Como cultivo de clulas se desarrolla dentro de un laboratorio de un nmero de lneas

celulares ser desarrollada o adquirida, a menos que el trabajo es exclusivamente con

cultivos primarios. El uso de cada lnea celular se suma a su procedencia, y cada uno de
ellos se convierte en un recurso valioso. Si nico, la lnea celular podra ser imposible
de reemplazar; en el mejor reemplazo sera muy costoso y requiere mucho tiempo. Es,
por tanto, esencial para proteger esta importante inversin, preservando las lneas
celulares.

20.1 JUSTIFICACIN DE CONGELACIN
Las lneas celulares en cultivo continuo son propensos a la variacin debida a la seleccin en la
cultura de principios del pasaje (ver seccin 3.8 ) , la senescencia en las lneas celulares finitas (
vanse las secciones 3.8.1 , 18.4.1 ) , y gentica y fenotpica de inestabilidad ( vase la seccin
16.1 , 18.3 ) en lneas celulares continuas. Adems , incluso el laboratorio mejor plazo es
propenso a un fallo del equipo y la contaminacin . La contaminacin cruzada y la
identificacin errnea ( vanse las secciones 7.10.1 , 16.1 , 16.3 , 16.6.2 , 19.5 , Tabla 13.2 )
tambin se sigue produciendo con una frecuencia alarmante. Hay muchas razones , por lo
tanto , para la congelacin hasta una poblacin validada de las clulas ; estas razones se
pueden resumir de la siguiente manera :
( 1 ) deriva genotpica debido a la inestabilidad gentica
( 2 ) La senescencia y la extincin resultante de la lnea celular
( 3 ) La transformacin de las caractersticas de crecimiento y adquisicin de propiedades
relacionados con malignidades
( 4 ) la inestabilidad fenotpica debido a la seleccin y la desdiferenciacin
( 5 ) La contaminacin por microorganismos
( 6 ) La contaminacin cruzada por otras lneas celulares
( 7 ) La identificacin errnea debido a un manejo descuidado
( 8 ) la falta Incubadora
( 9 ) El ahorro de tiempo y materiales de mantenimiento de las lneas no estn en uso
inmediato
( 10 ) La necesidad de la distribucin a otros usuarios
20.2 ADQUISICIN DE LNEAS CELULARES
para la crioconservacin
Hay ciertos requisitos que deben cumplirse antes de las lneas celulares se consideran
para la crioconservacin (Tabla 20.1).
Validacin. Las lneas celulares deben estar libres de contaminacin (vase la Seccin
19.3) y autntica (ver Seccin 16.3) antes de la criopreservacin. Aunque unas pocas
ampollas de una lnea de clulas recin adquirida se pueden congelar antes de la
validacin completa se ha llevado a cabo (vase la Seccin 20.4), la validacin
adecuada debe llevarse a cabo antes de que se congelan las principales poblaciones
(vase la Seccin 7.10).
Cuando se congele. Si se trata de una lnea celular finito, que se cultiva a alrededor de la
quinta duplicacin de la poblacin con el fin de crear un nmero suficiente de clulas para la
congelacin. Lneas celulares continuas deben ser clonados (ver Secciones 14.1, 14.3, 14.4), un
clon caracterizado seleccionado, y suficientes existencias crecieron durante la congelacin.
Lneas celulares continuas tienen ventajas; sobreviven indefinidamente, crecen ms
rpidamente, y se pueden clonar ms fcilmente; pero pueden ser menos estables
genticamente. Lneas celulares finitas suelen ser diploides o cerca de ella y son estables entre
ciertos niveles de pasadizos, pero son ms difciles de clonar, crecen ms lentamente, y,
finalmente, morir o transformar.

