Anda di halaman 1dari 18

PEMERIKSAAN

Vibrio cholerae
Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Laboratorium Epidemiologi
Dosen pengampu : drg. Yunita Dyah Puspita Santik

Disusun Oleh :
KELOMPOK 8
1. Luluk Listiarini Riza (6411411198)
2. Ellya Maunah (6411411199)
3. Charisna Neilal Muna (6411411201)
4. Sundari Sukoco (6411411210)
5. Hamid Rifki Baharun (6411411257)
Rombel 01

JURUSAN ILMU KESEHATAN MASYARAKAT
FAKULTAS ILMU KEOLAHRAGAAN
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
Pemeriksaan Vibrio cholerae






Gambar Bakteri Vibrio Cholerae
Vibrio cholerae merupakan salah satu spesies dari genus Vibrio yang
merupakan famili Vibrionaceae. Genus Vibrio terdiri lebih dari 30 spesiesyang
biasanya ditemukan pada lingkungan perairan. Vibrio yang pathogen terhadap
manusia adalah Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus dan Vibrio vulnificus.
Vibrio cholerae merupakan penyebab penyakit Cholera yaitu infeksi saluran usus
yang bersifat akut dan disebabkan oleh bakteri Vibrio cholerae. Bakteri ini masuk
kedalam tubuh host secara per oral umumnya melalui makanan atau minuman
yang tercemar. Cholera dapat menular sebagai penyakit yang bersifat epidemik.
1. Tujuan
Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian Vibrio cholerae pada
produk perikanan dan produk makanan yang berkaitan dengan hasil hasil
perikanan.

2. Acuan
Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.4-2006

3. Media dan Reagensia :
a. Alkaline Peptone water (APW)
b. Alkaline Peptone salt (APS)
c. Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen arginine,
lysine dan ornithine secara individual
d. Kliger Iron Agar ( KIA)
e. Motility Test Medium (MTM), semisolid
f. MRV-VP Broth
g. Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen sucrose,
lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual
h. Of medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose, sucrose,
lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual
i. Triple Sugar Iron (TSI) agar
j. Thiosulfate-citrat-Bile-Salt-Sucrose (TCBS) agar
k. Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)
l. Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)
m. Tryptone Broth and Tryptone salt Broths (T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,
T1N8, T1N10)
n. Urea Broth
o. Pereaksi Kovacs
p. Mineral atau parafin oil steril
q. O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 g dan 150 g
r. ONPG disk
s. Pereaksi oksidase
t. HCL 1 N
u. Physiological saline 0,85%
v. Phospate-buffered Saline (PBS)
w. NaCl 2 % dan 3 %
x. Larutan NaOH 1 N
y. Pereaksi VP
z. Pereaksi pewarnaan gram
aa. Baku pembanding Vibrio cholerae
bb. Anti serum Poly hikojima inaba ogawa
4. Peralatan
a. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher beserta plastik
steril.
b. Cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm
c. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan 13 mm x 100 mm
d. Tabung bertutup ukuran 16 mm x 150 mm
e. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan 0,0001 g
f. Inkubator 36 C 1 C
g. Waterbath 42 C 0,2 C
h. Autoclave 121 C.
i. Jarum inokulasi dan jarum ose
j. Bunsen
k. pH meter
l. Peralatan sterilisasi filter
m. Oven
n. Pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.
o. Mikroskop
p. Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer.
q. Alat pengocok (Voltex mixer )
No Nama Alat Gambar
1.



Tabung reaksi


2.



Rak tabung reaksi


3. Kaca preparat

4.



Pipet

5. Inkubator

6. Jarum ose

7. Mikroskop


5. Kondisi Pengujian
Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis dan lakukan pengujian
diruang atau laminar air flow yang terkontrol. Media TCBS agar yang
digunakan harus dalam keadaan kering.

6. Pengambilan contoh
a. Ikan Jaringan daging, saluran pencernaan dan insang.
b. Crustacea Jika memungkinkan seluruh tubuh atau hanya bagian tengah
termasuk insang dan saluran pencernaan.
c. Kekerangan Daging kerang termasuk cairan dalam cangkang.




7. Prosedur
7.1 Persiapan contoh
a. Produk perikanan selain kekerangan.
Timbang secara aseptis 25 g sesuai butir 7.2.2.1 dan 7.2.2.2.,
kemudian tambahkan 225 ml larutan Alkaline Pepton Water,
Homogenasi selama 2 menit 3 menit. Homogenat ini merupakan
larutan dengan pengenceran 1 : 10.
b. Produk kekerangan
Timbang secara aseptis 50 g sesuai butir 7.2.2.3., kemudian
tambahkan 450 ml larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi
selama 2 menit 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan
pengenceran 1 : 10.
7.2 Isolasi Vibrio cholerae
a. Tanpa mengocok tabung
Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif (keruh) pada setiap
pengenceran sedalam 1 cm dari permukaan cairan dan goreskan
kedalam TCBS agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36
o
C 1
o
C
selama 18 jam 24 jam.





b. Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar.
Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus. Agak datar, bagian
tengah uram dan bagian pinggir terang, berwarna kuning (sukrosa
positif).

