t don# 2"e $a (t'ode "ti$i e ne -n9re pa trop de &or#e de #i ai$$e(ent 0 on utilise le choc ther ique 6c2cles de conglation7 dconglation8 ou le choc os otique. %n dlaisse les thodes dagitation 9 on dlaisse aussi le ploi des ultra:sons. Ce (t'ode ne ont pa adapte + $5extra#tion d5ADN + partir de #e$$"$e pro#ar1ote . En e&&et> $e traite(ent (#ani2"e "ti$i po"r #a er de #e$$"$e pro#ar1ote doi6ent Ptre !ea"#o"p p$" dra#onien 2"e #e"x "ti$i po"r $e #e$$"$e e"#ar1ote ;pre e de 8ren#'> !ro1e"r + !i$$e> Q= 0 $e !a#trie > #e$$"$e de petite tai$$e pe"6ent e -$i er entre $e &ai #ea"x de &or#e de #i ai$$e(ent et ont don# par&oi tr9 di&&i#i$e + $1 er (#ani2"e(ent. Le traite(ent (#ani2"e e(p$o1 po"r $e pro#ar1ote ont don# trop dnat"rant po"r $5ADN. La l2se canique est prfrentielle ent rserve aux cellules eucar2otes. ,2se chi ique 0
1our les cellules procar2otes on prfrera une l2se chi ique.

R 8ra-i$i ation en:1(ati2"e de paroi de #e$$"$e !a#trienne > 6-ta$e et &on-i2"e La paroi e t "n o! ta#$e (aDe"r + $a $1 e #e$$"$aire. Po"r rendre e&&i#a#e $a d or-ani ation de $a (e(!rane p$a (i2"e> de '1dro$a e p#i&i2"e pe"6ent Ptre e(p$o1e 0

-)%rganis e T2pe de paroi #n=2 e ;actrie Cha pignon Peptido-$1#anne C'itine L1 o:1(e C'itina e <gtaux Ce$$"$o e>H(i#e$$"$o e> Pe#tine Ce$$"$a e> H(i#e$$"$a e> Pe#tina e

Ce traite(ent #re de !r9#'e dan $a paroi. A6e# $a perte de protection assure par la paroi contre la forte pression os otique intracellulaire > $a cellule gonfle ;a&&$"x dea" 6er $intrie"r de $a #e$$"$e= D" 2"+ rupture de la e "rane plas ique. R On ra$i era o!$i-atoire(ent "ne $1 e #'i(i2"e po"r extraire $e#ti6e(ent $e p$a (ide de !a#trie > 6oir p$" tard $a de #ription d" proto#o$e de (iniprparation de p$a (ide . Le #ondition de #ette $1 e #'i(i2"e per(ettent de r#"prer dan $e $1 at "ni2"e(ent $e p$a (ide an $ADN -no(i2"e> on par$e a$or de $1 at #$air. Po"r arri6er + #ette extra#tion $e#ti6e $a $1 e #'i(i2"e e t o!$i-atoire> $a $1 e (#ani2"e ne per(et do!tenir 2""n $1 at !r"t #5e t-+-dire 2"i #ontient + $a &oi ADN -no(i2"e et p$a (ide . R D or-ani ation de (e(!rane par de dter-ent et o$"!i$i ation de $ipide (e(!ranaire Sodi"( Dod#1$ S"$&ate ;'&'= appe$ a" i $a"r1$ "$&ate de odi"(> triton >1??> ar#o 1$ ont de dtergents qui vont solu"iliser les lipides e "ranaires sous for e de icelles. Ce$a per(et de #rer de pore (e(!ranaire "&&i a((ent $ar-e po"r $i!rer $e #onten" d" #1top$a (e 'or de #e$$"$e . S"i6ant $e"r &or#e ;#'ar- o" pa => $e dtergents vont aussi plus ou oins dnaturer les protines e "ranaires. La dnat"ration de protine de $a (e(!rane p$a (i2"e #ontri!"e -a$e(ent + $a $1 e de $a #e$$"$e. E$i(ination de protine Cette tape sera tr3s i portante pour lli ination des histones eucar2otes. On pe"t pro#der de de"x &aBon di&&rente .
&protinisation par h2drol2se en=2 atique 0

E$$e e t ra$i e en &ai ant a-ir "ne endoprotase non spcifique #o((e $a protinase @> a#ti6e D" 2"+ 4,SC #e t don# "ne en:1(e tr9 ta!$e. Cette di-e tion e t souvent conduite en prsence d"n dtergent dnaturant co e le '&'. Le SDS> en p$" de o$"!i$i er $e $ipide et #ontri!"er + $a $1 e de $a #e$$"$e> facilite laction de la protinase @ car il dploie la chaAne protique. 1rcipitation des protines en utilisant un agent chaotropique 0
On par$e a" i de dprotini ation par dfcation.

Un a-ent #'aotropi2"e est un sel 6donc des ions8 qui odifie la solu"ilit des olcules 6protines ou acides nucliques8 et 2"i pe"t provoquer leur prcipitation. Certains sont dnaturants dautres pas. Lagent chaotropique peut agir de plusieurs faBons 0 - +eutraliser certaines charges ioniques requises en surface pour le aintien de la solu"ilit. - *nterfrer dans les interactions que les protines ta"lissent avec leau et odifier la solu"ilit des protines. La-ent #'aotropi2"e entre en #o(ptition a6e# $a protine po"r ta!$ir de intera#tion a6e# $e (o$#"$e dea" di poni!$e dan $a o$"tion. Lea" en e $iant + $a-ent #'aotropi2"e pri6e $a protine de (o$#"$e dea" 2"i $'1drataient ;$a o$6ataient=> $a protine ort a$or de $a o$"tion et pr#ipite. - po"r #ertain > i$ pe"t a" i dnaturer les protines> on $e 2"a$i&ie a$or de dnaturant prcipitant. Par exe(p$e po"r $e protine > i$ pro6o2"e $a rupture des liaisons h2drog3nes qui aintiennent leur structure tertiaire entraTnant ain i $e d asquage de leurs rgions h2dropho"es. Le rgions h2dropho"es ont tendance / sagrger et les protines prcipitent ;d&#ation=. On pe"t #iter #o((e a-ent #'aotropi2"e 0

-*de agents chaotropiques qui ne dnaturent pas les protines 0 $e chlorure de sodiu 6+aCl8 / forte concentration et $e sulfate da oniu > 2"i $"i e t $ar-e(ent "ti$i dan $a p"ri&i#ation de protine U - des agents chaotropiques dnaturant po"r $e protine C le perchlorate de sodiu ;NaC$O*=> $e thioc2anate de guanidine ;TC<=> $iodure de sodiu ;NaI= et $e chlorure de lithiu . Le a-ent #'aotropi2"e les plus utiliss ont $e thioc2anate de guanidine ;<TC= et $iodure de sodiu ;NaI=. En e&&et> #e agents chaotropiques par leur action dnaturante "r $e protine assurent deux fonctions / la fois 0 - di $o2"er $e (e(!rane de ti " en a-i ant "r $e protine (e(!ranaire et #ond"ire don# + $a l2se des cellules U - et li iner les protines en provoquant leur prcipitation. Apr9 #entri&"-ation> i$ re te pe" de protine dan $e "rna-eant 2"i #ontient> $"i> to" $e a#ide n"#$i2"e . /a#ti& di6er aDo"t a" ta(pon dextra#tion N3 0 Lor 2"on "ti$i e $e a-ent #'aotropi2"e po"r $i(iner $e protine par pr#ipitation> on aDo"te 2"e$2"e &oi dan $e ta(pon dextra#tion de thiols po"r e p-cher la refor ation de ponts disulfures des protines qui restent ainsi / ltat dnatur. N3 0 Une forte concentration saline ;NaC$ K>1, M= d" (i$ie" dextra#tion e(pP#'e $a paration de de"x !rin de $ADN en &or(ant "n cran protecteur de contre:ions autour de la dou"le hlice ! $e ion NaV a o#ient a6e# $e -ro"pe(ent p'o p'ate PO*-> $e ne"tra$i ent et di(in"ent $e &or#e de rp"$ ion 2"i exer#ent entre $e de"x !rin de (P(e #'ar-e $e#tri2"e> $e ion Na> $e ion NaV ta!i$i ent ain i $a tr"#t"re en do"!$e '$i#e. Le citrate de sodiu et lactate de sodiu a" i "ti$i dan $e ta(pon dextra#tion Do"ent $e (P(e rDle E sta"iliser l)&+ natif c0est:/:dire sous sa for e "icatnaire. N.3. 0 Le ta(pon #ontient o"6ent "ne "! tan#e #'$atri#e te$$e 2"e $#&T) 2"i 2"e tre par #o(p$exation $e ion di6a$ent o" $e citrate 2"i po 9de ) -ro"pe(ent #ar!ox1$e 2"i i$ ont #'ar- COO- pi9-ent $e ion po iti& . Ce de"x ra#ti& ont "ti$i po"r pi-er nota((ent $e agnsiu C cofacteur des &+ases et F+ases a&in de ieux prserver les acides nucliques par inhi"ition des nuclases. E$i(ination de A/N $or de $extra#tion de $ADN Le extrait a#e$$"$aire !r"t #ontiennent $e de"x t1pe da#ide n"#$i2"e 0 ADN et A/N. On pe"t '1dro$1 er $e A/N de de"x &aBon> par 0 - $2drol2se chi ique a6e# +a%$. A p$ alcalin l)F+ est h2drol2s et pas l)&+ 2"i e t prot- de $a $1 e a$#a$ine par $a! en#e de -ro"pe(ent '1drox1$e en % "r $e d ox1ri!o e ;voir cours structure des acides nucliques=. - Mai on pr&9re o"6ent oprer par digestion en=2 atique. Po"r di(in"er $a #on#entration en A/N par di-e tion + $a /Na e> on "ti$i e "ne F+ase 4 DNase free 5> #5e t+-dire dpo"r6"e da#ti6it DNa e U po"r #e$a $e DNa e #onta(inant 6ent"e$$e(ent $e prparation de /Na e d" #o((er#e ont dnat"re par "n #'a"&&a-e ;par exe(p$e , (in + 1KKSC= a"2"e$ r i te $a F+aseC en=2 e particuli3re ent ther osta"le. La /Na e e t souvent apporte d3s le d"ut de lextraction:purification grGce / sa grande sta"ilit. -

