AVALIAO ANDROLGICA E CRIOPRESERVAO DE SMEN NO TOURO

Carlos Antnio de Carvalho Fernandes Md. Vet. D.Sc. 2006

Avaliao androlgica no touro

AVALIAO ANDROLGICA NO TOURO

1. UM BREVE HISTRICO Os primeiros estudos a demonstrar a existncia de uma percentagem relativamente alta de machos imprprios para a reproduo, principalmente na espcie bovina, foram feitos na Europa, na dcada de 20. Estes animais apresentavam leses patolgicas que podiam ser detectadas pelo exame clnico, exame do smen ou ambos. Na dcada seguinte, descobriu-se que boa parte dos touros da raa sueca das montanhas havia sido eliminada por problemas de fertilidade, iniciando um extenso trabalho nesta rea, e descobrindo uma patologia que posteriormente foi definida como tendo caractersticas genticas e hereditrias. A disseminao da condio gentica que condicionava esta reduo de fertilidade foi tamanha, que a multiplicao desta raa ficou seriamente comprometida. A veterinria foi pioneira no estudo das clulas germinativas e fertilidade. A medicina humana somente se interessou por este assunto anos mais tarde. No Brasil a preocupao com a avaliao da capacidade sexual dos machos se iniciou em 1943, quando foram apresentadas no II Congresso Brasileiro de reproduo Animal, dois trabalhos sobre o assunto.

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2 - CONTROLE ENDCRINO DA REPRODUO NO MACHO O funcionamento de todas as estruturas do genital masculino, assim como a produo de espermatozides regulada por hormnios. O GnRH, produzido pelo hipotlamo induz a liberao de FSH e LH pela hipfise. O FSH age diretamente nos tbulos seminferos, estimulando a espermatognese (principalmente as fases iniciais), onde exerce um efeito de estimulao das divises mitticas por que passam as espermatognias. Estimula tambm a produo e secreo de Inibina e ABP (protena Ligadora de Andrgenos) pelas Clulas de Sertoli. Esta ltima (ABP) tem a funo de passar luz do tbulo seminfero e se ligar a testosterona, fazendo com que este hormnio permanea por mais tempo e em maior concentrao neste nvel, ao evitar seu metabolismo e difuso pelas clulas da parede do tbulo. A funo da Inibina a mesma da fmea, ou seja, bloquear seletivamente a sntese do FSH na hipfise, exercendo desta forma um controle atravs de um mecanismo feed back negativo na secreo desta gonadotrofina. O LH tem a funo principal de estimular a produo de testosterona pela clulas de Leydig, (juntamente com o FSH) que se situam fora dos tbulos seminferos, em pequenos aglomerados. A Testosterona produzida pelas clulas de Leydig, possui uma importante funo na espermatognese (fases finais), e manuteno da fisiologia dos rgos genitais masculinos. Alm disto, regula a secreo de GnRH, FSH e LH, atravs de feed back negativo, ou seja, bloqueia a secreo destes hormnios.

3 - FISIOLOGIA DA REPRODUO DO MACHO Neste tpico sero discutidos alguns conceitos e mecanismos fisiolgicos relacionados ao sistema genital masculino. Smen uma suspenso celular lquida ou gelatinosa, composta basicamente de espermatozides e secrees das glndulas anexas ao genital masculino. Esta poro fluda comumente chamada de plasma seminal Espermatozides So clulas altamente especializadas, produzidas nos tbulos seminferos, atravs de um processo chamado de espermatognese. O formato do espermatozide varivel entre as espcies, mas basicamente sua morfologia mesma conforme descrito na Figura 1: FIGURA 1: Esquema da estrutura do espermatozide.

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Cabea: geralmente alongada, ovalada, contendo no interior um ncleo achatado, formado por cromatina densa, contendo a metade dos cromossomos da espcie em questo. Recobrindo externamente a poro apical do ncleo, encontra-se o ACROSSOMA, que uma vescula cujo interior possui enzimas importantes para a penetrao na zona pelcida do ovcito durante a fecundao. O citoplasma reduzido. Externamente revestido pela membrana plasmtica que na poro mediana da cabea forma a Regio Equatorial, pela qual o espermatozide se liga a zona pelcida do ovcito. - Pea Intermediria: Liga-se cabea pelo pescoo e cauda pelo anulo. composta por uma grande quantidade de mitocndrias dispostas num arranjo helicoidal em torno de um conjunto de microtbulos centrais. Estas mitocndrias so importantes para gerar a energia necessria para o transporte do espermatozide. - Cauda: Pode ser dividida em Pea Principal e Final ambas composta por um arranjo de 9 pares de microtbulos paralelos em torno de um par central denominado AXONEMA. Externamente a esta estrutura, encontramos associada a cada par de microtbulo um feixe de fibras de colgeno e mais externamente a membrana plasmtica. A Pea final difere da Principal por no possuir o feixe de fibras externas. Plasma Seminal a poro lquida do smen, formada principalmente pela glndulas anexas, mas tambm por outras partes do genital, como testculos e epiddimos. Apresenta as seguintes funes (e respectivos constituintes): ? Nutrio do espermatozide (frutose, glicose) ? Veculo para " ? Proteo contra choque trmicos e fsicos (colesterol, acidos graxos, inositol) ? Propriedade tamponante (citratos, fosfatos) ? Evitar choque osmtico (Na, Ca, K, Mg) ? Estimulante de metabolismo (protenas, hormnios) 3.1 - ESPERMATOGNESE o processo de formao dos ESPERMATOZIDES que ocorre nos tbulos seminferos, aps a puberdade. Estes tbulos formam praticamente 80% da massa testicular. Todos os tbulos seminferos iniciam e terminam numa regio do testculo denominada mediastino testicular. So constitudos pelos seguintes tipos celulares: - Clulas da Linhagem Seminal: So as clulas que daro origem aos espermatozides. Estas sofrem uma srie de modificaes para formar o gameta masculino, que ser lanado na luz do tbulo seminfero. Os estgios celulares mais desenvolvidos, se encontram mais prximos luz do tbulo. - Clulas de Sertoli: Formam a sustentao do tbulo. Alm desta funo, ainda so responsveis pela nutrio das clulas da linhagem seminal, controlam a entrada e sada de substncias para a luz do tbulo, produzem inibina e ABP (Protena Ligadora de Andrgenos), e so os principais constituintes da Barreira Hemato-Testicular.. Entre os tbulos seminferos so encontradas as clulas de Leydig, tambm conhecidas por clulas intersticiais. Estas clulas no fazem parte da constituio do tbulo seminfero e so encontradas formando pequenas populaes. So de grande importncia na produo de hormnios, principalmente a testosterona.