20.3 PRINCIPIOS DE CRIOCONSERVACIN
20.3.1 Antecedentes tericos de congelacin celular
Congelacin ptima de clulas para la mxima recuperacin viable de descongelacin depende
de minimizar la formacin de cristales de hielo intracelular y la reduccin del dao criognico
de focos de solutos de alta concentracin que se forman cuando el agua se congela
intracelulares. Esto se consigue (a) por congelacin lentamente para permitir que el agua salen
de la clula, pero no tan lentamente que el crecimiento de cristales de hielo se anima, (b)
mediante el uso de un crioprotector hidrfilo para secuestrar el agua, (c) mediante el
almacenamiento de las clulas en el ms bajo posible temperatura para minimizar los efectos
de altas concentraciones de sal en desnaturalizacin de la protena en micelas dentro de la
hielo, y (d) descongelando rpidamente para minimizar el crecimiento de cristales de hielo y la
generacin de gradientes de soluto formados como se derrite el hielo intracelular residual.

20.3.2 Concentracin Celular
Las clulas parecen sobrevivir a la congelacin mejor cuando se congelaron a una
concentracin celular alta . Esto es en gran parte una observacin emprica , pero
probablemente est relacionada en parte a la reduccin de la viabilidad de la
descongelacin y que requiere una concentracin ms alta de la siembra y en parte a la
mejora de la supervivencia en una concentracin elevada de clulas si las clulas son
fugas debido al dao criognico. Una alta concentracin a la congelacin tambin
permite la dilucin suficiente del crioprotector en la resiembra despus de la
descongelacin de manera que la centrifugacin no es necesaria ( al menos para la
mayora de las clulas ) . El nmero de clulas congelado debe ser suficiente para
permitir 1:10 o 1:20 de dilucin de la descongelacin y para diluir el crioprotector , pero
an as mantener la concentracin de clulas ms alto que en paso normal ; por ejemplo,
para las clulas subcultivadas normalmente a 1 x 105/ml , 1 107 se congelarn en 1 ml
de medio , y , despus de la descongelacin de las clulas , los enteros de 1 ml se deben
diluir con 20 ml de medio , dando a 5 105 clulas / ml ( cinco veces la concentracin
normal de siembra ) . Esto diluye el crioprotector de 10 % a 0,5 % , en el que la
concentracin es menos probable que sea txico .
Crioprotector residual se puede diluir a cabo tan pronto como las clulas comienzan a
crecer ( para cultivos en suspensin ) o el medio de cambiar tan pronto como las clulas
se han unido (por monocapas ) .

20.3.3 medio de congelacin
La suspensin celular se congela en presencia de un crioprotector tal como glicerol o sulfxido
de dimetilo (DMSO ) [ Lovelock & Bishop , 1959 ] . De estos dos, DMSO parece ser el ms eficaz
, posiblemente debido a que penetra la clula mejor que el glicerol . Las concentraciones de
entre 5 % y 15 % se han utilizado , pero 7,5 % o 10 % es ms habitual . Hay situaciones en las
que DMSO puede ser txicos o inducir a las clulas a diferenciarse ( vase la seccin 17.7.2 ),
por ejemplo , con lneas celulares hematopoyticas como L5178Y o HL60 (M. Freshney ,
comunicacin personal ) , y en estos casos es preferible , ya sea para usar glicerina o
centrifugar las clulas despus de la descongelacin para eliminar el crioprotector .
Se ha afirmado que las clulas deben mantenerse a 4 C despus DMSO se aade al medio de
congelacin y antes de la congelacin , pero los experimentos preliminares realizados por el
autor sugiere que esta no mejor la supervivencia despus de la congelacin e incluso puede
tener reducido [ observaciones no publicadas ] , tal vez mediante la inhibicin la penetracin
intracelular . Sin embargo , este tema an no est totalmente resuelto y vale la
experimentacin ( vase el Captulo 2 , Ejercicio 17 ) . DMSO debe ser incolora , y tiene que ser
almacenada en vidrio o polipropileno , ya que es un disolvente de gran alcance y lixiviar
impurezas de caucho y algunos plsticos . glicerol debera ser no ms de un ao de edad , ya
que puede convertirse txicos de almacenamiento despus de prolongada. Otros
crioprotectores se han sugerido , tales como polivinilpirrolidona (PVP ) [ Suzuki et al . , 1995 ] ,
polietilenoglicol ( PEG ) [ Monroy et al . , 1997 ] , y hidroxietil almidn ( HES) [ Pasch et al. ,
2000 ] , pero ninguno ha tenido el general, aceptacin de DMSO o glicerol , aunque puede ser
una cierta mejora con trehalosa [ Eroglu et al , 2000 . ; Buchanan et al . , 2004 ] . Muchos
laboratorios tambin aumentan la concentracin de suero en medio de congelacin a 40 % ,
50 % , o incluso el 100 %.