1.2. 1urification par extraction phnol:chlorofor e

-,W 1rincipe de la thode dextraction ! $e (t'ode "ti$i ent $a o$"!i$it di&&rentie$$e de (o$#"$e ;a#ide n"#$i2"e . #onta(inant #o((e $e protine et $e $ipide = entre de"x p'a e non (i #i!$e . W #n pratique ! on ($an-e 6i-o"re" e(ent $a o$"tion d5a#ide n"#$i2"e en p'a e a2"e" e + "ne p'a e non (i #i!$e '1drop'o!e. Apr9 #entri&"-ation> on r#"p9re $a p'a e a2"e" e #ontenant $e a#ide n"#$i2"e + $a pipette ;p'a e a2"e" e ? p'a e "prie"re=. W &eux extractions successives 2"i e di tin-"ent e$on $a p'a e non (i #i!$e 0 R l'extraction phnolique 0 e$$e e t "ti$i e po"r d!arra er $e a#ide n"#$i2"e de protine #ar $e phnol est un dprotinisant puissant. Le protines prcipitent> e$$e di(entent a" &ond de $a p'a e a2"e" e (ai et e$$e restent / linterface #5e t-+-dire 2"e$$e re tent + $a "r&a#e de $a p'a e p'no$i2"e 2"i e t "ne p'a e '1drop'o!e. Le d"ris e "ranaire lipidiques vont aller dans la phase phnol h2dropho"e. Le p'no$ doit Ptre tr9 p"r et at"r en ta(pon ;pH X po"r extraire $ADN=. Lin#on6nient d" phnol r ide dan on caract3re tr3s corrosif> #e t don# "n prod"it / anipuler avec prcaution. R l'extraction au chloroforme 0 e$$e #o(p$9te to"Do"r $5extra#tion pr#dente po"r $i(iner to"te tra#e de p'no$ a2"e"x. To"te tra#e de p'no$ doit Ptre $i(ine po"r per(ettre $a#tion "$trie"re den:1(e ;de re tri#tion par exe(p$e= "r $a#ide n"#$i2"e extrait. Le #'$oro&or(e e t additionn dalcool isoa 2lique ;AIA ? )-(t'1$-1-!"tano$ ? ;CH)=%CHCH%CH%OH= 2"i e t "n agent anti: ousse sta"ilisant la sparation des phases ;a-ent d ta!i$i ant de $("$ ion=. N3 0 ,ors de la prparation dun extrait )&+C lli ination de l)F+ peut -tre effectu / la fin ou avant ltape phnolique. Si$ e t e&&e#t" apr9 $tape p'no$i2"e> #e traite(ent doit Ptre "i6i d"ne de"xi9(e dprotini ation a&in d$i(iner $a /Na e r id"e$$e. Fe arque ! ,extraction phnol:chlorofor e applique / la purification de l)F+ E extraction phnol acide:chlorofor e Lextra#tion de A/N n#e ite de prendre de prcautions particuli3res 0 port de -ant > (atrie$ et ra#ti& + " a-e "ni2"e trait an ri!on"#$a e . Ce pr#a"tion ont (i e en p$a#e po"r re(dier + $a pr en#e de ri!on"#$a e "r $a pea" et + $exi ten#e de ti " nat"re$$e(ent enri#'i en ri!on"#$a e ;pan#ra par exe(p$e=. Lextraction des )F+ est don# plus dlicate que celle de l)&+ #ar $e )F+ sont tr3s sensi"les / laction des F+ases quiC de $e"r #Ot> sont des en=2 es tr3s sta"les et 2"i don#> (P(e i e$$e ont pr ente en petite 2"antit> ra$i eront $a d-radation de A/N. Lextra#tion d!"te par "ne $1 e #e$$"$aire o" ti "$aire en prsence dagent chaotropique> isothioc2anate de guanidine ou de chlorure de lithiu C $a-ent #'aotropi2"e e t "ti$i po"r dnaturer les F+ases endog3nes. On 1 aDo"te o"6ent "n inhi"iteur de ri"onulases #o((e $e : ercaptothanol 6HOCH%CH%SH= 2"i e t "n agent rducteur et 2"i 6a ro(pre $e pont di "$&"re dnat"rant ain i $e ri!on"#$a e . (Il est communment employ pour rduire les ponts disulfures prsents dans les protines et peut jouer un rle d'antioxydant biolo ique!" La $1 e e t en "ite "i6ie par "ne extraction en phnol acide. Le p'no$ "ti$i e t "n phnol acide #5e t-+-dire 2"i$ a t (i en o$"tion et 2"i$i!r a6e# "n ta(pon de pH a#ide ;pH ,=. Dan #e #ondition $e protines histonesC riches en acides a ins "asiques 6portant dans leur radical un groupe ent +$28C vont avoir / p$ acide une forte charge positive 6cf. +$ 3V=C elles vont alors sassocier plus forte ent / l)&+ gno ique charg ngative ent et vont lentraAner avec elles lors de leur prcipitation. Ain i $ADN et $e protine 2"i ont pr#ipit re tent + $a "r&a#e de $a p'a e p'no$i2"e et ont ain i ra e(!$ + $inter&a#e. La p'a e a2"e" e ; "prie"re= #ontiendra en o$"tion $e A/N d!arra de $ADN. La p'a e p'no$i2"e ;in&rie"re= #ontiendra $e $ipide .

#oir planche

-4N3 0 Da"tre te#'ni2"e rapide ont t $a!ore an $"ti$i ation d" p'no$ a#ide-#'$oro&or(e 0 p"ri&i#ation "r (ini-#o$onne #ontenant "ne (e(!rane de -e$ de i$i#e pr entant "ne a&&init po"r $e A/N a6e# $i(ination de ADN par $e(p$oi d"ne DNA e. (#oir article #$R bio%ar&e '(()!

1.3. Miniprparation de plas ides

La prparation d5ADN p$a (idi2"e + partir de !a#trie e t $5"ne de te#'ni2"e $e p$" #o"rante de $a !io$o-ie (o$#"$aire> -a$e(ent #onn"e o" $e no( a!r- de (iniprep. Le prin#ipe de $5extra#tion e t #onn" o" $e no( de l2se alcaline. Cette (t'ode per(et de prparer $e#ti6e(ent $5ADN d" p$a (ide #onten" dan $e !a#trie > to"t en $i(inant $5ADN d" #'ro(o o(e !a#trien. Le prin#ipe de #ette (t'ode #on i te e&&e#t"er $a $1 e de #e$$"$e a" (o1en d5"n dtergent ? SDS ;dod#1$ "$&ate de odi"(= en prsence de soude> + pH 1). A #e p$ tr3s alcalinC l0)&+ est dnatur> #e t-+-dire 2"e $e de"x !rin de $a do"!$e-'$i#e ont par . En e&&et> $e -ro"pe(ent p'o p'ate ont to" #'ar- n-ati6e(ent + pH !a i2"e et $e &or#e de rp"$ ion entre $e de"x !rin ont + $e"r (axi("(. On ne"tra$i e en "ite rapide(ent $a o$"tion> #e 2"i pro6o2"e $a renat"ration !r"ta$e ;rapparie(ent de !rin d" d"p$ex d5ADN=. L5ADN #'ro(o o(i2"e> tr9 $on- ;2"e$2"e M-a ;1K4= paire de !a e=> ne par6ient pa + e rapparier #o(p$9te(ent et &or(e de en#'e6Ptre(ent in o$"!$e . L5ADN p$a (idi2"e> #o"rt ;Y1KZ paire de !a e=> par6ient + e re&or(er et re te en o$"tion. On pare a$or $e e p9#e par #entri&"-ation. Le protine pr#ipite > ont -a$e(ent $i(ine a6e# $e dter-ent et $5ADN #'ro(o o(i2"e. Cette solution ne contenant que tr3s peu d)&+ chro oso ique et de protines est appele l2sat clair. L5ADN p$a (idi2"e e t en "ite #on#entr par pr#ipitation + $5a$#oo$.

1.4. Concentration par prcipitation / lthanol froid en prsence de cations 6effet cran8
W Pr#ipitation + $a$#oo$ t'1$i2"e 0 - A6ant $aDo"t d" o$6ant a$#oo$ i$ e t i(prati& daDo"ter> + $a o$"tion da#ide n"#$i2"e > "ne quantit i portante de cations ;apport NaV o" &or(e NaC$=> on tra6ai$$e / haute force ionique 6+aCl 3 M8. Le #ation +aH neutralisent les groupe ents 1%4: rparti to"t $e $on- de $ADN o" de $A/N et &or(ent "n cran protecteur de contre:ions autour de la dou"le hliceC $a#ide n"#$i2"e devient oins solu"le #ar i$ ta"lit oins dinteractions avec leau> i$ e t (oin '1drat ? o$6at on d i-ne #ette it"ation par $appe$$ation @ effet cran A. - La prcipitation est ralise par addition de $thanol oins polaire que leau. I$ &a"t aIouter / un volu e de solutionC au oins deux volu es dethanol. - On r#"p9re $e a#ide n"#$i2"e o" &or(e o$ide apr9 centrifugation. - Le prcipit est lav avec de l0thanol / J? K po"r e d!arra er de e$ 2"i pa ent en o$"tion dan $e )K J de $a p'a e a2"e" e de $t'ano$ de $a6a-e. - P"i $e pr#ipit e t #'. Le schage est o"ligatoire po"r li iner lthanol qui pourrait e p-cher la dissolution ultrieure du prcipit. - Apr9 $e #'a-e o!$i-atoire> $e a#ide n"#$i2"e po"rront Ptre resolu"iliss dans un ta pon adquat ; o"6ent ta(pon TE ? Tri -EDTA pH X=. W Pr#ipitation + $5i opropano$ 0 Le prin#ipe e t $e (P(e 2"e pr#de((ent a"& 2"e $e sel n0est pas ncessaire et 2"e $e petits frag ents d0)&+ sont li ins car non prcipits. Dan #e #a > on pro#9de + "n lange volu e / volu e. Le prcipit era -a$e(ent lav pour li iner les traces d0isopropanol p"i sch.

-I-

#oir planche
N3 0 ,)&+ gno ique tant de 'a"t poid (o$#"$aire> i$ peut for er de tr3s longues fi"res 2"i e rpandent dan $t'ano$ de (ani9re pe#ta#"$aire ;@ (d" e A dADN=. On "ti$i e laffinit de l)&+ pour la silice 0 voir plus loin purification de l*+,- par chromato raphie sur colonne de silice= po"r enrouler ces fi"res sur une "aguette de verre . En enro"$ant $e &i!re de $ADN a"to"r de $a !a-"ette de 6erre> "ne grande partie de l)F+ peut -tre li ine / ce stade #ar $e olcules d)F+C petites olculesC ne senroulent que tr3s peu.