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FIGURA 2: Arranjo dos tbulos seminferos no testculo.

3.2 - TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE ESPERMAZIDES NO MACHO A seguir esto descritos os processos pelos quais os espermatozides lanados na luz do tbulo seminfero, chega cauda do epiddimo, e o armazenamento dos mesmos neste local, alm das modificaes ocorridas durante este transporte. O transporte pode ser dividido em 3 etapas: - Transporte do Testculo Cabea do Epiddimo: a velocidade desta etapa do transporte constante e independe da atividade sexual do indivduo. Est relacionada com o ritmo de produo dos espermatozides. O mecanismo de transporte mantido por contraes dos Tbulos Eferentes (conectam o Mediastino Testicular a Cabea do Epiddimo) e batimento dos clios encontrados nas clulas que revestem internamente estes tbulos. Durante esta fase o espermatozide imvel. - Transporte at a Cauda do Epiddimo: A este nvel as foras que promovem o transporte tambm so as mesmas descritas anteriormente. Porm quando se caminha no sentido da cauda, os clios ficam menores a ocorrem em menor quantidade, ficando esta fora cada vez menos efetiva. Durante o transporte at a cauda, o espermatozide sofre vrias modificaes, induzidas pela testosterona, conhecidas como MATURAO ESPERMTICA, que envolvem principalmente: ? Desenvolvimento progressivo da motilidade ? Perda de gua ? Modificaes da membrana plasmtica ? Migrao da gota citoplasmtica (fragmento de citoplasma da espermtide presente na pea intermediria do espermatozide quando este produzido). O transito pelo epiddimo pode ser acelerado por maior atividade sexual. Porm quando se acelera muito este trnsito, com uma maior freqncia de cpulas, os

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espermatozides podem no sofrer de forma adequada a Maturao espermtica, sendo encontrados no smen espermatozides imaturos. O tempo de trnsito do espermatozide pelo epiddimo no bovino, dura cerca de 7 dias. - Armazenamento na Cauda do Epiddimo: Neste nvel, o ducto epididimrio, que forma o corpo e a cauda, possui a luz mais ampla, e clulas com uma menor quantidade de clios. Isto importante para uma maior capacidade de armazenamento dos espermatozides neste local. O tempo de permanncia na cauda limitado. Caso no seja ejaculado, aps o tempo normal de armazenamento, o espermatozide perde a capacidade fecundante, a motilidade e morre. Com a morte ele pode ser eliminado pela uretra, ou sofrer degenerao e ser absorvido. A forma de eliminao predominante varia nas diferentes espcies, embora sempre existam ambas.

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4- ETAPAS DO EXAME ANDROLGICO 4.1. IDENTIFICAO DO ANIMAL: Deve contar com raa, idade, nome, nmero de registro e procedncia do animal. Tambm imprescindvel a correta identificao do proprietrio e propriedade. Em casos de laudos tcnicos para exposies ou leiles, pode-se incluir uma resenha ou mesmo foto do animal. Os dados devem ser dispostos de tal forma que permita, numa consulta futura, uma rpida identificao do animal. Quando se trabalhar com smen congelado, so necessrias informaes sobre o laboratrio, forma de diluio, diluidor e forma de congelamento, alm dos dados do reprodutor, geralmente impressos na palheta, assim como do proprietrio do material. 4.2- HISTRICO E ANAMNESE Inicialmente importante o motivo da avaliao androlgica. Caso seja apenas uma exame de rotina, visando constatar a fertilidade do animal, para o caso de comrcio, feiras ou exposies ou mesmo previamente a uma estao de monta, esta situao deve ser considerada e indicado no laudo que trata-se de um EXAME DE ROTINA. Ateno especial para o histrico e a realizao de anamnese detalhada, registrando ocorrncias no que diz respeito a sade do indivduo, estado sanitrio do rebanho, sistema de monta, nmero de fmeas, fertilidade a campo, condies ambientais, alimentao e quando necessrio dados da ascendncia e descendncia, so importantes quando o motivo do exame for pela suspeita de falha de fertilidade, por qualquer que seja a causa. 4.3- EXAME FSICO GERAL Deve-se avaliar a condio corporal, se necessrio, freqncia cardaca e respiratria, temperatura corporal. importante que o touro seja examinado em estao e em movimento. Ateno especial para o sistema locomotor, verificando os aprumos e leses nos membros que possam prejudicar a monta. Mesmo que discretas, as alteraes de aprumo podem alterar a capacidade de servio do animal, principalmente alteraes nos membros posteriores. A presena de defeitos com caractersticas hereditrias (genticas) tambm deve ser considerada, pois estes desclassificam o animal para reproduo. Quando necessrio, sorologia e exames para deteco de doenas infecto-contagiosas devem ser providenciados. Para touros que sero doadores de smen, estes exames so obrigatrios. Os principais exames so: Sorologia para Leptospirose, IBR, BVD, Leucose e Brucelose, prova intradrmica comparativa para tuberculose, e pesquisa de trichomonas e campilobacter.

4.4- EXAME CLNICO ESPECIAL (SISTEMA GENITAL)

Trata-se do exame clnico dos genitais. Deve-se avaliar cuidadosamente todas as estruturas que so possveis, dependendo da espcie ou do mtodo de diagnstico a ser empregado. Independente do motivo do exame, uma avaliao sistemtica de todos o s rgos citados abaixo deve ser realizada. ? Deve-se avaliar as estruturas: Escroto o Para avaliao da bolsa escrotal cuidado especial deve ser tomado, pois alguns touros reagem de forma imprevisvel ao simples toque nesta regio. No deve-se abordar o animal pela lateral, a no ser que os membros

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posteriores estejam devidamente contidos. O correto que o touro esteja devidamente imobilizado em um brete de conteno e que a abordagem seja feita por traz do animal, tracionando os testculos entre os membros posteriores. Nesta avaliao da bolsa escrotal deve-se considerar: ? Forma ? Presena de leses ou cicatrizes ? Presena de ectoparasitos ? Espessura da pele ? Aderncia da pele ao testculo ? Testculos e epiddimo o A avaliao dos testculos e epiddimos deve ser realizada juntamente com o exame da bolsa escrotal. Os mesmos cuidados descritos acima so necessrios. Ateno especial para o testculo deve ser dispensada pois sede de grande parte das alteraes de fertilidade em machos bovinos. Os testculos devem ser mveis dentro do escroto. A simetria deve ser comparada tracionando caudalmente as gnadas. A simples inspeo visual pode levar a erros neste exame. Avalia-se nos testculos: ? Simetria e forma (os zebunos tendem a possuir testculos mais alongados e os bovinos de raas europias mais globosos). ? Consistncia e posio (ligeiras tores no so problemticas). ? Mobilidade e sensibilidade ? Biometria testicular (circunferncia, comprimento, largura). Discutido posteriormente. o Os epiddimos devem ser inspecionados juntamente com os testculos. Nos bovinos sua delimitao difcil, com exceo da cauda. Esta estrutura deve ter uma boa projeo, aspecto firme e elstico e ligeiramente granulosa. Quando as outras pores do epiddimo ficam mais aparentes suspeitar de algum processo inflamatrio ou obstrutivo.