20.3.4 Enfriamiento Cambio
Mayora de las clulas cultivadas sobreviven mejor si se enfriaron a 1 C / min [ Leibo y Mazur,
1971 ; Harris & Griffiths , 1977 ] .
Este es probablemente un compromiso entre la congelacin rpida minimizar el crecimiento
de cristales de hielo y enfriamiento lento alentar la migracin extracelular de agua. La forma
de la curva de enfriamiento se rige por ( a) la temperatura ambiente , ( b) cualquier
aislamiento que rodea las clulas, incluyendo la ampolla , ( c ) el calor especfico y el volumen
de contenido de la ampolla , y (d ) la absorcin de calor latente durante la congelacin. Cuando
las clulas se congelan en un recipiente aislado colocado en una congelacin de ultraprofundas
, como en ( 1 ) - ( 4 ) a continuacin , esto se traduce en una curva con una tasa de
enfriamiento rpido en la salida, cuando el diferencial de temperatura es mayor , hasta un
mnimo en el punto eutctico , un ligero aumento a medida que comienza la congelacin ,
seguido de una meseta como el calor latente de congelacin se absorbe , y luego se completa
una ms rpida cada como la congelacin , reduciendo gradualmente su velocidad a medida
que la temperatura de la cmara de congelacin se alcanza ( Fig. . 20.1 ) .
Cuando las clulas se transfieren a la congelador de nitrgeno lquido ( o la etapa final se
alcanza en un congelador programable) la temperatura cae rpidamente a entre -180 y -196
C.
Una velocidad de enfriamiento controlada puede lograrse de varias maneras :
( 1 ) Coloque las ampollas en lana de algodn en una caja de espuma de poliestireno con un
espesor de pared de ~ 15 mm . Este cuadro , adems de la lana de algodn, deben
proporcionar un aislamiento suficiente para que las ampollas se enfriarn a 1 C / min cuando
la caja se coloc a -70 C o -90 C en un congelador normal o recipiente aislado con CO2
slido .
( 2 ) Inserte las caas en tubular de aislamiento de tuberas de espuma , con un espesor de
pared de ~ 15 mm (Fig. 20.2 ) , y colocar el aislamiento a -70 C o -90 C en un congelador
normal o recipiente aislado con slidos CO2.
( 3 ) Coloque las ampollas en un enchufe cuello congelador Taylor Wharton (Fig. 20.3 ) e
inserte el enchufe en el cuello del congelador de nitrgeno .
( 4 ) Coloque las ampollas en un envase Nalge Nunc congelacin (Fig. 20.4 ), y meterlo a -70 C
o -80 C.
( 5 ) Utilice un congelador a velocidad controlada programado para congelar a 1 C / min (Fig.
20.5 ), con la congelacin acelerada a travs del punto eutctico ( ver . Fig. 20.1 ) .
Con cualquiera de los primeros cuatro mtodos , por ejemplo , el mtodo de tubo aislado en (
2 ) ( vase la fig. 20.2 ) , la velocidad de enfriamiento ser un promedio de tasas variables a lo
largo de la curva , y no se intenta para controlar el sobreenfriamiento en el eutctico punto o
la duracin de la meseta durante la absorcin de calor latente , ambos de los cuales puede
afectar a la supervivencia . Si la recuperacin es baja , es posible cambiar la velocidad media de
enfriamiento ( es decir , mediante el uso de ms o menos aislamiento ) . El uso de un
congelador programable ( ver la fig. 20.5 ) con una sonda , que detecta la temperatura de la
ampolla y aade nitrgeno lquido a la cmara de congelacin a la velocidad correcta para
lograr una velocidad de enfriamiento preprogramado , y que pueden sembrar la congelacin
como la suspensin de clulas llega a la eutctica , minimiza el estrs de sobreenfriamiento y
puede alcanzar una velocidad de enfriamiento lineal en toda la gama .

