Licda. Mildred Guancn. Supervisora Laboratorio de Androloga. Clnica Santa Mara 2010
La interpretacin de un anlisis de laboratorio deber realizarlo el mdico especialista a cargo, sin embargo es necesario que una pareja que se encuentra bajo constante flujo de informacin sobre las tcnicas de reproduccin asistida, tenga una nocin de qu habla su mdico cuando el Factor Masculino est presente. El espermograma, de acuerdo a las normas de las Organizacin Mundial de la Salud (WHO) en su 4 edicin, establece que debern evaluarse los Aspectos Fsicos (Anlisis Macroscpico) y Anlisis Microscpico (Examen Directo, Concentracin, Movilidad y Morfologa)
Aspectos Fsicos del Semen Volumen El volumen del eyaculado humano ha sido tema de amplio estudio. El eyaculado ocurre de manera sincronizada entre la fraccin Prosttica y la fraccin de las vesculas seminales. La primera fraccin (20-30% del eyaculado) es un fluido blanco no-viscoso proveniente de la prstata y contiene principalmente espermatozoides, as como cido ctrico, zinc, albmina y factores fibrinolticos; sta fraccin inmediatamente interacta con la segunda fraccin (70%), la cual es un fluido amarillento con pH alcalino, fructosa y prostaglandinas proveniente de las vesculas seminales. Ambas glndulas accesorias son dependientes de Andrgenos para su diferenciacin, crecimiento, desarrollo y mantenimiento; son sumamente importantes para la Espermatognesis, ya que proveen el vehculo de movimiento para las clulas flagelares. El volumen normal para una abstinencia de 3-5 das es alrededor de 2ml por eyaculado. Cuando el volumen est por debajo de este valor se le conoce como Hipospermia. Esta condicin puede ocurrir por bajos niveles de Testosterona o en la mayora de los casos, debido a las condiciones de abstinencia y la comodidad al momento de recolectar la muestra en el laboratorio. Es tambin determinante el factor de la edad: pacientes jvenes tienen por lo general volmenes mayores de eyaculado.
pH El semen posee una alta capacidad de regulacin del pH, mucho ms alta que la mayora de los fluidos corporales, sta caracterstica se debe al equilibrio entre las secreciones prostticas y de las vesculas seminales explicadas con anterioridad, as como de sus componentes. El valor de referencia de acuerdo a la Organizacin Mundial de la Salud (WHO por sus siglas en ingls) en la ltima dcada se ha establecido en pH 7.2. El semen mantiene su pH cerca de la neutralidad en el ambiente cido de la vagina con la finalidad de dar oportunidad a los espermatozoides de entrar y moverse en el moco cervical. Si el pH es menor de 7.0 en una muestra con azoospermia, puede que exista una obstruccin de los conductos eyaculatorios o que exista la condicin de Ausencia congnita bilateral de los vasos deferentes.
Viscosidad y Licuefaccin Las propiedades del semen empiezan a cambiar inmediatamente luego de la eyaculacin; el eyaculado inicial rpidamente se coagula formando un material gelatinoso que posteriormente se licua. La licuefaccin ocurre en un perodo de 5 minutos in vivo (dentro de la vagina), pero puede tomar de 20-30 minutos in vitro (es decir fuera del cuerpo). Los factores de coagulacin vienen de las vesculas seminales y los factores de licuefaccin vienen de la prstata. Una medida de la viscosidad es realizada y recomendada por Manual de la OMS (1999), la cual define como una viscosidad anormal a aquella cuyo filamento mide ms de 2 cm, medidos a travs de una pipeta, mientras que una muestra con viscosidad normal se torna lquida en un perodo corto de tiempo. Una viscosidad lquida permite a los espermatozoides moverse correctamente. Es posible que una muestra normal presente pequeos granos gelatinosos, los cuales no se licuan y aparentemente no tienen significado clnico.
Apariencia La muestra de semen deber ser examinada inmediatamente luego de la licuefaccin o si esto no fuera posible antes de una hora, a travs de una simple inspeccin macroscpica a temperatura ambiente. Una muestra de semen normal tiene una apariencia homognea gris-opalescente. Puede observarse menos opaca u opalescente si la concentracin de espermatozoides es muy baja. Es posible encontrar muestras caf-rojizas cuando hay presencia de glbulos rojos, as como muestras amarillentas cuando hay ictericia o cuando se consumen ciertas vitaminas.