Glndulas Anexas o As glndulas anexas ao genital dos bovinos so examinadas por via transretal, pela palpao e ou ultra-sonografia. As glndulas vesiculares, s vezes erroneamente designadas vesculas seminais, so as mais facilmente identificadas. Trata-se de uma glndula par, de tamanho varivel de acordo com a idade e a condio (normal ou no). Esto localizadas no assoalho da pelve, caudalmente bexiga. Nos bovinos a prstata dividida em duas partes. A poro disseminada e o corpo. Apenas este ltimo pode ser avaliado como um pequeno aumento de volume revestindo o incio da uretra plvica. As bulbo-uretrais no podem ser avaliadas via retal em bovinos. As alteraes nestas glndulas so encontradas principalmente nas glndulas vesiculares, visto que anomalias congnitas ou adquiridas na prstata ou bulbo-uretrais so raras nos touros. Nas glndulas vesiculares deve-se avaliar: ? Tamanho ? Simetria ? Consistncia ? Lobulao ? Sensibilidade dor.

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As ampolas dos ductos deferentes tambm podem ser avaliadas por palpao retal. So a poro final dos ductos deferentes que se conectam uretra plvica. Podem ser encontradas prximas s glndulas vesiculares. So descritas anomalias congnitas (aplasia) e alteraes adquiridas, no caso, processos inflamatrios que deixam estas estruturas aumentadas de volume e com maior sensibilidade dolorosa, principalmente em casos agudos. ?

Pnis e Prepcio o Aproveita-se a preparao da genitlia externa para coleta do smen (discutida posteriormente) para avaliao do pnis e prepcio. Ateno especial para touros com prepcio extremamente penduloso, que so mais predisponentes leses traumticas. A inspeo do pnis pode ser feita no momento da colheita do smen. Em casos especiais pode ser necessrio a exposio forada e avaliao mais criteriosa. No pnis e prepcio deve-se observar: ? Presena de leses ou cicatrizes ? Integridade do stio prepucial ? Corrimentos ? Dificuldade de exposio ? Aumentos de volume.

4.5- BIOMETRIA TESTICULAR

Em bovinos, as diversas formas de mensurao do testculo assunto que merece ateno especial, pelos diferentes estudos e correlaes desta caracterstica com variveis produtivas e de fertilidade, e tambm por propostas recentes de alterao nos padres vigentes de medidas testiculares, principalmente a circunferncia escrotal. O permetro ou circunferncia escrotal mnima varia de acordo com a e idade do macho. Vrios trabalhos existem tentando correlacionar tamanho do testculo com fertilidade, visto que 75% do testculo constitudo por tbulos seminferos, onde so produzidos os espermatozides. Existem tabelas de circunferncia escrotal mnima de acordo com raa e idade do animal. Para bovinos europeus, esta medida mnima na idade acima de 30 meses de 35 cm, j em zebunos uma medida um pouco menor aceita como normal na mesma idade, 30 cm. Tabela 1. Circunferncia escrotal mdia (cm) de acordo com a idade para algumas raas bovinas de origem europia Idade (meses) 12 a 14 m 15 a 20 m 21 a 30 m > 30 m Simental 33 35 36 37 Angus e Charols 32 34 35 36 Hereford e Shorton 31 33 34 35 Limousin e Blonde DAquitaine 30 32 33 34

O que se questiona com relao a circunferncia escrotal a validade desta medida como avaliao do volume escrotal, j que esta ltima medida, mais correta, de mais difcil emprego. No se pode comparar, pela circunferncia escrotal, o volume do escroto de dois touros que tenham o formato da bolsa diferente. Nem sempre aquele de menor

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circunferncia possui menor volume. Principalmente no Brasil, a seleo de animais de raa zebuna sempre penalizou touros de menor circunferncia escrotal, sem se preocupar com o formato da bolsa, ou seja, o verdadeiro volume dos testculos. Tabela 2. Classificao de touros de origem indiana de acordo com a circunferncia escrotal (cm) e a idade Idade (meses)
7 a < 12 12 a < 18 18 a 24 24 a 36 36 a 48 > 48 > 60

Excelente
21 26 31,5 35 37 39 > 38

Muito bom
19,5 a < 21 24 a < 26 28,5 a < 31,5 32 a < 35 33,5 a < 37 36 < 39 36 a 38

Bom
17,5 a < 19,5 21,5 a < 24 26 a < 28,5 29 a < 32 30,5 a < 33,5 33 a < 36 33 a < 36

Questio-nvel
< 17 < 21,5 < 26 < 29 < 30,5 < 33 < 33

Outra polmica, principalmente em animais de origem europia, diz respeito s caractersticas de adaptao e produo espermtica de bovinos com testculo de grande circunferncia em ambientes tropicais. Sabidamente os testculos de maior circunferncia possuem maior raio, e portanto uma maior dificuldade de termorregulao, caracterstica muito importante para fertilidade em condies tropicais. Em estudo recente publicado pelo rgo oficial de divulgao da Raa Simental, os animais com circunferncia escrotal mais elevada, dentro dos padres avaliados, campo, apresentaram-se mais sensveis alteraes devido temperaturas elevadas. despeito destas consideraes recentes, que no devem ser desprezadas, existem vrios trabalhos indicando correlaes entre a circunferncia escrotal e outras caractersticas de produo e reproduo. Uma mdia reunindo resultados de 8 destes trabalhos est na tabela abaixo. Tabela 3. Caractersticas relacionadas circunferncia escrotal Caracterstica Repetibilidade Herdabilidade Correlao com: Peso dos testculos Idade puberdade da prognie Produo espermtica Anormalidades espermticas Peso ao nascimento
( ) Nelore