1.L. 1urification par centrifugation sur chlorure de csiu

1.L.1. 'paration )&+7)F+ par centrifugation isop2cnique sur gradient de chlorure de csiu
Une o$"tion de #'$or"re de # i"( ;C C$= de den it donne sou ise / une force de gravit intense for e spontan ent un gradient de densit continu. La r o$"tion de te$ -radient atteint $e #enti9(e d5"nit de den it. ,es olcules aIoutes / la solution de ClCs vont se placerC au cours de la igrationC dans la =one du gradient dont la densit est la - e que la leur. Do[ $appellation isop2cnique d" -re# iso ? -a$ et pu&nos ? den e. Cette te#'ni2"e per et de distinguer l)&+ natif c0est:/:dire dou"le "rin de l)&+ dnatur 6si ple "rin8 et de l)F+ 6lui aussi onocatnaire8. En e&&et> i$ 1a de liaisons possi"les entre des groupe ents ioniss de lintrieur de la olcule d)&+ et le chlorure de csiu qui est lui aussi charg 6CsH8. I$ 1 a da6anta-e de $iai on 2"i ta!$i ent 2"and $ADN e t dnat"r o" a6e# $A/N #ar i$ 1 a da6anta-e de -ro"pe(ent ioni $i!re po"r &ixer $e ion C V. Don# en pr en#e de #'$or"re de # i"(> $)&+ dnatur ou l)F+ seront plus denses que l)&+ natif. ,a prsence de ClCs provoque ainsi la fixation diffrentielle d0ions CsH sur ces acro olcules et leur densit apparente est alors odifie 0 protine ? 1>)-.($ A/N ? 1>I,1>XF-.($ ADN ? 1>4-1>IF-.($. Ce (a#ro(o$#"$e ont a$or ai (ent pare $or de $a #entri&"-ation. Ce t1pe d5"$tra#entri&"-ation e t tr9 r o$"ti& (ai d5"n (anie(ent d$i#at. #oir planche Fe arque ! 1urification de l)F+ par centrifugation sur coussin de chlorure de csiu Lextra#tion dA/N e t "n "Det p$" #o(p$exe #ar $e ri"onuclotides sont des olcules tr3s vulnra"lesC facile ent dgrades. E$$e ont en e&&et tr3s sensi"les aux ri"onuclases ;/NA e = qui elles sont tr3s sta"les> #e 2"i i(po e de prendre des prcautions particuli3res a" i !ien dan $e re#"ei$ et $a #on er6ation de #'anti$$on 2"e dan $a (i e en \"6re de pro#d"re dextra#tion. Le ti " o" $e #e$$"$e > &rai o" #on-e$ dan $a:ote $i2"ide> ont 'o(o-ni $e p$" rapide(ent po i!$e dan "n ta pon qui doit inhi"er tr3s forte ent les F+ases endog3nes et dissocier les protines des acides nucliques. Le ta(pon #ontient en -nra$ 0 - "n dtergent ;SDS=> - "n a-ent di o#iant dit en#ore agent chaotropique> $e t'io#1anate de -"anidine> 2"i pr#ipe $e protine et in'i!e en (P(e te(p $e /Na e >

-X- et "n agent rducteur> $e %-(er#aptot'ano$ o" $e dit'iot'rito$> #e ont de in'i!ite"r de /Na e o" de en:1(e en -nra$ #ar i$ '1dro$1 ent $e pont di "$&"re pr ent dan $e protine et pro6o2"e ain i $e"r dnat"ration ;pont di "$&"re ? $iai on #o6a$ente ta!$ie entre de"x a#ide a(in o"&r #1 tine o" (t'ionine 0 S-S de6ient SH V SH o" $a#tion de $a-ent rd"#te"r=. ,)F+ onocatnaire lie davantage de olcules de chlorure de csiu que l)&+ gno ique "icatnaireC l)F+ prsente alors une densit suprieure. En rai on de a den it> e"$ $A/N pe"t tra6er er $e #o" in de C C$ et Ptre r#"pr dan $e #"$ot. L5A/N e t en "ite $a6 dan $5a#tate de odi"( et pr#ipit + $5a$#oo$.

#oir planche 1.L.2. Maxiprparation de plas ides par centrifugation isop2cnique sur gradient de chlorure de csiu en prsence de ;#T
La (t'ode traditionne$$e de p"ri&i#ation en axiprparation e t $a centrifugation isop2cnique en gradient de chlorure de csiu et en prsence de "ro ure dthidiu 6;#T8 saturant. Lor de $extra#tion de a#ide n"#$i2"e > $e chro oso e tr3s grand est 4 cass 5 et $e frag ents linaires prennent une for e relGche> $e plas ides "eaucoup plus petits sont prservs et conservent une structure surenroule. Le 3ET sintercale entre les "ases de l)&+> on in#orporation all3ge la acro olcule. De"x rai on + #et a!ai e(ent de den it de $ADN a o#i a" 3ET 0 - $e 3ET e t "ne (o$#"$e pe" den e U - en inter#a$ant $e 3ET 6a pro6o2"er "ne a"-(entation d" 6o$"(e o##"p par $a (o$#"$e dADN (ai $a (a e de #e dernier e t pe" (odi&ie don# $a den it de $a (o$#"$e dADN e t di(in"e ;$e ./0 a it comme s*il faisait 1 onfler 2 l*+,-=. Le 3ET sintercale entre les "ases de l)&+ en proportions diffrentes selon le t2pe d)&+ 0 - $e &ra-(ent $inaire de $ADN #'ro(o o(i2"e in#orporent !ea"#o"p de 3ET U - $ADN p$a (idi2"e "renro"$ nin#orpore a" #ontraire 2"e pe" de 3ET. Le ions csiu 6CsH8 interagissent gale ent avec les acides nucliques. Le di&&rente intera#tion ta!$ie et $e"r #on 2"en#e "r $a den it de (a#ro(o$#"$e n"#$i2"e ont $e "i6ante 0 - LADN #'ro(o o(i2"e ta!$it a$or de $iai on a6e# $e ion C e"$e(ent a" ni6ea" de -ro"pe(ent ioni externe > par #ontre i$ ta!$it !ea"#o"p de $iai on a6e# $e 3ET> i$ e t a$$-. - LADN p$a (idi2"e ta!$it $"i a" i de $iai on a6e# $e ion C e"$e(ent a" ni6ea" de -ro"pe(ent ioni externe > par #ontre i$ ta!$it pe" de $iai on a6e# $e 3ET en rai on de a #on&i-"ration "renro"$e> i$ ne t pa a$$-. - LA/N nta!$it pa de $iai on a6e# $e 3ET #ar i$ e t (ono#atnaire> par #ontre i$ ta!$it !ea"#o"p de $iai on a6e# $e ion C > #ar to" $e -ro"pe(ent ioni ont a##e i!$e > #e 2"i> en rai on de $a den it de ion # i"(> $a$o"rdit. I$ en r "$te 2"e $)&+ plas idique est alors nette ent plus dense que l)&+ chro oso ique en condition saturante de ;#T. L5e(p$oi de "ro ure d0thidiu per et donc d0aug enter la diffrence de densit entre l0)&+ super:enroul et l0)&+ relach7linaire et d5o!tenir "ne sparation opti ale. Le $1 at #$air e t o"(i + "ne "$tra#entri&"-ation 0 par exe(p$e *X 'e"re + 1,K KKK x-.

-F-

In#on6nient 0 La te#'ni2"e e t lourde / ettre en Muvre et n#e ite par ai$$e"r "ne ultracentrifugeuse extr- e ent coNteuse. Cette te#'ni2"e ne t pa d" to"t adapte + $a ro"tine. La te#'ni2"e ne t 6ide((ent pas auto atisa"le. De p$" > $e agents chi iques utiliss sont toxiques. Lli ination du ;#T est dlicate ;extra#tion a" !"tano$=. Po"r li iner les ions csiu on ralise une dial2se a" tra6er d"ne (e(!rane per(a!$e + $ea" et a"x ion #ontre "n -ro 6o$"(e de ta(pon.

1.O. 1urification par chro atographie

Le de"x te#'ni2"e > chro atographie sur colonne de silice et chro atographie sur colonne dchange danionsC ont $e de"x te#'ni2"e $e p$" e(p$o1e po"r p"ri&ier $e a#ide n"#$i2"e . Un grand no "re de .its co erciaux 2"i propo ent di&&rente 6ariante o" a($ioration de (t'ode d#rite pr#de((ent contiennent souvent de petites colonnes de r ine chro atographique #'an-e" e d5anion o" de i$i#e> per ettant d0a liorer la puret. La #'ro(ato-rap'ie "r #o$onne (et en \"6re , tapes 0 1. 2"i$i!ration de $a #o$onne tra6ai$ en ta(pon et &or#e ioni2"e ad2"at %. &ixation de $a (o$#"$e + p"ri&ier ). $a6a-e de $a #o$onne on $i(ine #e 2"i ne t pa &ix *. $"tion on d#ro#'e #e 2"i a t &ix ,. r-nration reto"r tat dpart de $a #o$onne o" ta(pon de #on er6ation

1.O.1. ,a chro atographie dadsorption sur colonne de silice

Cette te#'ni2"e e t a#t"e$$e(ent $ar-e(ent "ti$i e et de ]it dextra#tion !a propo par de no(!re"x &o"rni e"r > adapt + de no(!re"x #'anti$$on . "r #e prin#ipe ont

R Le "pport 0 La i$i#e e t "n #o(po #'i(i2"e ;diox1de de i$i#i"(= et "n (inra$ de &or("$e SiO%. Le gel de silice e t "n pol2 3re d0acide silicique 'i6%$84 prpar + partir de i$i#ate de odi"(. E$$e e di o"t dan $5ea" o" $a &or(e de Si;OH=*> $5a#ide i$i#i2"e ;a#ide &ai!$e=> $a $i(ite de o$"!i$it tant de K>1*K -.$ + %,SC. S"r&a#e d" -e$ de i$i#e e# et '1drat

- 1K R Le intera#tion 0 I$ a-it d"ne chro atographie par adsorption. La fixation de l)&+ sur la silice &ait inter6enir de interactions dipDle:dipDle ;interaction h2drog3ne=. R Le tape de $a #'ro(ato-rap'ie 0 Ladsorption slective da#ide n"#$i2"e "r (e(!rane de -e$ de i$i#e ne t o!ten"e 2"e i $on tra6ai$$e dan $e #ondition "i6ante 0 - en prsence de concentrations leves dagents chaotropiques o" par exe(p$e / force ionique leve ;^NaC$_ $e6e=C - et en pr en#e dalcool. La-ent #'aotropi2"e inter6ient #o((e #o(ptite"r dan $e re$ation 2"e $ADN ta!$it a6e# $ea". La-ent #'aotropi2"e e $ie + $ea" et $ADN de6ient (oin '1drat. LADN ta!$it a$or de $iai on a6e# $a i$i#e et e &ixe a" "pport de $a #o$onne. La #o$onne e t $a6 par de $t'ano$> o$6ant (oin po$aire 2"e $ea" 2"i ne ri 2"e pa de d#ro#'er $ADN. ,)&+ est lu par un ta pon / "asse force ionique. On pe"t "ti$i er "n ta(pon a6e# "ne &ai!$e #on#entration en e$ o" de $ea" p"re> $ADN 6a + no"6ea" ta!$ir de $iai on a6e# $ea"> '1drater et repa er en o$"tion. 1 et % ont ra$i e + force ionique leve 0 on ne"tra$i e $e -ro"pe(ent p'o p'ate PO*- de $ADN a6e# NaV ;i$ de6ient (oin o$"!$e=. ) $a #o$onne e t $a6e en pr en#e dthanol 2"i e t "n o$6ant (oin po$aire 2"e $ea" ;$ADN ne repa e pa en o$"tion= * et , on "ti$i e de $ea" o" "n ta(pon de force ionique tr3s fai"le ;exe(p$e a6e# de $EDTA=