Diferentes velocidades de enfriamiento en diferentes fases de la curva de enfriamiento ,
optimizado experimentalmente para adaptarse a las clulas en proceso de congelacin , se
pueden programar en la curva de enfriamiento . Refrigeradores programables son, sin
embargo , relativamente caro , en comparacin con los dispositivos simples descritos en (1 ) - (
4 ) anterior, y tienen pocas ventajas a menos que desee variar la velocidad de enfriamiento
[por ejemplo , Capataz y Pegg, 1979 ] o alterar la forma de la curva de enfriamiento . Con los
mtodos de contenedor aislado , la velocidad de enfriamiento es proporcional a la diferencia
de temperatura entre las ampollas y el aire ambiente . Si las ampollas se colocan en un
congelador a -70 C , el que puedan enfriarse rpidamente a alrededor de -50 C, pero la
velocidad de enfriamiento se cae significativamente despus de eso ( vase la fig . 20.1 ) . Por
lo tanto , el tiempo que las ampollas pasan en el -70 C congelador debe ser ms largo que la
cantidad de tiempo proyectado por una velocidad de enfriamiento C / min 1 , como la parte
inferior de la curva es asinttica . Es ms seguro dejar las ampollas a -70 C durante la noche
antes de transferirlos a nitrgeno lquido. Por otra parte, cuando se retira del dispositivo de
congelacin, que se calentar a una velocidad de ~ 10 C / min . Es muy importante que no se
calientan por encima de -50 C, como se van a empezar a deteriorarse , por lo que la
transferencia al congelador de nitrgeno lquido debe tener significativamente menos de dos
minutos .
20.3.5 Cryo Congeladores
Almacenamiento en un congelador de nitrgeno lquido . ( Figs. 20.6 , 20.7 ; ver
tambin la Seccin 5.5.2 ) es actualmente el mtodo ms satisfactorio de la preservacin
de las clulas cultivadas [ . Hay et al , 2000 ] Las clulas congeladas se transfieren
rpidamente a la cryofreezer cuando estn en o por debajo de -70 C. Cryofreezers
difieren en diseo dependiendo del tamao del cuello de acceso , sistema de
almacenamiento empleado , y la ubicacin de nitrgeno lquido ( fig. 20.7 ) .
Tamao del cuello . Sistemas de almacenamiento frasco tienden a tener cuellos
estrechos ( Figs. 20.6a , b, 20.7A ), que reduce la velocidad de evaporacin del
nitrgeno lquido, pero hace que acceder a un poco incmodo. Congeladores de cuello
ancho se eligen para la facilidad de acceso
y la capacidad mxima, por lo general con el almacenamiento en secciones dentro de
cajones , pero tienden a tener una tasa de evaporacin ms rpida . Sin embargo, es
posible seleccionar un congelador relativamente estrecha de cuello sin dejar de utilizar
un sistema de bandeja para el almacenamiento . Congeladores estn disponibles con
control de inventario en base a bandejas de almacenamiento cuadrados de la matriz ;
estas bandejas se montan en bastidores que se accede por el mismo sistema que la caa
y el recipiente de convencional
congeladores de cuello estrecho (Fig. 20.6d , 20.7b ) . Estos congeladores no tienen la
capacidad de almacenamiento de la caa y el recipiente , pero tienen tiempos de
retencin equivalentes y la matriz de almacenamiento de nido de abeja que muchas
personas prefieren ( ver abajo).