Las propiedades fsicas de una muestra de semen proporcionan una perspectiva general de su contenido real. Es de suma importancia estar concientes que si una de las propiedades mencionadas anteriormente se encuentra fuera de los parmetros, no significa en ningn momento que pueda diagnosticarse el Factor Masculino; solamente la completa interpretacin del espermograma, incluyendo la evaluacin Microscpica puede determinar el diagnstico.
Examen Directo Durante la investigacin inicial de la muestra, se obtiene un estimado de la concentracin, movilidad y morfologa de los espermatozoides, as como la presencia de otro tipo de clulas (glbulos rojos/blancos).
Preparacin para Examen Directo a. Colocar un volumen de 10 uL de semen licuado en lmina portaobjeto, cubrir con portaobjeto de 22mmX22. El peso de este cubreobjeto permitir que la muestra se despliegue correctamente, evitar la formacin de burbujas al momento de colocar el cubreobjeto. b. Dejar estabilizar la muestra alrededor de 1 minuto. Observar bajo objetivo de 10X la muestra en busca de agregacin de espermatozoides (nudos espermatozoides) o aglutinacin. c. Observar en objetivo de 40X, establecer un estimado de espermatozoides por campo. Este estimado permitir decidir la dilucin correcta para establecer la concentracin real de espermatozoides en la cmara de Neubauer. Tabla 1. Diluciones y Factores de conversin para Cmara de Neubauer.
Factores de Conversin Nmero de cuadrados contados Espermatozoides por campo (40x) Dilucin Semen+Diluyente 25 10 05 <15 1:5 20 8 4 15-40 1:10 10 4 2 40-200 1:20 (5uL+95uL) 5 2 1 >200 1:50 2 0.8 0.4 Todas las muestras donde no se observan espermatozoides en 40x, debern ser centrifugadas para detectar presencia de espermatozoides en su sedimento. Solamente cuando no se observa ningn espermatozoide post-centrifugado la muestra deber ser clasificada como AZOOSPERMICA.
Determinacin de concentracin espermtica. La concentracin de espermatozoides se determina utilizando la cmara de Neubauer con dos preparaciones de la muestra, una para cada lado de la cmara. Ambas preparaciones con la misma dilucin, la cual fue determinada en el paso previo (1:5, 1:10, 1:20, 1:50). De manera que para una dilucin 1:20 (5uL de semen liquado + 95uL diluyente) DILUYENTE: NaHCO3 50g + Formalina 35%v/v 10ml hasta volumen final de 1 litro con agua destilada. i. Asegure el cubreobjeto de la cmara y transfiera 10uL de la dilucin a ambos lados de la cmara. Cuidar de llenar correctamente la cmara y no mover el cubreobjeto una vez montado. ii. Colocar la cmara de Neubauer en cmara hmeda por 3-5 minutos para dejar reposar la muestra y observar en objetivo de 40x. iii. El conteo se realizar en la cuadrcula central de la cmara. La cuadrcula central de una cmara de Neubauer est formada por 25 cuadros mayores quienes a su vez estn formados por 16 cuadros ms pequeos. Cuntos cuadros se debern contar? Para muestras que contienen menos de 10 espermatozoides en un cuadro grande, se debern contar los 25 cuadros que forman la cuadrcula central. Para muestras que presentan de 10-40 espermatozoides por cuadro, se cuentan 10 cuadros. Para muestras con ms de 40 espermatozoides en un cuadro, se cuentan 5 cuadros nicamente. iv. Para determinar finalmente la concentracin de espermatozoides en la muestra original de semen, en Millones/ml el promedio espermatozoides contados en ambos lados de la cmara se divide dentro del factor de conversin apropiado. Ejemplo: Para un promedio de 230 de espermatozoides contados. Empleando una dilucin 1:20 10 cuadros contados. Empleando la tabla 1 como referencia se obtiene que el factor de conversin es 2 Resultado: 230/2 = 115x10 6 espermatozoides/ml. v. Existen actualmente en el mercado cmaras que no necesitan dilucin para realizar el recuento, tales como la cmara de Makler y la cmara Microcell.
Figura 1. Cmara de Makler.
Determinacin de la Movilidad Espermtica La movilidad de cada espermatozoide es clasificada en cinco categoras, de acuerdo a la velocidad y expresadas en porcentaje. a. Grado A: Movimiento progresivo rpido (>25m/s) b. Grado B: Movimiento progresivo lento (5-25 m/s) c. Grado C: Moviemiento no progresivo(<5 m/s) d. Grado D: Inmviles Con fines de control de calidad debern contarse 200 clulas y clasificar el movimiento. La Movilidad espermtica puede requerir observar inicialmente la muestra como un todo para luego establecer en base al movimiento los porcentajes esperados. El campo de observacin ser siempre el rea central del cubreobjeto y ubicando 8 puntos estratgicos para contar. Ver figura 1.