#oir planche
R La i$i#e pe"t Ptre propo e o" &or(e de -e$ "r #o$onne o" o" &or(e de !i$$e 0 - Dan $e #a d"ne colonne> $a paration e t e&&e#t"e par centrifugation. Ce pro#d e t !a "r $e(p$oi de petite #o$onne adapte + de t"!e de 1>, + % (L ;t"!e ependor&&=. - Si$ a-it de "illes> #e ont de !i$$e para agntiques re#o"6erte de i$i#e 2"i ont "ti$i e et $a paration era e&&e#t"e + $aide d"n dispositif ai ant. R A6anta-e 0 - Pa "ti$i ation de "! tan#e toxi2"e i NaC$ e(p$o1. - I$ ne t pa n#e aire de pro#der + "ne pr#ipitation a$#oo$i2"e #ar $ADN o!ten" e t de !onne 2"a$it et don# prPt + $e(p$oi. - La (t'ode e t rapide et app$i2"e + to"te orte de p#i(en . - LADN o!ten" + "ne tai$$e de $ordre de %K-)K ]! po"6ant a$$er D" 2"+ ,K ]!. R In#on6nient 0 On ne pe"t don# o!tenir par #ette te#'ni2"e $e &ra-(ent "prie"r + ,K ]! n#e aire a"x exprien#e de blottin o" de #$ona-e.

1.O.2. ,a chro atographie sur colonne changeuse danions

R Le "pport 0 Un #'an-e"r d5anion de t2pe &#)# cellulose o" 2"i6a$ent . La dit'1$a(inot'1$-#e$$"$o e ;DEAE-#e$$"$o e= e t "n "pport #'an-e"r d5anion > o!ten" en "! tit"ant $a #e$$"$o e ;#e$$"$o e ? po$1(9re de (o$#"$e de -$"#o e $ie en 1-*= par de -ro"pe(ent dit'1$a(inot'1$ 0

- 11 -

Le DEAE e t "n #'an-e"r &ai!$e> po dant de -ro"pe(ent i " d"ne !a e o" d"n a#ide &ai!$e> de &aBon + #e 2"e $e "pport oit o" &or(e ioni e o" ne"tre. Un #'an-e"r danion de t2pe Q:sepharose 2"i co porte lion a oniu quaternaire F4+H ;d i-n par $a $ettre Q= ? "n ato(e da:ote portant "ne #'ar-e po iti6e et dont $e * 6a$en#e ont o##"pe #'a#"ne par "n radi#a$ /. La((oni"( 2"aternaire e t "n #'an-e"r &ort i " d"ne !a e o" d"n a#ide &ort 2"i e t don# to"t $e te(p ioni . 3e el 45epharose64 est constitu de cha7nes d'a arose" Chaque cha7ne8 de masse molaire d'environ 9'("((( ,a8 est un polym:re d'un diholoside dont le motif est prsent ci;contre"

R Le intera#tion 0 La #'ro(ato-rap'ie par #'an-e danion e t !a e "r $interaction entre les charges ngatives des groupe ents phosphate de l)&+ et les charges positives du support de chro atographie. Apr9 change de lion 6avec Cl: par exe ple8> $a rtention de $ADN &ait inter6enir de interactions ioniques. R Le tape de $a #'ro(ato-rap'ie 0 Le dpDt du l2sat "r $a #o$onne de #'ro(ato-rap'ie e t ra$i dan de #ondition de "asse concentration en selsC on 6e"t 2"e $ADN expo e de no(!re" e #'ar-e n-ati6e #5e t-+-dire 2"e $e -ro"pe(ent p'o p'ate ne oient pa ne"tra$i par de ion po iti& #onten" dan $e ta(pon. ,)&+ se fixe / la colonne / laide de liaisons ioniques. En "ite> $e protine > $e d!ri #e$$"$aire et $e a"tre (o$#"$e en o$"tion ont $i(in par $a6a-e + $aide d"n ta(pon (o1ennent #'ar- en e$ . L)&+ est finale ent lu + $aide d"n ta pon / haute force ionique 6 o$"tion #on#entre de NaC$=. A&in d$i(iner $e e$ > $ADN e t pr#ipit par de $a$#oo$. 1 et % et ) ont ra$i e + force ionique "asse ou o2enne * et , ont ra$i e + force ionique leve ;$"tion par #o(ptition a6e# NaC$= R A6anta-e 0 - A"#"ne "! tan#e toxi2"e ne t "ti$i e 0 intrPt po"r "ne prparation ADN en 6"e d"ne t'rapie -ni2"e par exe(p$e. - LADN i o$ d"ne tai$$e de ,K-1KK ]! en (o1enne pe"t atteindre 1,K ]!.

1.O.3. ,a purification des )F+ daffinit

essagers eucar2otes par chro atographie

La #'ro(ato-rap'ie da&&init (et en \"6re "n ligand spcifique. #oir planche La p$"part de )F+ eucar2otes poss3dent une queue pol26)8 en 3 den6iron "ne #entaine de n"#$otide . Cette tr"#t"re parti#"$i9re e t (i e + pro&it po"r $e p"ri&ier par "ne chro atographie daffinit. La p"ri&i#ation de $A/N po$1;A= e &ait par pa a-e "r "ne colonne oligo6dT8 0 o$i-o;dT= #e$$"$o e o" o$i-o;dT= &ix + de !i$$e (a-nti2"e .

- 1% -

2. Conservation des acides nucliques

2.1. Conservation de l)&+
L5ADN pe"t Ptre #on er6 dan "n ta pon 61? M Tris p$EP8 additionn d0#&T) 61 M8 / 4QC. - A pH X> $a d-radation de $5ADN e t nota!$e(ent p$" &ai!$e 2"5+ pH I. - L5EDTA per(et de #'$ater $e ion di6a$ent ;n#e aire de $e pi-er po"r ina#ti6er $e n"#$a e = et i$ 6itent a" i $a #roi an#e de (i#roor-ani (e . L5ADN pe"t Ptre gale ent conserv / :2?QC dans le - e ta pon (ai de c2cles successifs de conglation7dconglation entraAnent des cassures des acides nucliques de grande taille ;`1K]!=. Do[ $a n#e it de ra$i er de fractions aliquotes pour la conservation i n#e aire.

2.2. Conservation de l)F+

D" &ait de $a tr9 &ai!$e ta!i$it de A/N> $e chantillons sont stoc.s / :P?QC apr3s addition de 3 vol d0thanol. En $5a! en#e de e$ > i$ re tent en o$"tion. Une a$i2"ote repr entati6e pe"t Ptre pr$e6e apr9 a-itation p"i aD" te + K>)M d5a#tate de odi"( pH ,>% 2"i pro6o2"e $a pr#ipitation de $A/N !ri96e(ent + -%KSC et #o$$e#te par #entri&"-ation.

3. Quantification des acides nucliques

3.1. )"sorptio trie (< #oir planche
La 2"anti&i#ation e t e&&e#t"e par spectrophoto trie> $e "ases puriques et p2ri idiques a"sor"ant forte ent dans l0ultraviolet / 2O? n . R Corre pondan#e A%4K n( et #on#entration en a#ide n"#$i2"e La (e "re de $a! or!an#e + %4K n( e t "ne thode prcise si l0)&+ est pur et natif. Cette (t'ode e t peu sensi"le> et ne peut pas -tre utilise pour des concentrations infrieures / 2L? ng 7 , ;A%4K n( ? K>KK, UA=. Une "nit da! or!an#e + %4K n( ;DO $"e "r $e pe#trop'oto(9tre= #orre pond + 0 - "ne o$"tion d5ADN do"!$e !rin + ,K a-.(L - "ne o$"tion d5ADN i(p$e !rin + )I a-.(L - "ne o$"tion d5A/N + *K a-.(L Attention bbb Ces valeurs s0appliquent / des acides nucliques parfaite ent purs et en solution ho og3ne. Mai i$ e t rare(ent n#e aire d5e&&e#t"er "n do a-e tr9 pr#i et dan $a prati2"e "ne i(p$e e ti(ation de $a #on#entration "&&it. R /apport A%4K n( . A%XK n( et #ontrO$e de $a p"ret d5"ne o$"tion d5ADN Le protines a"sor"ent gale ent / %4K n( (ai $e"r (axi("( d5a! orption e it"e> $"i> + %XK n(. Ain i> $e rapport )2O? n 7 )2P? n #on tit"e "n o2en d0apprcier une ventuelle conta ination de la solution d0)&+ 0 - "n rapport #o(pri entre 1>X et % #orre pond + "ne o$"tion p"re d5ADN U - "n rapport in&rie"r + 1>I e t $e i-ne d5"ne #onta(ination par de protine U - "n rapport "prie"r + % e t $e i-ne d5"ne #onta(ination par $5A/N. - Une 6ent"e$$e #onta(ination par d" p'no$ pe"t Ptre re#'er#'e en (e "rant $5a! orption + %IK n( ;rarement pratiqu=. N3 0 A (ettre en re$ation a6e# $e &ait 2"e A/N et ADN ! a! or!ent p$" + %4K n( 2"e ADNd! ;e&&et '1per#'ro(e= et a6e# $e &ait 2"e $e a#ide aro(ati2"e de protine a! or!ent + %XK n(.