Gambar Koloni Vibrio cholerae pada media TCBS

7.3 Pemurnian
Secara hati hati ambil 3 koloni terduga atau lebih dari setiap TCBS agar,
goreskan kedalam T
1
N
1
agar atau TSA + 1,5 % NaCl (Total Mengandung
NaCl 2 %). Inkubasikan selama 18 jam 24 jam pada suhu 36
o
C 1
o
C.

Gambar Media TSA slant
7.4 Uji biokimia pendahuluan
a. Uji Oksidase
Goreskan 1 ose dari T
1
N
1
agar atau TSA + NaCl 1,5 % atau medium
lain yang tidak memfermentasikan karbohidrat kedalam cawan petri
yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 18
jam 24 jam. Teteskan 2 3 tetes pereaksi oksidase pada koloni
bakteri dan amati reaksinya. Reaksi positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat dilakukan
dengan menggunakan kertas oksidase dengan cara menggoreskan
koloni dari T
1
N
1
agar atau TSA + NaCl 1,5 % keatas permukaan
kertas oksidase menggunakan tusuk gigi (jangan menggunakan ose
yang terbuat dari nikel atau krom). Reaksi positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru tua secara cepat.
b. Uji sensitifitas terhadap 0/129 vibriostat
Goreskan 1 ose dengan cepat dari T
1
N
1
agar atau TSA + NaCl 1,5 %
kedalam cawan Petri yang berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk
0/129 10 g dan 150 g pada goresan yang paling rapat dan
inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 18 jam 24 jam. Amati
pertumbuhan disekitar disk . Reaksi sensitif ditunjukkan dengan
terbentuknya zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi resisten
ditandai dengan adanya pertumbuhan disekeliling disk (R). Vibrio
cholerae sensitive terhadap 0/129 g dan 150 g.

Gambar Uji sensitifitas
c. Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar (KIA)
Inokulasikan koloni dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % dengan
cara menggoreskan agar miring dan menusuk agar tegak media TSI
agar dan KIA. Inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 18 jam
24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna kuning) pada agar
miring, asam (warna kuning) pada agar tegak dan tidak mengasilkan
gas serta H
2
S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar miring
yang berbeda dapat dilihat pada tabel 1.

Reaksi Vibrio cholera: TSI (Asam/Asam=A/A) dan KIA
(Alkaline/Asam=K/A)
(Asam=kuning & Alkaline=merah)

Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar yang
berbeda
Bakteri KIA TSI

Agar
Miring
Agar
Tegak
Agar Miring Agar Tegak
v. cholerae K A A (K jarang) A
v. mimicus K A K (A jarang) A
v.
parahaemolyticus
K A K A
v. alginolytus K A A A
v. vulnificus K atau A A K (A jarang) A
a.hidrophilla K atau A A K atau A A
p.shigoleides K atau A A K atau A A
d. Uji ONPG
Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau media lain yang
mengandung lactose. Inokulasikan 1 ose kultur dari TSI kedalam
tabung yang berisi 0,5 ml larutan psysiological saline. Masukkan disk
ONPG lalu inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 20 menit
sampai dengan 1 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya
warna kuning pada media dalam tabung.

Reaksi ONPG negatif (kiri) dan Positif (kanan)



e. Uji Oksidatif fermentatif ( OF )
Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang telah ditambahkan
glukosa 1 % dengan kultur dari T
1
N
1
agar atau TSA + NaCl 1,5 %
tambahkan mineral oil steril setinggi 1 cm 2 cm kedalam salah satu
tabung. Inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 1 hari 2 hari.
Reaksi oksidatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kunimg
(reaksi asam) pada tabung yang tidak ditambahkan dengan mineral
oil, sedangkan reaksi fermentative ditunjukkan dengan terbentuknya
warna kuning pada tabung yang ditambahkan mineral oil. Asam
mengubah media dari warna hijau menjadi kuning.

Uji OF: 2 tabung kiri positif (kuning) dan 2 tabung kanan negatif (hijau)

f. Pewarnaan gram
Lanjutan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas
ditemukan reaksi Vibrio cholerae . Kultur diambil agar miring atau
TSA miring + NaCl 1,5 % yang telah diinkubasi selama 24 jam.
Bakteri Vibrio cholerae termasuk gram negatif, berbentuk batang
pendek atau koma.




7.5 Uji Biokimia Lanjutan
Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas
ditemukan reaksi Vibrio cholerae yang khas. Goreskan kembali kultur
dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % ke TSA dan TSB. Inkubasikan
pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 18 jam 24 jam.
a. Uji Hidrolisis Urea.
Inokulasikan 1 ose dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam media urea.
Inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 18 jam. Reaksi positif
ditunjukkan dengan perubahan warna media dari orange menjadi
merah muda. Vibrio cholerae tidak mempunyai kemampuan dalam
menghidrolisis urea (reaksi negatif).