Figura 1. Cubreobjetos 22x22 ubicando 8 puntos en el rea central para contar y establecer movilidad.
Determinacin de la Morfologa
i. Preparar dos lminas portaobjetos con frotes o improntas, tal y como si fuera un frote Hematolgico, o bien colocar una gota de semen en el medio de una lmina portaobjeto para dejar caer sobre la gota una segunda lmina de tal manera que el semen se despliegue entre ambas caras y luego arrastrar la segunda lmina hacia fuera. ii. Dejar secar al aire y una vez seca, preparar la tincin. Idealmente se utiliza la tincin de Papanicolaou. Sin embargo para mayor facilidad pueden utilizarse mtodos rpidos como Diff-Quick o tambin una sencilla tincin de Wright o Giemsa. iii. Luego de realizada la tincin, dejar secar al aire y observar la lmina en objetivo de inmersin (Condensador arriba y diafragma abierto). Contar 100 clulas y expresar los resultados en porcentaje. Duplicado por control de calidad. iv. Determinar la Morfologa: Un espermatozoide Normal deber tener una cabeza, cuello y cola normal. La cabeza es ovalada en su forma con la regin acrosomal bien definida ocupando cerca del 40-70% de la cabeza. El cuello o pieza media es delgado (menos de 1 um de grosor) sin evidencia de vacuolas. La cola deber ser recta, uniforme y ms delgada que la pieza media. (Kruger et al 1986)
La clasificacin de la morfologa se realiza en base a las tres reas principales: Defectos Cabeza: larga, pequea, piriforme, atachada, acrosoma reducido, vacuolas, dos cabezas o cualquiera de las combinaciones. Defectos Pieza Media: Principalmente cuellos doblados, cuellos gruesos o vacuolados, o cualquiera de las combinaciones. Defectos Cola: Generalmente colas cortas, mltiples, rotas, gruesas, o enrolladas.
v. Observe que no es necesario que describa el tipo de anormalidad encontrada en cada clasificacin, observe 200 clulas y determine los porcentajes que corresponden para cada rea del espermatozoide.
Nomenclatura En base a la observacin Microscpica de una muestra encontramos los siguientes Valores de referencia.
a. Concentracin espermtica Valor referencia: Adulto con capacidad de fertilizacin >20 millones/ml <20 millones/ml: Oligozoospermia. >200 millones/ml: Polizoospermia. Ausencia de Espermatozoides: Azoospermia.
b. Movilidad Espermtica Valor referencia: Adulto con capacidad de fertilizacin >50% Grado A+B <50% A+B: Astenozoospermia Ausencia de Movimiento: Necrozoospermia
c. Determinacin de la Morfologa Valor de referencia de acuerdo a Criterio de Kruger et al 1986 (criterio estricto): Adulto con capacidad de fertilizacin >15% espermatozoides Normales. <15% espermatozoides normales: Teratozoospermia. Ausencia de acrosoma y formas redondas: Globozoospermia.
Resultado con los tres parmetros dentro de los valores de referencia: NORMOZOOSPERMIA.
Resultado con los tres parmetros fuera de los valores de referencia. OLIGOASTENOTERATOZOOSPERMIA
LABORATORIO DE ANDROLOGIA Nombre Paciente: Farid Bahis Fecha: 14 / 04 / 10 Nombre Cnyuge: Cristina Khoury Edad: 30 Solicitado Por: Dr. Mario Ruata Archivo: Clnica Santa Mara
ESPERMOGRAMA
Abstinencia: 04 d Hora de Emisin: 07:10 h Hora de Procesamiento: 08:40
Volumen: 4.8 cc Consistencia: Normal pH: 8.0 Apariencia: Normal Licuefaccin: Completa.
CONTEO DE ESPERMATOZOIDES POR CC: 4,000,000 V.N. mayor 20,000,000 MOTILIDAD Grado A (mov. progresivo rpido) 20 % Grado B (mov. progresivo) 27 % Grado C (mov. pendular sin desplazamiento) 38 % Grado D (inmviles) 15 % V.N. mayor 50% A + B
Clnica Santa Mara Especialistas en Fertilizacin in Vitro Multimedica Clnica 402 Telfonos (502) 23857578-79-80 Fotografas. Anormalidades ms comunes en Espermatozoides