- 1) -

3.2. Rluori trie

L5ADN pe"t a" i Ptre do a6e# plus de sensi"ilit et de spcificit par &$"ori(trie apr3s coloration par un fluorochro e spcifique ! - 8$"oro#'ro(e p#i&i2"e de paire de !a e A-T o" <-C 0 Hoe#' t ))*%> DAPI U - 8$"oro#'ro(e inter#a$ant 0 iod"re de propidi"(> !ro("re dt'idi"( o" a#ridine oran-e. Cette te#'ni2"e e t p$" en i!$e 2"e $a pe#trop'oto(trie. De p$" i$ e t possi"le de travailler sur de plus fai"les volu es 61? S,8. I$ &a"t di po er d"n fluori 3tre. Cette (t'ode pr ente #ependant "n in#on6nient 0 e$$e e t en i!$e + $a #o(po ition en !a e ;$e &$"oro#'ro(e pe"t e &ixer pr&rentie$$e(ent "r $e ADN ri#'e en A-T o" <-C=. Le tandard "ti$i de6ra a6oir "ne #o(po ition en <C pro#'e de #e$$e de $ADN (e "r ;$e #e$$"$e e"#ar1ote ont "ne #o(po ition en <C de )F + *4 J> en (o1enne> et $e #e$$"$e pro#ar1ote de %4 + II J=. Cette technique ne quantifie pas l)F+. La &$"ori(trie e t tr3s large ent utilise en c2to trie de flux po"r 2"anti&ier $ADN + $intrie"r de #e$$"$e indi6id"a$i e .

3.3. ,0lectrophor3se sur gel et coloration au "ro ure d0thidiu

#oir planche;exercice

4. Mthodes dtude du gno e ! techniques de "ase

4.1. ,es en=2 es de restriction #oir planche
Ce ont de endonuclases #apa!$e de couper l)&+ dou"le "rin + de sites spcifiques de 4 / O paires de "ases ;par&oi p$" =. Le squences reconnues #o(portent * + 1K n"#$otide et sont le plus souvent palindro iques> #e t-+-dire 2"e $e ite de re tri#tion prsente un centre de s2 trie> #e 2"i &ait 2"e $a "##e ion de n"#$otide e t identi2"e po"r $e !rin en ;$e#t"re ,)= et po"r $e !rin antien ;to"Do"r dan $e en de $e#t"re ,)=. (exemple < radar = elu par cette crapule! Le en:1(e de re tri#tion ont isoles le plus souvent de "actries. Le !a#trie "ti$i ent #e en=2 es pour se dfendre contre une invasion d)&+ tranger> parti#"$i9re(ent dori-ine 6ira$e. Le canis e de dfense des "actries vis:/:vis des virus est appel s2st3 e de restriction: th2lation. Po"r dtr"ire $5ADN d" para ite $a !a#trie expri(e de -9ne de re tri#tion et de (t'1$ation. Le -9ne de re tri#tion per(ettent $a 1nt'9 e d5endon"#$a e #o"pant $5ADN en de ite tr9 p#i&i2"e . A&in de prot-er $5ADN !a#trien de $5'1dro$1 e par $5en:1(e> "ne (t'1$a e> #ode par $e -9ne de (t'1$ation> 6a (odi&ier $e n"#$otide de $5ADN !a#trien en $e (t'1$ant po"r 2"5i$ ne oient p$" re#onn" par $5en:1(e de re tri#tion. ,e no des en=2 es #orre pond 0 - + $initia$e d" -enre a"2"e$ appartient $a !a#trie po"r $a pre(i9re $ettre ;en (aD" #"$e= U "i6ie de de"x pre(i9re $ettre de $e p9#e !a#trienne ;en (in" #"$e= U - $a 6arit e t d i-ne par "ne $ettre o" "n no(!re U - $e #'i&&re ro(ain repr ente $e n"(ro dordre de d#o"6erte de $en:1(e #'e: $e p9#e donne. &eux t2pes de coupure pe"6ent e prod"ire en &on#tion de en:1(e 0 - $a #o"p"re + extr its franches dite a" i "outs francs> $a #o"p"re a $ie" a" (i$ie" d" pa$indro(e U - $a #o"p"re + extr its sortantes dite a" i cohsives> on par$e a" i de #o"p"re d#a$e > $a #o"p"re a $ie" de part et da"tre d" #entre de 1(trie.

- 1* #criture du site de restriction 0 i$ #rit touIours dans le sens L3> on pe"t $#rire o" for e si plifie en #ri6ant 2""n e"$ !rin par exe(p$e <.AATTC> i$ &a"t en "ite re#on tit"er $a"tre !rin par #o(p$(entarit et on ni6ea" de #o"p"re -rc#e a" #entre de 1(trie. ,<.AATTC) )CTTAA.<, De"x en=2 es sont co pati"les $or 2"e$$e ont de sites de restriction diffrents donnent naissance aux - es extr its cohsives. Exe(p$e 0 .amH I et . l II
En:1(e de re tri#tion 3-$ II 0 3a(H1 0 Site de re tri#tion 0 , A.<ATCT ) ) TCTA<.A , , <.<ATCC ) ) CCTA<.< , Extr(it de &ra-(ent o!ten" apr9 di-e tion 0 , A ) TCTA< , Q< ) QCCTA< V V <ATCT ) A , <ATCC ) < ,

ais

Le en:1(e de re tri#tion qui proviennent de deux souches "actriennes diffrentes et qui reconnaissent les - es squences ont appe$e isoschi=o 3res ;ex. >ae III et .su/ I=. iso ? -a$ et s&i?ein ? &endre N3 0 de"x i o #'i:o(9re ne #ata$1 ent pa o!$i-atoire(ent $e (P(e t1pe de #o"p"re. Conditions dactivit des en=2 es de restriction 0 - Une "nit den:1(e de re tri#tion e t $a 2"antit den:1(e #apa!$e d'1dro$1 er #o(p$9te(ent 1 - dADN ;ADN "!trat 0 p'a-e > S7*K> TIQ= en 1 'e"re dan de #ondition opti(a$e de te(prat"re> pH et a$init> dan "n 6o$"(e de ,K L. - Le en:1(e ont &o"rnie + 1K - %K U . L ;-a$e(ent di poni!$e + *K - XK U . L=> dan "ne o$"tion #ontenant ,K J de -$1#ro$. - En prati2"e> i$ a69re 2""n rapport de 1 U . - e t rare(ent ati &ai ant> $ADN te t ntant pa a" i p"ri&i 2"e $ADN "! trat ;#a d"ne (iniprep= o" $a#tion de $en:1(e ntant pa a" i e&&i#a#e ;#a d"n ADN p$a (idi2"e "renro"$=. On tra6ai$$e #o"ra((ent a6e# "n rapport de % - , U . -. - La te(prat"re din#"!ation e t> a"& ex#eption> de )ISC. - La d"re din#"!ation e t &on#tion de $a (a e dADN et d" no(!re d"nit den:1(e en pr en#e. E$$e e t -nra$e(ent de 1 + % 'e"re . +ctuellement on a des en?ymes plus rapides @ heure d*action" - Len:1(e e t a##o(pa-ne d" ta(pon d'1dro$1 e appropri> #on#entr 1K &oi ;1Kd=.P$" ie"r ta(pon ont &o"rni a6e# $e en:1(e de re tri#tion> $e di&&ren#e portant e entie$$e(ent "r $a a$init et "r $e pH. - To" $e ta(pon #ontiennent d" M-%V> #o&a#te"r de en:1(e de re tri#tion. - Le ra#tion e &ont -nra$e(ent dan "n 6o$"(e de 1K - %K L "r de 2"antit dADN de 1KK - ,KK n-. - LarrPt de $a di-e tion e t ra$i > oit par #'a"&&a-e ;1K (in"te + 4XSC=> oit par addition d"ne o$"tion de #'ar-e #ontenant d" SDS et.o" de $EDTA. Le en:1(e de re tri#tion ont large ent utilises dans le do aine de la "iologie olculaire 0 - po"r fa"riquer des )&+ reco "ins> #e t-+-dire de (o$#"$e r "$tant de $a &" ion de di&&rent e-(ent dADN 0 int-ration d"n -9ne dintrPt dan "n 6e#te"r -nti2"e> Q.. U - "ti$i ation de sites de restriction co e arqueur sur l)&+ 0 ra$i ation de #arto-rap'ie de re tri#tion> ana$1 e de $ADN po"r $a dte#tion de ("tation 2"i e trad"i ent par $a di parition o" $apparition d"n ite de re tri#tion #ond"i ant + "ne 6ariation

- 1, de $a $on-"e"r de &ra-(ent de re tri#tion ;po$1(orp'i (e de $on-"e"r de &ra-(ent de re tri#tion ? /8LP ? restriction fra ments len ht polymorphisme=> Q.

4.2. #lectrophor3se ! anal2se de frag ents dacides nucliques

4.2.1. 1rincipe gnral de l0lectrophor3se anal2tique #oir planche
Le a#ide n"#$i2"e ont de acro olcules pol2anioniques unifor ent charges / p$ P 2"i 6ont po"6oir (i-rer o" $5e&&et d5"n #'a(p $e#tri2"e 0 i$ igrent vers le pDle positif 6anode8. La vitesse de igration d5"ne (o$#"$e d5a#ide n"#$i2"e era fonction 0 - de a asse olculaire don# d" no "re de "ases ;o" de paire de !a e =. 1lus une olcule sera de fai"le asse olculaireC plus sa vitesse de igration sera grande. - de $a concentration d0agarose ou d0acr2la ide d" -e$. La igration est inverse ent proportionnelle au logarith e de la asse olaire expri e en gnral en no "re de "ases ou paires de "ases. Le -e$ e t ta$onn a6e# de &ra-(ent dADN o" dA/N de tai$$e #onn"e. La tai$$e d" ;o" de = &ra-(ent; =t"di; = #onditionnera $e (ar2"e"r de tai$$e "ti$i po"r er6ir de r&ren#e 0 on #'oi ira "n standard de taille dont le produit de digestion contient un frag ent a2ant une taille proche de celle du 6ou des8 frag ent6s8 tudi6s8. Le tandard de tai$$e e t o"6ent #on tit" par $e &ra-(ent de di-e tion d"n -no(e 6ira$> ADN d" 6ir" $a(!da par exe(p$e> o" do$i-on"#$otide de 1nt'9 e de tai$$e ad2"ate

Choix du support 0 - $e gel d0agarose e t $e "pport $e p$" "ti$i . Le tai$$e de &ra-(ent 2"5i$ e t po i!$e de parer ont #o(pri e entre ?C1 et 3? .". La (i-ration e&&e#t"e en position hori=ontale. - $e gel de pol2acr2la ide e t "ti$i po"r $a paration de petit &ra-(ent de oins de ?C1 ." E 1?? p". Le -e$ e t #o"$ entre de"x p$a2"e de 6erre + $5a!ri de $5ox1-9ne. La igration est verticale. L$e#trop'or9 e "r -e$ de po$1a#r1$a(ide e t "ne (t'ode dana$1 e p$" r o$"ti6e #ar on pe"t parer $e &ra-(ent dADN + "ne !a e pr9 . L$e#trop'or9 e "r -e$ de po$1a#r1$a(ide e t "ti$i e dan $a (t'ode de 2"enBa-e de $ADN ;voir para raphe ultrieur!.