Sistema de almacenamiento . Hay dos tipos de red de almacenamiento utilizadas para
ampollas de 1 ml para el trabajo de cultivo de clulas . El sistema de la caa , basado en el
almacenamiento de esperma en pajuelas , ampollas utiliza recortadas a una caa de aluminio ,
insertado en un tubo de cartn , y se colocan dentro de recipientes cilndricos en el congelador
. Tiene la ventaja de que las ampollas se pueden manejar en mltiplos de seis a la vez , con
todas las ampollas en una caa de ser de la misma lnea celular , por lo que la transferencia
desde el dispositivo de refrigeracin para el congelador ms fcil y ms rpido . Los bastones
pueden ser coloreados y numerados , haciendo lugar bastante fcil, y las ampollas pueden ser
retirados sin exponer a todos los dems ampollas a la atmsfera clida . El almacenamiento en
cajones rectangulares es preferido por algunos usuarios , que creen que la recuperacin es
ms fcil y ampollas individuales puede ser identificado por el nmero de cajn y las
coordenadas dentro del cajn. Lo que s significa , sin embargo, que el contenido total del
cajn , que pueden ser de 20 a 100 ampollas , estn expuestos a la vez cuando se recupera una
ampolla, y toda la pila debe ser levantado si se accede a uno de los ms bajos cajones.
Adems, la carga de un gran nmero de ampollas en el cajn se debe hacer una ampolla a la
vez , con el riesgo de retardo y el sobrecalentamiento .
Ampollas . Ampollas de plstico son los preferidos para el promedio experimental y la
enseanza de laboratorio , ya que son ms seguros y ms conveniente, pero algunos
repositorios y bancos de clulas prefieren Ampollas de cristal para las reservas de semillas , ya
que el almacenamiento a largo plazo propiedades del vidrio estn bien caracterizados y ,
cuando correctamente realizado , de sellado es absoluta . Ampollas de plstico son
generalmente polipropileno, y 1,2 mL es probablemente el ms popular tamao (ver 22e Plate)
. Ellos pueden marcar con una fina punta marcador o etiquetas , que deben ser alcohol
resistentes y capaces de soportar la baja temperatura del congelador ( vase el Apndice II :
Cryomarkers y Cryolabels ) . La etiqueta debe mostrar la clula designacin de la cepa y ,
preferiblemente , la fecha y las iniciales del usuario , aunque este ltimo no siempre es factible
en el espacio disponible . Diferentes tapas de colores tambin ayudan a la identificacin (ver
22e Plate) . Recuerde, los cultivos de clulas almacenadas en nitrgeno lquido puede muy
bien que sobrevivir ! Ellos pueden sobrevivir fcilmente su estancia en un particular, de
laboratorio . El registro , por lo tanto debe ser interpretado fcilmente por los dems y lo
suficientemente completa como para que las clulas pueden ser til a los dems.
Ampollas de plstico requieren la torsin correcta para el cierre, como se escaparn si es
demasiado flojo o demasiado apretado (debido a la distorsin de la o-ring ) . Vale la pena
practicar con un nuevo lote para asegurarse ( a) que sellan correctamente y ( b ) que sean
capaces de soportar el baja temperatura ; de vez en cuando un lote defectuoso de ampollas
puede romper en la descongelacin. Ampollas de plstico son de un dimetro mayor y ms
alto que las ampollas de vidrio equivalentes , por lo que los bastones especiales debe ser
utilizado .
Nota Seguridad . Los usuarios inexpertos deben evitar el uso Ampollas de cristal , ya que
tienen un grave riesgo de explosin cuando descongelado . Si se utilizan ampollas de vidrio ,
que deben estar perfectamente y se sella rpidamente en una llama de gas - oxgeno. Si el
sellado tarda demasiado de largo , las clulas se calientan y morir , y el aire en la ampolla
ampliar y hacer un agujero en la parte superior de la ampolla. Si el ampolla no est
perfectamente sellada , puede inspirar a nitrgeno lquido durante el almacenamiento en la
fase lquida del congelador de nitrgeno y posteriormente va a explotar violentamente en la
descongelacin. Es posible comprobar si hay fugas colocando ampollas en un plato del 1 % de
azul de metileno en alcohol al 70% a 4 C durante 10 minutos antes de la congelacin . Si las
ampollas no estn debidamente selladas , la azul de metileno se dibujar en la ampolla , y el
ampolla debe ser desechada.