ndice 98% 67% 92% (81%) -92% 81% -46% 8%

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4.6- COMPORTAMENTO SEXUAL Caractersticas relacionadas ao comportamento sexual devem ser avaliadas sempre que possvel, principalmente quando se utiliza a coleta por eletroejaculao. Quando no for avaliada esta caracterstica, no laudo deve constar: Comportamento sexual: NO AVALIADO. Esta atitude importante para resguardar o Veterinrio que emitiu o laudo do exame, pois nem sempre possvel analisar esta caracterstica. Por outro lado, no possvel atestar que um macho frtil apenas pelos exames clnicos e avaliao do smen. possvel um touro normal aos exames clnicos geral e especial, ao espermograma e totalmente sem libido. Como afirmar que este macho frtil ? A avaliao deve seguir uma seqncia previamente estabelecida que envolve cortejo, ereo, protuso do pnis, procura, introduo, ejaculao e perodo refratrio. Todas as atitudes devem ser anotadas e posteriormente avaliadas. Existem vrios mtodos todos de classificao do comportamento sexual dos machos. Porm a maioria definida para animais de origem europia. Deve-se dar preferncia para os testes simples e de curta durao, O mtodo descrito por CHENOWETH atualmente o mais usado. Consiste em colocar em um curral (contida) duas ou mais vacas fora estro com cada touro para exame. Todas as manifestaes do reprodutor dentro de um perodo de 10 minutos devem ser anotadas. TESTE DE CAPACIDADE DE SERVIO Tempo de durao: 10 minutos ? ? ? ? Pode-se testar mais de um touro por vez (se isto for feito selecionar animais de tamanho e idade semelhante) Colocar uma vaca em cio para cada touro a ser testado. (se 5 touros, usar 5 vacas, que podem estar presas por cabrestos ou soltas num curral) No colocar muitos touros juntos, pois talvez no se consiga observar atentamente cada um. Se em menor de dez minutos um touro completar 2 servios ele j pode ser retirado do teste.
Atitude Nenhum interesse sexual Interesse apenas uma vez (exemplo cheirar a vulva da fmea) Interesse pela fmea em mais de uma ocasio Perseguio da fmea com continuo interesse sexual Uma tentativa de monta, sem completar servio Duas tentativas de monta, sem completar servio Mais de duas tentativas de monta, sem completar servio Um servio completo sem interesse sexual posterior Um servio completo com interesse sexual posterior Dois servios completos sem interesse sexual posterior Dois servios completos com interesse sexual posterior

Nota 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Independente de padres de avaliao, quando possvel sempre bom avaliar as atitudes de um touro frente a uma fmea, preferencialmente em cio. De posse destas informaes o laudo do exame androlgico fica mais consistente e confivel.

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4.7- ESPERMOGRAMA uma das etapas mais importantes para se predizer a fertilidade de um animal. Porm cuidados nos processos de coleta e avaliao do smen devem ser tomados a fim de evitar artefatos de tcnica que podem levar a comprometer a avaliao de um animal que na verdade possui uma boa fertilidade, e que devido a alteraes aps a coleta teve a qualidade do seu smen alterada. Mtodos de coleta de smen Existem diferentes mtodos de coleta de smen em bovinos. Alm do tipo de mtodo empregado, as caractersticas seminais podem variar caso no seja respeitado um repouso sexual prvio que deve variar entre 2 e 8 dias. O mtodo de coleta deve constar no laudo o certificado de androlgico, pois algumas caractersticas so pouco confiveis em determinados mtodos. Independente do mtodo, alguns cuidados como tricotomia dos pelos do prepcio e lavagem da cavidade prepucial com soro fisiolgico so fundamentais, principalmente quando se pretende congelar o smen obtido. Deve-se proteger o ejaculado da luz e evitar excesso de agitao. Todos os equipamentos e materiais que forem entrar em contato direto com a amostra de smen devem estar limpos e a uma temperatura entre 35 e 38o C. A retirada de uma pequena amostra do ejaculado para anlise deve ser precedida por uma leve homogeneizao do smen, para que esta seja representativa. A - Vagina Artificial Quando possvel o mtodo de coleta de smen a ser utilizado em touros. o mtodo que fornece smen de melhor qualidade nesta espcie, ou seja, o mais semelhante ao que seria depositado na vagina de uma fmea, coberta pelo touro avaliado. Na presena de uma fmea, em estro ou no, ou de um manequim, aps a monta e exposio, o pnis do macho e desviado e introduzido na vagina artificial. O ejaculado e captado em um recipiente apropriado, conectado em uma extremidade do cone da vagina. Fornece smen de boa qualidade devido a pouca variao da condio natural de ejaculao, mais fcil controle de choques trmicos e contaminaes. A principal limitao para a utilizao da vagina artificial o condicionamento dos touros. So poucos os animais de origem europia, sem condicionamento que permitem este mtodo de colheita, e um nmero menor ainda de touros de raas zebunas. A utilizao de uma fmea em cio como manequim, aumenta as possibilidades de sucesso na coleta, assim como melhora as caractersticas seminais. A vagina artificial deve ser montada com gua entre 50 e 52oC, pois o contato com as partes mais frias faro com que a temperatura no momento da colheita estejam em torno de 45oC. Esta temperatura deve ser monitorada com um termmetro antes da colheita. A complementao da presso da vagina deve ser feita com ar. Cuidados especiais devem ser tomados com a contaminao da mucosa, principalmente quando se pretende congelar a amostra de smen. Atualmente tem-se recomendado a lubrificao da vagina com gel KY? (Jonhson). Cuidados especiais no caso de coleta com vagina artificial: ? Conteno adequada da vaca ? Higienizao da regio perineal e bloqueio da possibilidade de penetrao ? Piso adequando para o animal ? Ateno para o maior risco de acidentes com o operador.