#oir planche < A a arose ou polyacrylamide et taille des fra ments

- 14 <isualisation des acides nucliques 0 Le a#ide n"#$i2"e ont 6i "a$i par coloration du gel au "ro ure d0thidiu 6;r#t8 2"i e t "n a-ent 5inter#a$ant entre $e p$atea"x de paire de !a e et (ettant "ne &$"ore #en#e oran-e $or 2"5i$ e t #$air par de U7 #o"rt ;%KK-)KKn(=. Le seuil de dtection e t de $5ordre de 2"e$2"e nano-ra((e 0 2 / 3 ng . !ande. L5$e#trop'or9 e per et aussi de sparer des olcules d0acides nucliques suivant leur structure> par exe(p$e $e diffrentes for es d0un plas ide.

8or(e #ir#"$aire re$axe ? OC ? open circular 8or(e "renro"$e ? CCC ? closed circular covalently

/e(ar2"e 0 E$e#trop'or9 e de A/N e"#ar1ote Le )F+ eucar2otes ont $e p$" o"6ent de olcules de taille i portante ;` K>X ]!= U $e -e$ "ti$i eront don# d5agarose. Le )F+ for ent souvent des structures secondaires asse= sta"les 2"i pertur"ent la igration lectrophortique et faussent l0esti ation du poids olculaire. A$or $e -e$ "ti$i #ontiennent de agents dnaturants ;ex 0 &or(a(ide= 2"i d ta!i$i ent $e apparie(ent entre !a e .

4.2. #lectrophor3se en cha p puls 61RT#8

1TR# de langlais Pulse Field Gel Electrophoresis8 Bn parle aussi d*lectrophor:se en champ altern (/CC+!" Ce t "ne te#'ni2"e tr9 "ti$e po"r $anal2se des gno es eucar2otiques ? anal2se de grands frag ents d)&+> parti#"$i9re(ent en $iai on a6e# $e te#'no$o-ie 2"i (ettent + pro&it $e en:1(e de re tri#tion. Cette te#'ni2"e per et de sparer des frag ents de tr3s grande taille ;tai$$e suprieure / 2? ."= 2"i ne ont pa par $or d$e#trop'or9 e "r -e$ de t1pe #$a i2"e.

- 1I Le prin#ipe de #ette $e#trop'or9 e #on i te + changer l0orientation et7ou la polarit du cha p lectrique alternative ent au cours du te ps. A #'a2"e (odi&i#ation d" #'a(p> $a (o$#"$e d5ADN doit e rorienter para$$9$e(ent a" no"6ea" #'a(p. Le te(p n#e aire + $a rorientation e t proportionne$ + $a $on-"e"r de $a (o$#"$e. Lor 2"e $e #'a(p e t rta!$i dan on en initia$> $a (o$#"$e doit "ne no"6e$$e &oi e rorienter. Ces te ps de rorientation provoquent un retarde ent de la igration nette qui est proportionnel / la taille de la olcule . ;parcours en ?i ;?a donc parcours plus lon et on peut donc mettre en vidence petite diffrence de vitesse de mi ration=. Le "pport de (i-ration e t "n gel d0agarose / 1K et $a taille des frag ents spars est de l0ordre de L? ." / quelques ga"ases. La (t'ode e t + #e point e&&i#a#e 2"e to" $e chro oso es de la levure ;%% #'ro(o o(e => et da"tre cha pignons> pe"6ent Ptre par "r $e (P(e -e$. Le #'ro(o o(e de (a((i&9re ont trop -rand po"r Ptre par dire#te(ent par P8<E=. He"re" e(ent> #ertain en:1(e de re tri#tion> 2"e $on po"rrait 2"a$i&ier de @ par#i(onie"x A> #o((e NotI> P6"I o" M$"I> #o"pent $e )&+ de a if3res en frag ents de %KKK + p$" ie"r #entaine de (i$$ier de ]i$o!a e 2"i> e"x> pe"6ent Ptre par par P8<E.

4.3. ,h2"ridation
4.3.1. &finitions

olculaire ! concepts de "ase

$2"ridation E association de "rins co pl entaires dacides nucliques ;ADN.ADN U ADN.A/N=. Te prature de fusion ou T T( ? te(prat"re + $a2"e$$e ,KJ de (o$#"$e da#ide n"#$i2"e i(p$e !rin=. ;@ A po"r @ melting 2 en an-$ai ? fusion=. On par$e -a$e(ent de te prature de de i:dnaturation. ont dnat"re ; o" &or(e

Remarque 0 Apr9 $a &" ion> lorsque la te prature de la solution est a"aisse Iuste au:dessous de la T C une rassociation des deux chaAnes est o"tenue ;renat"ration=. Par #ontre> apr3s la fusionC un refroidisse ent rapide per(et do!tenir de si ples "rins relative ent sta"les.

4.3.2. Conditions de lh2"ridation

,h2"ridation

olculaire #oir planche

olculaireC et donc la valeur de la T C dpendent de no "reux facteurs 0 - $a $on-"e"r d" &ra-(ent dADN #on idr U - $a ri#'e e en #1to ine et -"anine U - $a #on#entration en #ation ;NaV= d" (i$ie" ra#tionne$ - $a #on#entration en a-ent dnat"rant ;ex 0 &or(a(ide> "re= - $e pH

- 1X - La T aug ente quand la longueur de l)&+ aug ente 0 p$" $ADN e t $on- p$" i$ 1 a dintera#tion '1dro-9ne + ro(pre. - La T aug ente quand le pourcentage en TC aug ente. En e&&et> p$" $ADN e t ri#'e en paire <C p$" $e no(!re (o1en de $iai on '1dro-9ne par paire de !a e + ro(pre e t i(portant ;#&. ) intera#tion '1dro-9ne po"r $a paire <C #ontre % e"$e(ent po"r $a paire AT=. - La T di inue quand la force ionique 6#on#entration d" (i$ie" ra#tionne$ en #ation > par exe(p$e $e ion NaV= du ilieu di inue. En e&&et> en ne"tra$i ant "ne partie de charges ngatives des groupe ents phosphates> $e #ation sopposent aux forces de rpulsion 2"i exi tent entre les deux "rins> les cations sta"ilisent ainsi la dou"le hlice. Q"and $a concentration en +aCl e t fai"le> $)&+ e t oins sta"le> i$ &a"dra oins chauffer pour provoquer la dissociation de de"x !rin . - La T di inue quand le p$ aug ente. A pH a$#a$in to" $e -ro"pe(ent p'o p'ate expo ent "ne #'ar-e n-ati6e> $e &or#e $e#tro tati2"e de rp"$ ion a"-(ente> $a tr"#t"re !i#atnaire e t (oin ta!$e> $e de"x !rin e parent p" &a#i$e(ent. - La T di inue en prsence dagent dnaturant co e la for a ide ou lure. La &or(a(ide e t 2"a$i&ie da-ent dnat"rant #ar e$$e a-it #o((e "n in'i!ite"r #o(ptiti& de intera#tion '1dro-9ne 2"i ta!$i ent entre $e paire de !a e . Le de"x #'aTne ont a$or (oin &orte(ent a o#ie > $e de"x !rin e parent p$" ai (ent> $ADN e t dnat"r. 8or(a(ide 0 Ure 0

'tringence et h2"ridation spcifique On d i-ne par stringence $e degr de p-che ent des h2"ridations non spcifiques. On dit -a$e(ent 2"une solution est dautant plus stringente quelle dsta"ilise l)&+. Stringence Conditions exprimentales de temprature8 de P> et de force ionique permettant l*hybridation molculaire" 3a strin ence est proportionnelle D la temprature et D l*inverse de la concentration en cations monovalents (-aE par exemple!" ,es conditions tr:s strin entes (0F leve8 concentration en -aE faible! rendent l*hybridation molculaire plus difficile mais permettent une hybridation spcifique tandis que des conditions peu strin entes (0F plus faible8 concentration en -aE plus leve! permettent une hybridation moins spcifique" ,a stringence traduit le degr dho ologie des frag ents / h2"rider. Dan de #ondition de &orte trin-en#e> n'1!rident 2"e de &ra-(ent de DNA 'o(o$o-"e > trin-en#e $e6e 2"and ^NaC$_ et te(prat"re . )ug entation de la stringence e dsta"ilisation de la dou"le hlice e di inution de la concentration en +aCl ou aug entation de la te prature e h2"ridation spcifique

- 1F -

4.3.3. Calcul de la T #oir planche

I$ e t po i!$e de (e "rer dire#te(ent $a te(prat"re de &" ion d5"n ADN do"!$e !rin en esurant l0aug entation de l0a"sor"ance de la solution / 2O? n en fonction de la te prature. On tra6ai$$e -nra$e(ent en prsence de for a ide 2"i d ta!i$i e $e intera#tion '1dro-9ne de $ADN par #o(ptition. To"te&oi > on e #ontente $a p$"part d" te(p d5"ne esti ation / partir de la co position de l0oligonuclotide. T( ? X1>, V 14>4 .$o- ^NaV_ V K>*1. ;J <C= f 4KK.N f K>4) . ;J &or(a(ide=

4.3.4. ,es diffrentes

thodes dh2"ridation

Troi (t'ode d'1!ridation prin#ipa$e ont "ti$i e 0 $'1!ridation en (i$ie" $i2"ide ;'1!ridation en p'a e 'o(o-9ne= U $'1!ridation "r "pport o$ide ;'1!ridation en p'a e 'tro-9ne= U $'1!ridation in it". ,h2"ridation en ilieu liquide e t ra$i e a" #o"r de di&&rente te#'ni2"e > #o((e $a(p$i&i#ation en:1(ati2"e in 6itro ;PC/ 6oir p$" $oin=> $a ("ta-n9 e diri-e> $e (ar2"a-e radioa#ti& de onde > Q.. ,h2"ridation sur support solide "ti$i e de (e(!rane de nitro#e$$"$o e> o" de (e(!rane 1nt'ti2"e + !a e de n1$on. Li((o!i$i ation de 2"en#e n"#$otidi2"e > #e pe"t Ptre $a #i!$e o" $a onde> "r $a (e(!rane per(et "ne paration i(p$e par $a6a-e de 2"en#e non '1!ride . Cette appro#'e e t "ti$i e dan di&&rente te#'ni2"e #o((e $e So"t'ern !$ot ;6oir p$" $oin=> $e p"#e + ADN> Q. ,h2"ridation in situ e t "ti$i e po"r reprer "ne 2"en#e donne dA/N o" dADN + $intrie"r d"ne #e$$"$e. E$$e pe"t Ptre ra$i e "r 0 - de #o"pe de ti " U - de #'ro(o o(e (tap'a i2"e ;$o#a$i ation de -9ne "r $e #'ro(o o(e e"#ar1ote = U - de #o$onie !a#trienne ;per(et de reprer $e #o$onie re#o(!inante 2"i ont int-r $e 6e#te"r #ontenant $a 2"en#e dintrPt $or d"ne exprien#e de #$ona-e de -9ne= L'1!ridation in it" e t a" i appe$e technique R*'$ ? Gluorescent In 5itu >ybridation

4.4. Faction de pol2 risation en chaAne 61CF8 ! a plification des squences d)&+
Polymerase Chain Reaction H PCR Cette te#'ni2"e per et do"tenir un no "re i portant 6Iusqu/ un squence choisie d)&+. illion8 de copies dune

I$ a-it d"ne (t'ode da plification en=2 atique in vitro> par oppo ition + $a (t'ode in 6i6o 2"i i(p$i2"e $e #$ona-e d" &ra-(ent et $a(p$i&i#ation dan "ne !a#trie ;&ra-(ent + a(p$i&ier appe$ in ert introd"it dan "n p$a (ide p"i p$a (ide re#o(!inant introd"it dan !a#trie U rp$i#ation de p$a (ide + $intrie"r de pop"$ation !a#trienne en #roi an#e=.