Urea broth (negatif)

b. Uji Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksilase dan ornithin
dekarboksilase.
Inokulasikan kultur dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam tabung media
dasar dekarboksilase yang masing masing mengandung arginin,
Lysine, ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media dasar
dekarboksilase yang tidak mengandung asam amino. Tambahkan
masing masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm 2
cm. Inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 4 hari. Lakukan
pengamatan setiap hari. Reaksi dekarboksilase terhadap asam amino
menghasilkan pH alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah
(reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi glucose menghasilkan
asam dan mengubah media menjadi warna kuning (reaksi negatif).
Tabung control yang tidak mengandung asam amino berubah menjadi
kuning Vibrio cholerae menghasilkan reaksi arginin dihydrolase
negative, Lysine dan ornithin positif dan orithin decarboxylase positif.

Dari Kiri ke Kanan: Arginine(-), Lysine(+), Ornithin(+), Sucrose(+),
Lactose(-), Arabinose(-), Mannose(-) , Mannitol(+)

c. Uji Toleransi terhadap garam
Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung yang masing masing
mengandung tryptone broth 1 % yang ditambahkan NaCl 0 % ; 1 %
dan 3 % (T1N0,T1N3). Inkubasikan pada suhu 36 oC 1 oC selama
18 jam 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya keruhan
yang menunjukkan pertumbuhan. Vibrio cholerae dalam media T1N0
dan T1N3 (table 2).



d. Uji pertumbuhan pada suhu 42
o
C
Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah diinkubasikan selama 24 jam
kedalam TSB yang telah dihangatkan dalam waterbath 42
o
C.
Inkubasikan pada suhu 42
o
C dalam waterbath selama 24 jam. Reaksi
positif ditandai dengan terjadinya kekeruhan yang menunjukkan
adanya pertumbuhan. Vibrio cholerae mengasilkan reaksi variable.
e. Uji voges-proskauer
Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam MRV VP broth
inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 2 hari. Pindahkan 1 ml
dari setiap MRV VP broth yang menunjukkan pertumbuhan
kedalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril. Tambahkan
0,6 ml larutan alphanaphtol dan 0,2 ml KOH 40 % lalu kocok.
Tambahkan sedikit kristal keratin untuk mempercepat reaksi. Kocok
kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif ditandai dengan
terbentuknya warna merah muda sampai warna merah mirah delima
(ruby) pada media Vibrio cholerae menghasilkan reaksi variable.
f. Uji Fermentasi karbohidarat
Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam masing masing
satu tabung purple broth base yang mengandung sucrose, lactose, D-
mannitol, mannose, arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing
masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm 2 cm.
inkubasikan pada suhu 36
o
C 1
o
C selama 4 hari 5 hari dan
lakukan pengamatan setia hari. Reaksi positif fermentasi karbohidrat
menghasilkan asam dan mengubah media menjadi kuning ( table 2).







7.6 Uji Serologi
Ambil 1 ose kultur dari T
1
N
1
agar atau TSA+ NaCl 1,5 % yang telah
diinkubasikan selama 16 jam 24 jam dan letakkan diatas gelas preparat.
Tetesi dengan larutan saline 0,85 % dan emulsikan. Letakkan 1 tetes
antiserum poly hikojima inaba ogawa disamping suspensi koloni.
Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai
tercampur sempurna. Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan
saline dan antiserum.
Goyangkan campuran tersebut kekiri dan kekanan dan amati reaksi
penggumpalan pada latar belakang yang gelap sebagai berikut :
Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi
penggumpalan pada larutan control.
Negatif apabila tidak terjadi penggumpulan baik pada larutan kultur
maupun larutan control.

8. Interpretasi Hasil
No Jenis Uji Interpretasi Hasil
1 Morfologi Gram negatif, bentuk batang atau koma
2 TSI
Agar miring: asam (kuning) Agar tegak:
asam (kuning)
3
Oksidatif / fermentatif
(media OF)
Oksidatif positif dan fermentatif positif
4 Oksidase Positif
5 Arginin Dehidrolase Negatif
6 Lysine Decarboxylase Positif
7 VP Variabel
8
Pertumbuhan pada suhu
42oC
Positif
9 Halophilik
T1N0; positif; T1N3; positif, T1N6;
negatif
10 Fermentasi Sucrose Positif
11 Fermentasi Arabinose Negatif
12 ONPG Positif
13 Sensitifitas terhadap 0/129 Sensitif (S) terhadap 10 g dan 150 g

9. Pelaporan Hasil
Laporkan ada atau tidak Vibrio cholerae berdasarkan uji biokimia dan
serologi.
















DAFTAR PUSTAKA

Brooks GF dkk. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. EGC
Chin J.2006. Manual Pemberantasan Penyakit Menular. Edisi 17. Infomedika
Shulman ST dkk. 1994. Dasar Biologis & Klinis Penyakit Infeksi. Edisi 4. Gadjah
Mada University Press
Staff pengajar FK UI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Binarupa Aksara
http://elib.fk.uwks.ac.id/asset/archieve/jurnal/Vol%20Edisi%20Khusus%20Dese
mber%202010/CHOLERA.pdf
http://www.cdc.gov/cholera/pdf/laboratory-methods-for-the-diagnosis-of-vibrio-
cholerae-chapter-6.pdf
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3576/1/05010682.pdf