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B - Eletroejaculao Consiste na induo artificial do reflexo de exposio do pnis e ejaculao, cujos centros controladores se situam a nvel da regio sacral da medula. Um eletrodo bipolar introduzido no reto do animal e acoplado a uma fonte que produz impulsos eltricos de 2 a 5 volts e 0 a 750 mA. Os estmulos so executados de forma intermitente aumentado gradativamente a intensidade e a freqncia. Alguns animais ejacular sem expor o pnis. O smen produzido geralmente mais diludo devido a uma maior estimulao das glndulas anexas. Nestes casos, a caracterstica volume do ejaculado e concentrao de espermatozides no deve ser to considerada. O eletrodo deve ser lubrificado, e antes da introduo devem ser removidas as fezes presentes no reto do animal. um mtodo que tem a vantagem de poder ser usado a campo, no necessitando de um condicionamento do animal, alm de oferecer poucos riscos para o operador. Emprega-se quando no possvel a coleta por vagina artificial. Para a eletroejaculao o touro deve estar bem contido. necessrio a utilizao de bretes de conteno e se possvel a passagem de cordas ou talas que impeam que o animal caia dentro do brete durante a coleta. Ateno especial tambm para movimentos bruscos ao incio do processo. Estes podem levar a leses do reto, caso a pessoa que esteja segurando o eletrodo no tenha a ateno necessria. C - Massagem das ampolas e glndulas vesiculares um processo pouco usado devido a dificuldade de se coletar smen de boa qualidade, que possa refletir a fertilidade do animal. utilizado como alternativa quando no se pode empregar a vagina artificial ou eletroejaculao. Pode ser, segundo alguns autores o mtodo preferencial para touros de raas de dupla musculatura (Piamontes ou Belgian Blue). Anlise do smen A - Caractersticas fsicas . Aspecto Trata-se de uma avaliao visual, dependente principalmente da concentrao espermtica. Numa escala decrescente de concentrao, o smen pode apresentar aspecto cremoso, leitoso, opalescente ou aquoso. Cor A cor do smen bovino varia de esbranquiada, passando pelo marfim indo at o amarelo claro. So estas as coloraes normais. Cuidado especial para se verificar se a colorao amarelada no se trata de contaminao com urina. Cores como o vermelho, marrom ou cinza, no so normais, indicando respectivamente sangue vivo, sangue hemolisado e sujeira excessiva. Volume Deve ser mensurado no prprio recipiente que recebeu o smen, evitando assim choque trmico, perda de material e risco de contaminao. uma caracterstica que possui ampla variao. As principais causas de aumento de volume so: Estimulo de uma fmea em estro, eletroejaculao e contaminao com gua ou urina. As causas de reduo so

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animais jovens, uso excessivo e vesiculite. Na vagina artificial o volume deve variar entre 3 e 8 ml. No to considerado nos casos de coleta por eletroejaculao. B- Caractersticas Microscpicas Turbilhonamento (movimento em massa) descrito como formao de 'ondas' em uma gota de smen. Est diretamente relacionado a trs caractersticas fsicas do smen, a concentrao, a motilidade e o vigor. expresso numa escala de 0 a 5 sendo observado no microscpio em aumento de 100X, numa pequena gota em lmina, sem lamnula. O item, como pode ser influenciado por vrios fatores, no considerado como desclassificatrio, embora desejvel sempre um valor superior a 3. Tal caracterstica percebida em smen de ruminantes. Motilidade (progressiva) uma medida percentual do nmero de espermatozides mveis. Observa-se uma gota de smen entre lmina e lamnula num aumento de 100 a 400X, verificando-se o percentual de espermatozides com motilidade progressiva. Caso o smen esteja muito concentrado, pode-se dilu-lo em soro fisiolgico (pr-aquecido) para esta avaliao. Para testes na propriedade, a motilidade mnima deve ser de 50%. Para animais destinados a doar smen este nmero no deve ser inferior a 70%. Para smen congelado a motilidade deve ser superior a 30%. Vigor Diz respeito vitalidade do movimento dos espermatozides. avaliado de 0 a 5. O valor mnimo para animais em servio em monta natural 3, o mesmo valor usado para smen aps o descongelamento. Concentrao espermtica Diz respeito ao nmero de espermatozides presentes em um determinado volume. Consideram-se apenas os espermatozides com movimentos progressivos. Varia com fatores intrnsecos e extrnsecos, como o mtodo de coleta. Para coleta em vagina artificial, a concentrao normal deve variar entre 300 e 1.200x106 espermatozides/ml. Como j dito, uma varivel de pouco valor nos casos de colheita por eletroejaculao. Esta contagem pode ser feita em cmaras (hematimetria) ou em aparelhos de espectrofotometria apropriados (Micro-cell-counter). O mtodo mais empregado campo e aquele que utiliza a cmara de Neubauer. O smen dever ser diludo em uma soluo de formol salino (apndice). A diluio pode variar de acordo com a expectativa do nmero de espermatozides/ml. Em bovinos normalmente se dilui 200x. Mais raramente pode-se utilizar uma diluio de 100x. A seqncia correta a seguinte: ? Homogeneizar a amostra de smen; ? Retirar uma alquota de 20? l (0,02ml); ? Misturar este volume de smen 4ml de formol salino (diluio 200x); ? Homogeneizar bem; ? Preencher a cmara de Neubauer ; Para a avaliao da concentrao na cmara de Neubauer seguir os procedimentos: ? Preencher ambos os lados da cmara. A contagem final a mdia aritmtica da contagem dos dois lados. ? Contar pelo menos 5 quadrados (maiores);

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? ?

Considerar apenas as cabeas dos espermatozides; Aqueles sobre as linhas, considerar sobre duas linhas e desconsiderar sobre as outras duas;

Exemplo: Considerar os cinco quadrados na diagonal. Considerar as linhas da esquerda e de cima e desconsiderar aqueles sobre as linhas de baixo e da direita. Os espermatozides em preto sero considerados e os em branco no.

Clculo (hipottico) Vamos considerar que o animal forneceu as seguintes caractersticas num ejaculado: ? Volume: 10 ml ? Motilidade 80% ? Diludo o smen 200x, encontrou-se a contagem acima. 12 espermatozides em 5 quadrados. Pergunta-se: A) Qual a concentrao espermtica ? B) Qual o total de espermatozides no ejaculado ? C) Qual o total de espermatozides viveis ? Resposta (A) Para calcular a concentrao espermtica devemos saber inicialmente qual o volume de smen diludo que se encontra na cmara. Sobre os 25 quadrados da cmara, tm-se 0,1mm3 de smen. A largura e o comprimento da cmara de 1mm e a altura de lquido, entre a cmara e a lamnula, de 0,1mm. Neste caso, tem-se: ? 12 espermatozides em 5 quadrados ? = 60 espermatozides em 25 quadrados ? = 60 espermatozides em 0,1mm3 ? = 600 espermatozides/mm3 (smen diludo) ? (x 200 diluio) 120.000 espermatozides/mm3 ? 120.000.000 espermatozides/ml