- %K Cette te#'ni2"e i plique quune partie de la squence d)&+ soit connue. I$ e t ncessaire davoir des infor ations concernant les squences flanquant l)&+ ci"le . A partir de #e in&or(ation > deux oligonuclotides denviron 1L / 2L paires de "ases sont la"ores. I$ doivent sh2"rider spcifique ent aux deux extr its de la squence / a plifier > #'a2"e o$i-on"#$otide e &ixant + $"n de de"x !rin . Ces deux oligonuclotides servent da orces / une )&+ pol2 rase. L)&+ pol2 rase s2nthtise la chaAne d)&+ dans le sens L 3 / partir de la orce 6primer= et elle pol2 rise les nuclotides selon la squence du "rin atrice 6template8. ;a(or#e ? petite 2"en#e dADN i(p$e !rin a1ant "ne extr(it )OH $i!re=

Cette te#'ni2"e a #onn" "n e or #on idra!$e -rc#e + $"ti$i ation d"ne )&+ pol2 rase ther osta"le> 6itant de raDo"ter de $en:1(e + #'a2"e #1#$e. Cette en:1(e t'er(o ta!$e pro6ient de (i#roor-ani (e 6i6ant dan de o"r#e #'a"de . LADN po$1(ra e de Thermophilus aquaticus> appe$e Taq pol2 rase> e t $ar-e(ent "ti$i e. 0hermophilus aquaticus e t "ne !a#trie t'er(op'i$e de o"r#e #'a"de d" par# de Ee$$oC tone ;Ca$i&ornie=. La Ta2 po$1(ra e e t rsistante / l0"ullition et e t active / JL:P? QC. La Ta2 po$1(ra e e t dpourvue d0activits d0dition ;,5 )5 exon"#$a e et )5,5 exon"#$a e=. Par#e 2"5e$$e e t dpo"r6"e d5a#ti6it d5dition $a Ta2 po$1(ra e e t responsa"le de no "reux sapparie ents 0 de $5ordre de 1 po"r 1KK paire de !a e . La Ta2 po$1(ra e &on#tionne #orre#te(ent + "ne concentration en MgCl2 de 2:3 M> a"-de$+ e$$e prod"it da6anta-e de ( apparie(ent . La Ta2 po$1(ra e e t inhi"e par les ions phosphates. La PC/ #on i te en "ne succession de 2L / 4? c2cles> #'a2"e #1#$e #o(prenant 0 - "ne dnaturation de $ADN do"!$e !rin ;F,- FX SC= U - "ne h2"ridation a6e# $e de"x a(or#e p#i&i2"e ;entre *K et IK SC e$on $e T( de o$i-on"#$otide = U - "ne extension des a orces a6e# $ADN po$1(ra e ;IK-I% SC= ? longation. Cette te#'ni2"e e t "ne raction en chaAne #ar $e "rins d)&+ nofor s sont utiliss co e atrice pour les s2nth3ses d)&+ suivantes> pendant $e %, + ), #1#$e #on #"ti& . Le d"re et $e te(prat"re de troi ra#tion pr#i (ent dan "n ther oc2cleur auto atique. de #1#$e "##e i& ont #ontrO$e

5chma D savoir reproduire

- %1 -

Ce nest qu/ partir du 33 e c2cle quapparaissent les frag ents dintr-t a plifis ;&ra-(ent de $a tai$$e attend"e=. Le copies de la squence ci"le peuvent -tre visualises sous la for e dune "ande distincte dune taille spcifique apr3s lectrophor3se d" prod"it de $a ra#tion de PC/ dan "n -e$. ) la fin de chaque c2cleC la quantit d)&+ a t ultiplie par 2 . I$ a-it don# d"ne a plification exponentielle> t'ori2"e(ent -a$e + %n po"r n #1#$e da(p$i&i#ation 0 1K #1#$e 0 no(!re de #opie ? %1K ? 1K%* Y1KKK U )K #1#$e 0 on a ;1K)= ) ? 1KF #opie . #n pratiqueC la quantit d)&+ est ultiplie 1?? ??? / plusieurs illions de fois. Le #'oix de a(or#e ;primers= e t #r"#ia$ po"r 2"e $a PC/ oit r" ie. ,e choix des a orces doit rpondre aux crit3res suivants ! - $e te(prat"re de &" ion T( de a(or#e en et anti en doi6ent Ptre identi2"e U

- %% $a tai$$e de a(or#e doit Ptre #o(pri e entre 1% et )K n"#$otide U $a di tan#e entre $e de"x a(or#e "r $ADN + a(p$i&ier doit Ptre #o(pri e entre 1K !p et 1K ]!p U $e #onten" en n"#$otide <VC doit Ptre #o(pri i po i!$e entre *K et 4K J U $extr(it ) doit e ter(iner de pr&ren#e par "n T U $e 2"en#e d'1!ridation de a(or#e doi6ent Ptre "ni2"e U $e intera#tion de a(or#e entre e$$e ont + 6iter U $e tr"#t"re en pin-$e + #'e6e" ont + 6iter.

La PC/ e t devenue de pratique courante dans la plupart des la"oratoires de "iologie olculaire #ar e$$e ne requiert pas lutilisation de produits radioactifs. Le applications de la 1CF sont no "reuses et i$ exi te plusieurs variantes de la 1CF> a6e# de !"t di&&rent 0 dia-no ti# de a-ent in&e#tie"x ;'patite ;3> C et D=> dia-no ti# de HI7= exemple de performance actuelle H dtection de I D J particules virales K m3 de san U t"de de ("tation pon#t"e$$e U 2"enBa-e dire#t de &ra-(ent a(p$i&i U t"de de ano(a$ie #1to-nti2"e U en #ri(ino$o-ie> $a PC/ e t tr9 "ti$i e po"r dte#ter de po$1(orp'i (e "r de &ai!$e 2"antit ;1 a$ de an- o" 2"e$2"e #'e6e"x= U dte#tion de 69ne(ent rare > te$ $a pr en#e de 1 J de #e$$"$e t"(ora$e o" $a dte#tion d5"ne &ai!$e 2"antit de #e$$"$e ;1K-* >1K-,= apr9 "n traite(ent par #'i(iot'rapie o" -re&&e de (oe$$e.

4.L. ,e squenBage de l)&+ ! dter ination de la squence dun acide nuclique

La dter(ination de $a 2"en#e d"n a#ide n"#$i2"e e t a#t"e$$e(ent extrP(e(ent i(p$e + ra$i er -rc#e a"x pro-r9 te#'no$o-i2"e et a"x (o1en in&or(ati2"e (oderne . La dter ination de la totalit de la squence dun certain no "re de gno es est raliseC celle du gno e hu ain 6environ 3CL illiards de paires de "ases8 est auIourdhui connue / plus de U? K. A#t"e$$e(ent> $a la plus rpandue. thode en=2 atique par les didsox2nulotides> $a thode de 'anger> e t

La raction de squenBage est une technique de s2nth3se d)&+ analogue / la 1CF. Le prin#ipe -nra$ de $a te#'ni2"e #on i te + effectuer la s2nth3se de ultiples "rins d)&+ co pl entaires du "rin dont on veut dter iner la squence. Po"r $ire $a 2"en#e d5"n ADN i(p$e !rin on h2"ride une a orce du cDt 30 de cet )&+. 1uis on effectue avec une )&+ pol2 rase la s2nth3se d0un "rin co pl entaire.

- %) ,astuce consiste / utiliser des didsox2nuclotides 6dd+T18> ana$o-"e tr"#t"ra"x de d ox1n"#$o ide trip'o p'ate > (ai ne po dant pa de -ro"pe(ent OH en ). ,extension de la chaAne est stoppe apr3s lincorporation dun dd+T1 d" &ait de $i(po i!i$it de &or(er $a $iai on p'o p'odie ter.

Quatre ractions sont

enes en parall3le dans quatre tu"es.

To" $e t"!e #ontiennent 0 - $ADN + 2"en#er> - $e 2"atre d ox1ri!on"#$o ide trip'o p'ate dont "n e t radioa#ti&> - "ne a(or#e> - et "ne ADN po$1(ra e. En o"tre> #'a#"n de t"!e #ontient "n did ox1ri!on"#$otide parti#"$ier + &ai!$e #on#entration 0 - ddATP po"r $a ra#tion A> - ddTTP po"r $a ra#tion T> - ddCTP po"r $a ra#tion C> - dd<TP po"r $a ra#tion <> Po"r #'a2"e t"!e> on o!tient "n en e(!$e de (o$#"$e dont $a $on-"e"r dpend de $a po ition d" n"#$otide #o(p$(entaire d" did ox1n"#$otide introd"it. Le #onten" de #'a#"n de t"!e e t dpo "r "n -e$ de po$1a#r1$a(ide ;2"atre pi te #onti-"g =. La r o$"tion d" -e$ e t te$$e 2"e $on pe"t di tin-"er de"x !rin dADN dont $a $on-"e"r ne di&&9re 2"e d"n e"$ n"#$otide. Le -e$ e t #' p"i o"(i + "ne a"toradio-rap'ie. %n peut donc lire de haut en "as la squence du "rin d)&+ co pl entaire et en dd"ire &a#i$e(ent $a 2"en#e d" !rin (atri#e.