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Resposta (B) Para se saber o nmero total de espermatozides no ejaculado, basta multiplicar a concentrao pelo volume: ? 120.000.000 espermatozides em 1ml ? (10 ml-volume) 120.000.000 x 10 ? 1.200.000.000 espermatozides no ejaculado Resposta (C) Para se saber o nmero total de espermatozides viveis no ejaculado, basta multiplicar o total de espermatozides pela motilidade e dividir por 100: ? 1.200.000.000 espermatozides no ejaculado ? (x 80% - Motilidade)= 1.200.000.000 x 80 / 100 ? 960.000.000 de espermatozides viveis no ejaculado. Morfologia espermtica Estas caractersticas devem ser observadas em dois tipos de preparaes: Esfregao corado, no qual um esfregao fino de smen feito em uma lmina limpa, sendo este posteriormente corado. Uma das coloraes mais utilizadas a tcnica de Cerowisk (apndice). Outras coloraes, com objetivos especficos tambm existem e so utilizadas quando se pretende avaliar alguma alterao particular nos espermatozides. Na tcnica de esfregao corado, no se consideram algumas alteraes de cauda, pois podem ser resultantes da tcnica. Na preparao mida so observados os espermatozides suspensos em uma soluo de formol salino tamponado, entre lmina e lamnula, sob microscopia de contraste de fase ou interferncia de fase. Utiliza-se geralmente aumento de 1000X ou superior, sob imerso, para observao das caractersticas morfolgicas dos espermatozides. Devem ser contadas pelo menos 200 clulas, sendo estas classificadas em normais ou com algum defeito. As alteraes morfolgicas podem atingir diversas partes do espermatozide, o acrossoma, o ncleo, a cabea, a pea intermediria e a cauda. Vrias so as classificaes existentes para avaliao da morfologia espermtica, o Colgio Brasileiro de Reproduo Animal indica atualmente aquela proposta por BLOM (1972), onde as alteraes da morfologia so classificadas como defeitos maiores e menores. Defeitos maiores So considerados defeitos maiores aqueles relacionados com a espermatognese, com patologias do testculo, que interferem na fertilidade do animal. Principais defeitos maiores: Defeitos de cabea ? Subdesenvolvida ? Cabea isolada anormal ? Estreita na base ? Piriforme ? Pequena anormal ? Contorno anormal ? Diadema (Pouch formation) ? Formas Teratolgicas

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Defeitos de acrossoma ? Knobbed ? Destacamento ? Granuloso Defeitos de pea intermediria ? Pseudogota ? Desfibrilao ? Fratura ? Edema Defeitos de Cauda ? Gota citoplasmtica proximal ? Fortemente dobrada ou enrolada ? Dobrada com gota ? Corkscrew ? Enrolada na cabea Defeitos menores So aqueles relacionados problemas ocorridos durante a migrao pelo epiddimo ou durante o tempo de armazenamento. Alguns autores incluem aqui tambm defeitos induzidos pela manipulao. No comprometem tanto a fertilidade do animal. Defeitos de cabea ? Delgada ? Gigante, curta, larga, pequena normal ? Cabea isolada normal Patologia de cauda e implantao ? Retroaxial ? Abaxial ? Oblqua ? Dobrada ou enrolada ? Gota citoplasmtica distal Outros elementos: Tambm podem ser encontrados, principalmente no esfregao corado, alguns elementos no espermticos que se presentes no ejaculado podem sinalizar processos patolgicos ? Medusas Encontradas em degeneraes testiculares graves. Trata-se de uma clula da linhagem seminal que ao passar pelos tbulos eferentes atraem os clios destas clulas para si. ? Clulas primordiais Clulas da linhagem espermatognica que se desprendem do epitlio germinativo. Tambm presentes em casos de degenerao severa. ? Clulas gigantes Originam-se de clulas da linhagem espermatognica que se fundem. Tambm so indicativas de degenerao testicular. ? Leuccitos Encontrados nos processos inflamatrios dos testculos, epiddimos e glndulas anexas. ? Hemcias Revelam hemorragia em alguma poro do genital.

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? Clulas epiteliais Em pequena quantidade no tem significado patolgico. Indicam descamao normal do genital. ? Colnias de bactrias Processo infeccioso em alguma poro do genital ou contaminao da amostra de smen. Exames complementares So aqueles no considerados obrigatrios na avaliao androlgica, mas que devem e podem ser utilizados a critrio do tcnico. Geralmente tem como finalidade avaliar alguma caracterstica ou situao particular. Teste de Termorresistncia ? Teste de termorresistncia (TT): A amostra seminal permanece por cinco horas incubada a uma temperatura de 38oC. ? Teste de termorresistncia rpido (TTR): A amostra seminal permanece por trinta minutos incubada a uma temperatura de 46oC. ? Teste de termorresistncia estressado(TTS): A amostra seminal permanece por cinco horas incubada a uma temperatura de 38oC. So consideradas aptas as amostras que aps o teste apresentarem pelo menos 15% de espermatozides com motilidade progressiva. Exames sorolgicos Os principais exames sorolgicos em touros so para: Brucelose, IPV/IBR, DVB, Leptospirose, Lngua Azul. Exames microbiolgicos Entre vrios outros, os principais so as avaliaes da presena de: Campilobacter, Trichomonas, Pseudomonas, Brucella etc. Ultra-sonografia. O conhecimento ultra-sonogrfico pode ser de grande utilidade principalmente nos aumentos de volumes inespecficos da bolsa escrotal (traumas, hidrocele, hrnias). Para efeitos de comercializao devem ser observadas as normas de sanidade publicadas pelo Ministrio da Agricultura.

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5- DIAGNSTICO E CONCLUSO

importante salientar que a avaliao androlgica apenas uma predileo da possvel fertilidade do animal. Existe a possibilidade de falhas nestes exames, tanto fornecendo resultados falso-positivos, como falso negativos. Para minimizar estas falhas, considerar para a formulao do diagnstico final, o maior nmero de variveis, e sempre incluir a fertilidade do animal campo, quando possvel. Indicaes do Colgio Brasileiro de Reproduo Animal para padres mnimos de caractersticas seminais: Monta natural ? Motilidade espermtica acima de 70% ? Turbilho >2 ? Vigor: > 3 ? Anormalidades espermticas < 30% Doadores de smen (portaria SDR-26 ; 05/09/96) Smen congelado (descongelado a 35-37o C) ? Volume: >0,25 ? Motilidade progressiva: >30% ? Vigor: >3 ? Espermatozides viveis: 10x106 ? Defeitos totais: < 30% ? Defeitos maiores: < 20%

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CLASSIFICAO ANDROLGICA POR PONTOS (CAP) Recomendaes da Sociedade Americana de Teriogenologia (American Society for Theriogenology). De acordo com as medidas de circunferncia escrotal, motilidade e patologias espermticas, os t ouros so classificados como potencialmente satisfatrios, questionveis ou insatisfatrios para o exerccio de atividade reprodutiva a campo. As tabelas abaixo apresentam as pontuaes recebidas por cada touro de acordos com exames realizados. Tabela 4. Classificao da circunferncia escrotal de acordo com a idade em meses para bovinos das raas europias Categoria Muito boa Boa Pequena 12-14 >34 30-34 <30 14-20 >36 31-36 <31 21-30 >38 32-38 <32 >30 >39 34-39 <34 Escore 40 24 10

Tabela 5. Classificao da circunferncia escrotal de acordo com a idade em meses para bovinos das raas indianas Categoria Muito boa Boa Pequena 16 a 18 >26 23 a 26 <23 18 a 24 >32 27-32 <27 25 a 30 >35 28-35 <28 31 a 36 >37 33-37 <33 >30 38 35-38 <35 Escore 40 24 10

Tabela 6 . Classificao da motilidade espermtica. Motilidade Categoria Muito boa Boa Fraca Ruim Geral
Turbilho

Individual
Vigor

Escore 20 12 10 3

Ondas vigorosas (35) Ondas lentas (1-2) Sem ondas (0) Movimentos espordicos

Rpida linear (4-5) Moderada Linear (2-3) Lenta Linear (1) Muito lenta e errtica (0)

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Tabela 6. Classificao da patologia espermtica (%) para o smen bovino Motilidade Categoria Muito boa Boa Fraca Ruim Def. Maiores <10 10-19 20-29 >29 Def. totais <25 26-39 40-59 >59 Escore 40 24 10 3

Para a classificao dos touros, somam-se todos os pontos obtidos e de acordo com a pontuao final, eles recebem as seguintes denominaes: ? ? ? ? 60 pontos: Potencial satisfatrio 30 a 60 pontos: Potencial questionvel ? 30 pontos: Potencial insatisfatrio

As duas classificaes, a brasileira e a americana, refletem a busca do homem de determinar de uma forma numrica, matemtica, de forma inquestionvel a fertilidade dos animais. Contudo, como em todos os sistemas biolgicos, aplicaes de frmulas, matemticas ou no, podem conduzir a erros grosseiros. Antes de aprovar ou reprovar um determinado touro, deve-se levar em conta todas as observaes realizadas durante o exame do animal. Ateno especial deve ser dada aos defeitos espermticos no compensatrios. Animais com nveis muito elevados destas patologias tem diminuio importante na fertilidade. De maneira geral para um touro ser considerado um bom reprodutor deve apresentar: boa libido, pnis livre de leses de qualquer natureza, de tamanho e forma normais, resultados negativos para doena infecto-contagiosas, principalmente as de carter venreo, testculos normais presentes no interior da bolsa escrotal, habilidade potencial para ejacular no mnimo 1 x 109 espermatozides com motilidade progressiva e morfologicamente normais e circunferncia escrotal compatvel com a raa e a idade. Outra considerao importante que os resultados obtidos so relativos ao momento do exame, no sendo possvel fazer extrapolaes futuras ou passadas da sanidade reprodutiva do animal. Quando um animal for reprovado no exame, de maneira geral, recomenda-se a realizao de no mnimo um novo exame, 60 dias depois para caracterizar a evoluo do problema e embaar melhor o prognstico reprodutivo. Outras vezes os exames devem ser repetidos a intervalos menores, a t de horas, para identificao da natureza do problema apresentado pelo animal. Como em qualquer atividade humana, o bom senso e o conhecimento fisiolgico devem nortear as decises do mdico veterinrio durante a avaliao androlgica.

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6- CRIOPRESERVAO DO SMEN A maior demanda referente aos aspectos econmicos gerada pela bovinocultura proporcionou o desenvolvimento de tecnologias que permitem a criopreservao dos espermatozides de bovinos. O congelamento de clulas vivas se baseia na troca de gua, solutos e calor entre as clulas e o meio. Um dos princpios bsicos que sempre deve haver uma desidratao parcial, anteriormente ao congelamento. Isto importante pelo fato que a gua na forma slida (gelo), possui um volume maior que na forma lquida. Se o congelamento fosse feito sem a desidratao, quando a gua mudasse de fase, haveria ruptura de organelas celulares, e mesmo da prpria clula, levando a sua morte. Como dito anteriormente, o principio bsico proteger o interior das clulas, dos cristais formados durante a congelao. A gua deve ser retirada durante a congelao e reintroduzida durante a descongelao de uma forma que evite leses s clulas. Tanto uma desidratao muito intensa (exposio a solues com altas concentraes de sais por perodos prolongados) ou inadequada (velocidade de congelamento muito rpida), so responsveis por danos ao embrio. Uma curva de resfriamento ideal aquela suficientemente lenta para impedir a formao de grandes cristais intracelulares e suficientemente rpida para minimizar o efeito deletrio da exposio a solues com altas concentraes de solutos. Para o congelamento, utiliza-se de solues compostas de vrias substncias adicionados de crioprotetores. O crioprotetor mais utilizado para espermatozides o glicerol. considerado crioprotetor intracelular. Alm de promover uma desidratao parcial do espermatozide, pela perda de gua para o meio, penetra na clula, fazendo com que os cristais de gua formados durante o congelamento sejam menores, reduzindo os riscos de leso celular, e tambm reduzem a temperatura na qual ocorre a congelao do meio. Geralmente ocorre uma queda na viabilidade de parte dos espermatozides, mesmo quando o processo ocorre perfeitamente. Diluentes de smen Existem vrios tipos de diluentes ou diluidores de smen. As substncias que compem podem variar. Independente da frmula do diluente a maioria deles possui um ou mais componentes que desempenham as seguintes funes: TAMPES Tm a funo de impedir grandes variaes de pH, que poderiam alterar a viabilidade dos espermatozides. Existem tampes orgnicos (Tris) e os inorgnicos (Citratos, fosfatos etc.) SUBSTNCIAS NUTRITIVAS Visam manter a viabilidade dos espermatozides da amostra enquanto os mesmos esto em atividade. Geralmente so carbohidratos de baixo peso molecular como glicose, frutose ou lactose (ou outros) ou aminocidos como a glicina. ESTABILIZANTES DE MEMBRANA So substncia de tm a funo de preservar a integridade das membranas plasmtica e das organelas e proteger contra os efeitos de baixas temperaturas. Geramente esta funo e desempenhada pela Lecitina encontrada na gema de ovo ou no leite (desnatado). Alguns diluentes utilizam esta substncia na sua forma pura.