#oir planche et exercice donn en cours

Technique se i:auto atique utilisant des fluorochro es. #oir planche I$ exi te a#t"e$$e(ent de squenceurs auto atiques dADN 2"i "ti$i ent $e quatre didsox2nuclosides triphosphate arqus chacun avec un fluorochro e diffrent ;6ert po"r did ox1A> !$e" po"r did ox1C > Da"ne po"r did ox1< et ro"-e po"r did ox1T=. On ra$i e a$or une seule incu"ation et une seule igration a" $ie" de 2"atre #ar les didsox2nuclotides> o" $a#tion d"n $a er dex#itation> eront reprs par une ission de fluorescence de couleur diffrente. Llectrophor3se peut seffectuer en continu #ar $e !ande dADN ont dte#te -rc#e + $in#orporation + $extr(it ter(ina$e d" did ox1n"#$otide &$"ore #ent p#i&i2"e. Lanal2se par ordinateur de i-na"x per(et dta!$ir $a 2"en#e. On o!tient ain i de 2"en#e de )KK + XKK !a e an a(!i-"ht.

- %* -

4.O. ,es

thodes de recherche de squences nuclotidiques

4.O.1. ,e 'outhern "lot !

Le So"t'ern !$ot e t "ne technique ise au point par #dVard M. 'outhern en 1UJL pour rechercher des frag ents de &+) sur une lectrophor3se en $e '1!ridant a6e# "ne onde #o(p$(entaire. On $appe$$e a" i te#'ni2"e d" "uvardage de 'outhern ;$5appe$$ation an-$ai e tire on no( d" 6o#a!$e blot i-ni&iant !"6ard=. #oir planche et demander D voir animation en 0, informatique Le tape 0 1rparation de l0)&+ / tudier Di-e tion par "ne en:1(e de re tri#tion ad2"ate Sparation de &ra-(ent par $e#trop'or9 e Dnat"ration de $5ADN par in#"!ation d" -e$ d5$e#trop'or9 e dan "ne o$"tion de o"de Tran &ert de $5ADN "r "ne (e(!rane de nitro#e$$"$o e o" de n1$on par "n &$"x de $i2"ide entraTnant $5ADN 0
- Une &e"i$$e de (e(!rane en nitro#e$$"$o e ;o" en#ore en n1$on= e t p$a#e "r $e -e$. - Une pre ion e t app$i2"e a" -e$ en p$aBant "ne pi$e de er6iette de papier et "n poid "r $a (e(!rane et $e -e$. - Ce#i 6a per(ettre "ne (onte par #api$$arit d" ta(pon i(pr-nant $e -e$. Ce dp$a#e(ent de $i2"ide entraTne $5ADN 2"i 6a ain i e &ixer + $a (e(!rane de nitro#e$$"$o e ;o" de n1$on=.

8ixation #o6a$ente de $5ADN "r $a (e(!rane par #"i on ;nitro#e$$"$o e= o" expo ition a"x U.7 #o"rt ;n1$on=.

1rh2"ridation A6ant #onta#t a6e# $a onde> on prin#"!e $a (e(!rane a6e# de $5ADN ;ADN de per(e de a"(on= po"r at"rer to" $e ite 2"i n5ont pa t o##"p par $5ADN $or d" tran &ert. $2"ridation On aDo"te $a onde dnat"re + $a o$"tion d5'1!ridation. La te(prat"re d5'1!ridation tant d&inie par $a T( de $a onde "ti$i e ; oit Y4,SC po"r "ne onde de V de 1KK !a e =. La onde e t (ar2"e de orte 2"5e$$e p"i e Ptre dte#te> 'a!it"e$$e(ent par in#orporation de $a radioa#ti6it o" en iti2"eta-ei de $a (o$#"$e a6e# "n &$"orop'ore. Dan #ertain #a > $a onde pe"t Ptre &aite + partir d5A/N> p$"tOt 2"e d5ADN. ,avages Le $a6a-e $i(ine $a onde en ex#9 . )utoradiographie Dan $e #a d"ne onde radioa#ti6e> on (et $a (e(!rane en pr en#e d5"n &i$( radio-rap'i2"e 6ier-e dan "ne en#einte opa2"e po"r 2"e $a onde radioa#ti6e &ixe "r $e &ra-(ent de DNA #o(p$(entaire i(pre ionne $e &i$(. On r69$e $e &i$( 0 $e ta#'e noire ; "r $e n-ati&= #orre pondent a"x e(p$a#e(ent o[ ont (i-r $e &ra-(ent d5ADN #o(p$(entaire de $a onde. La technique de 'outhern poss3de de no "reuses applications 0 - Eta!$i e(ent de #arto-rap'ie de re tri#tion U - Mi e en 6iden#e de &a(i$$e ("$ti-ni2"e> de p e"do-9ne ;#&. 2"en#e #o(("ne= U - Dte#tion de po$1(orp'i (e de re tri#tion 0 "ne 2"en#e de re#onnai an#e d"ne en:1(e de re tri#tion pe"t
Ptre pr ente #'e: $e "n et a! ente #'e: $e a"tre "ite + "ne ("tation U dan #e #a > $a tai$$e de &ra-(ent de re tri#tion di&&9rent + #e ite> on par$e de po$1(orp'i (e de $on-"e"r de &ra-(ent de re tri#tion o" /8LP po"r restriction fra ments len ht polymorphism U

- %, Dte#tion de rptition> de d$tion> din6er ion > de re#o(!inai on de -9ne .

Fe arque ! la

thode du +orthern "lot

Le prin#ipe e t $e (P(e 2"e po"r $e So"t'ern 3$ot (ai i#i ce sont les )F+ qui sont tudis. Cette mthode est peu employe actuellement" Le no de +orthern "lot provient dun Ieu de Nort'ern. ,es tapes 0 A6e# $e A/N on na plus "esoin de digrer par les en=2 es de restriction. Le A/N tota"x o" $e A/N po$1;A=V ont par e$on $e"r tai$$e par (i-ration dan "n gel dagarose contenant un agent dnaturant 6for a ide8 de ani3re / dtruire dventuelles structures secondaires de l)F+. Le tape de tran &ert et d'1!ridation ont to"t + &ait i(i$aire + #e$$e "ti$i e po"r $ADN. ot "r $e ter(e So"t'ern et non d"n do#te"r

,a visualisation d0un )F+ par une sonde per et 0 - dappr#ier a di tri!"tion dan $e ti " > - dt"dier on a!ondan#e re$ati6e> - de dter(iner a tai$$e> - de dte#ter $e inter(diaire de (at"ration et $e di&&rente &or(e d5pi a-e de $5A/N. N3 0 On a reprod"it #e De" de (ot po"r une technique danal2se de protines i(i$aire a6e# $e ter(e Western "lot 0 paration de protine par $e#trop'or9 e "r -e$> tran &ert "r (e(!rane et dte#tion + $aide danti#orp (ar2" .

4.O.2. ,es puces / )&+

Le p"#e + ADN ont a" i appe$e "iopuces> DNA chips> DNA microarrays. Le p"#e + ADN er6ent + rechercher des squences nuclotidiques. Le principe des puces / )&+ repose sur le concept classique de lh2"ridation olculaire spcifique. Le p"#e + ADN portent> greffes sur leur surface> de oligonuclotides de squence connue ;&ra-(ent #o"rt dADN i(p$e !rin= suscepti"les de sapparier + de !rin #o(p$(entaire d)&+ prsents dans les chantillons "iologiques / anal2ser. -. < -e pas utiliser le terme de sonde ici car de faLon nrale une sonde H squence nuclotidique connue marque" Te#'no$o-ie 0

#oir planche

- La p"#e e t #on tit"e d"n "pport (iniat"ri de 2"e$2"e #(% de "r&a#e "r $e2"e$ ont -re&&e p$" ie"r di:aine de (i$$ier do$i-on"#$otide de 2"en#e #onn"e. Le de"x "pport $e p$" "ti$i a#t"e$$e(ent ont $a (e(!rane de n1$on et $a p$a2"e de 6erre. - Po"r &a!ri2"er "ne p"#e + ADN> "n de pro#d #o"rant #on i te + dpo er "r "n "pport o$ide + $aide d"ne (i#ropipette ro!oti e de (i$$ier de &ra-(ent dADN. C'a2"e point de $a p"#e repr ente "n &ra-(ent dADN + $a 2"en#e pr#i e. - Lor 2"e $e &ra-(ent dADN #i!$e de $#'anti$$on + te ter re#onnaTt a 2"en#e #o(p$(entaire dADN "r $a p"#e> $e de"x &ra-(ent apparient po"r re#on tit"er $a do"!$e '$i#e dADN. Ce t $e p'no(9ne d'1!ridation. - Le &ra-(ent dADN #i!$e ont (ar2" a" (o1en de tra#e"r &$"ore #ent o" radioa#ti& ;"ti$i ation de de"x i otope )H et )%P=. Le i-na$ de #'a2"e pot e t enre-i tr -rc#e + "n #o(pte"r po"r $a dte#tion de $a radioa#ti6it o" "n #anner po"r $a dte#tion de $a &$"ore #en#e. Le applications futures des puces / )&+ sont no "reuses 0

- %4 ana$1 e d" -not1pe ? tra6ai$ "r ADN dire#te(ent U ana$1 e d" tran #ripto(e (voir planche! ? ana$1 e d" p'not1pe ;#5e t-+-dire #e 2"i expri(e= ? tra6ai$ "r A/N( p"ri&i #on6erti en "ite en ADN# U dia-no ti# de &a#te"r de ri 2"e dan "n tr9 -rand no(!re de pat'o$o-ie ;#ardio6a #"$aire > #an#er > 6iei$$i e(ent= U "ti$i ation en p'ar(a#ie po"r $a (i e a" point de no"6ea"x (di#a(ent U dte#tion de $a #onta(ination par de (i#roor-ani (e et de or-ani (e -nti2"e(ent (odi&i dan $a-ro-a$i(entaire.

Le p"#e + ADN intre ent "n $ar-e (ar#'> e ti( + % (i$$iard de"ro po"r %KK,.

4.O.3. ,e &ot ;lot

1 ,ot 2 i-ni&ie ta#'e en an-$ai . Ce t "ne te#'ni2"e d"ne -rande i(p$i#it> $e dot !$ot e t "ti$i po"r $t"de de petit &ra-(ent dADN o" de A/N. Un #'anti$$on e t dpo "r "n &i$tre en n1$on. Contraire(ent a" So"t'ern !$ot> i$ n1 a pa dtape pra$a!$e de di-e tion par de en:1(e de re tri#tion ni d$e#trop'or9 e. Co((e po"r $a te#'ni2"e de So"t'ern> dnat"ration> '1!ridation> $a6a-e et a"toradio-ra((e ont en "ite e&&e#t" . Dan $e dot !$ot on "ti$i e "ne onde ;o$i-on"#$otide de 2"en#e #onn"e (ar2" par exe(p$e a6e# de radioi otope =. Ain i> #ette te#'ni2"e per(et de a6oir i> dan $e ($an-e de a#ide n"#$i2"e te t > i$ exi te "ne o" p$" ie"r 2"en#e #o(p$(entaire de #e$$e de $a onde.