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CRIOPROTETORES Imprescindveis nos diluentes para congelamento. Estas substncias funcionam como agentes desidratantes e tambm penetram nas clulas induzindo a formao de cristais de gelo de menor tamanho durante o congelamento. Isto importante para evitar danos intracelulares. O componente mais utilizado o Glicerol. Age tambm estimulando o consumo de oxignio pelos espermatozides. INIBIDORES DE CRESCIMENTO MICROBIANO Antibiticos e s vezes antifngicos so acrescentados para evitar a proliferao excessiva de micro-organismos. O tipo e proporo deste pode variar de acordo com a formulao original, porm no devem afetar a viabilidade dos espermatozides na amostra a ser criopreservada. 6.1 - Clculo do nmero de doses de uma amostra A seguir descreve-se um exemplo do nmero de doses de smen possveis de se obter em uma amostra (hipottica). Dados (hipotticos) ? Volume: 8 ml ? [SPTZ]: 800,000,000/ml ? Motilidade progressiva: 60% Pergunta-se: 1. 2. Qual o nmero de doses de smen que esta amostra forneceria? Qual a quantidade de diluente a ser utilizada? * deve-se congelar a campo pelo menos 30.000.000 sptz viveis/dose Clculo 1. ? ? ? ? ? Nmero de doses

800.000.000 sptz/ml Em 8 ml 6.400.000.000 SPTZ viveis: 6.400.000.000 x 0,6 = 3.840.000.000 3.840.000.000 / 30.000.000 (sptz por dose) 128 doses

2. Quantidade de diluente Cada palheta mdia tem um volume interno de 0,54 ml ? 128 palhetas x 0,54 ml = 69,12 ml (volume total) ? Volume total = smen (8 ml) + diluente

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? Diluente = 61,12 ml PASSOS PARA O CONGELAMENTO 1. Analisar a amostra de smen e verificar se possvel o congelamento 2. Proceder aos clculos de volume, concentrao, motilidade e calcular o nmero de doses a serem congeladas (amostra mantida no banho-maria a 35 - 37 C. 3. Acrescentar ao smen a quantidade necessria do diluente de forma bem lenta, homogeneizando a amostra simultaneamente. O diluente deve estar mesma temperatura do smen. 4. Envasar em palhetas finas ou mdias conforme clculo inicial. Este pode ser feito temperatura ambiente o mais rpido possvel. 5. Colocar as palhetas em geladeira por 90 a 120 minutos. No se deve abrir a geladeira aps a colocao das palhetas. A geladeira deve estar estabilizada previamente em 5 C. 6. Retirar as palhetas da geladeira e colocar as mesma na posio horizontal, sem sobreposio, a uma distncia de 4-5 cm da superfcie do nitrognio lquido, em uma caixa de isopor. No deixar as palhetas tocarem no nitrognio. Estas devem permanecer com a caixa fechada nesta posio por 15 a 20 minutos. 7. Mergulhar as palhetas diretamente no nitrognio lquido. 8. Esperar o final da produo de vapor e descongelar uma dose (35 C/ 40segundos em banho-maria) para analisar. 9. A anlise definitiva deve ser feita pelo menos 2 dias aps o congelamento.

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LEITURA COMPLEMENTAR. American Society for Theryogenology Manual Bovine practice Camp, S.D.V. Bull Infertility, The Veterinary Clinics of North America Food animal practice, v.13, n.2, 1997. Dirksen, G., Grnder, H, Stber, M. Rosemberg Exame clnico dos bovinos, 3 ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro-RJ, 1993, 419p. Fonseca, V.O. et al. Procedimentos para exame androlgico e avaliao de smen animal, 1a edio. Colgio Brasileiro de Reproduo Animal, Belo Horizonte, 1992, 79p. Manual para exame androlgico e avaliao de smen animal, 2 ed. Colgio Brasileiro de Reproduo Animal, Belo Horizonte, 1998, 47p. Mies Filho, A. Reproduo Animal e Inseminao Artificial. 5 ed., Sulina, Porto Alegre- RS, 1982, 783p. Nunes, I. J. Andrologia Parte 1. Cadernos Tcnicos de Md. Veterinria e Zootecnia. Agosto de 2001. FMPZ Editora, Belo Horizonte-MG, 2001, 83p. Nunes, I. J. Andrologia Parte 2. Cadernos Tcnicos de Md. Veterinria e Zootecnia. Janeiro de 2002. FMPZ Editora, Belo Horizonte-MG, 2002, 93p. Radostits, O..M., Leslie, K.E., Fetrow, J. Herd Helth: Food animal production medicine. 2 ed., W.B. Saunders Company, Puiladelphia, 1994631, 419p.

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APNDICE 1) Esfregao corado A) colorao de Vermelho Congo (Cerowisk) ? Fazer um esfregao fino do smen e secar ? Imergir por 1' em soluo saturada de Vermelho congo ? Lavar e secar ao ar ? Imergir por 30'' em soluo de Violeta genciana a 0,5% ? Lavar, secar e examinar B) Colorao de Willians ? Fazer um esfregao fino do smen e secar ? Lavar em lcool etlico absoluto por 4' ? Lavar em Cloramina a 2% para retirar o muco por 10' ? Lavar em lcool etlico a 96% ? Imergir na soluo corante por 3 minutos ? Lavar em gua e secar OBS: Soluo corante - 2 partes de Soluo de Fuccina bsica a 10% em lcool etlico e fenol a 5% (1:1) e 1 parte se soluo saturada de eosina azul em lcool etlico. C) Eosina-citrato (vivos e mortos) ? Uma gota de smen e uma gota de corante ? Misturar e esperar 1' ? Fazer esfregao e secar imediatamente em chama ? Observar sob imerso (cora os espermatozides mortos) OBS: Soluo corante: 5g de eosina azul/100ml de soluo de Citrato de sdio.

FORMOL SALINO (Hancock)

Soluo estoque NaCl gua destilada Soluo 1 Na2HPO4 gua destilada qsp Soluo 2 K2HPO4 gua destilada Formol Salino 9,01g 500 ml

21,68 500 ml

11,13g 500 ml

Soluo estoque Soluo 1 Soluo 2 Formol (40%) gua destilada (qsp)

150 ml 71 ml 29 ml 62,5 ml 500 ml

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