Ubicacin del nitrgeno lquido . Si el nitrgeno lquido se encuentra en el cuerpo principal del
congelador hay una opcin de llenar el congelador y sumergiendo las ampollas , o slo
partfilling y el almacenamiento de las ampollas en la fase de vapor . Almacenamiento en la fase
lquida significa que el recipiente puede ser llenado y por lo tanto el nitrgeno lquido durar
ms tiempo , pero corre el riesgo de absorcin de nitrgeno por ampollas con fugas , que
luego explotar violentamente en la descongelacin. Tambin hay una mayor probabilidad de
transferencia de contaminacin entre ampollas y la acumulacin de contaminacin desde el
exterior , realizada en cuando se introduce el material y se concentra por evaporacin la
constante del nitrgeno lquido en el tanque . Con la introduccin de la mejora del aislamiento
y la reduccin de la evaporacin , el almacenamiento en fase de vapor es probablemente
preferible . Tambin elimina el riesgo de que se derrame cuando el nitrgeno lquido hierve
cuando se inserta algo y reduce la evaporacin de nitrgeno en el aire de la habitacin . Hay,
sin embargo , un gradiente de la temperatura de la superficie del nitrgeno lquido hasta el
cuello de aproximadamente 80 C , a partir de -190 C a alrededor de -110 C en el
almacenamiento en fase gaseosa [ Rowley y Byrne , 1992 ] , aunque el diseo y la composicin
del sistema de estanteras pueden ayudar a eliminar este gradiente .
Algunos congeladores tienen el nitrgeno lquido situado dentro de la pared del congelador y
no en el compartimiento de almacenamiento . Se repone por una alimentacin automtica con
controles de nivel alto y bajo ( fig. 20.7d ) , y se evapor de nitrgeno se libera a travs de una
vlvula de alivio . Esto tiene las ventajas de almacenamiento en fase gaseosa , con la ventaja
adicional de un menor consumo de nitrgeno lquido y la eliminacin del gradiente de
temperatura . Sin embargo , el nivel de nitrgeno no es visible y no puede ser medido por la
varilla de medicin , por lo que la dependencia completa tiene que ser hecho en la vigilancia
electrnica ( vase ms adelante ) . Adems, cualquier obstruccin del flujo de nitrgeno
dentro de la pared del congelador puede ser muy difcil o incluso imposible de eliminar , por lo
que es esencial que se va a filtrar el nitrgeno lquido y que se tomen medidas para garantizar
que no entre agua o vapor de agua, entra en el sistema , como el hielo tambin puede
bloquear el flujo de nitrgeno.
Nota Seguridad . De materiales biolgicamente peligrosos debe almacenarse en la fase de
gas , y la enseanza y demostrando tambin se debe hacer con el almacenamiento en fase
gaseosa . Sobre todo, si se utiliza el almacenamiento en fase lquida , el usuario debe ser
consciente de los riesgos de explosin de vidrio y de plstico y debe llevar una mscara o gafas
El seguimiento y la reposicin de nitrgeno lquido. La inversin en el contenido de un
congelador de nitrgeno puede ser considerable y debe ser protegida por un estricto rgimen
de vigilancia y alarmas electrnicas de nivel de lquido . Cuando el nitrgeno se encuentra en el
compartimiento de almacenamiento , el nivel debe controlarse al menos una vez por semana
con una varilla de medicin , registrando el nivel en un grfico. Esto se debe hacer , incluso si
se emplea el llenado automtico , ya que estos sistemas pueden fallar. Cuando el nitrgeno
lquido es totalmente cerrado , recarga es automtica , pero an debe ser respaldada ,
preferiblemente con dos registradores de temperatura independientes , los cuales deben
sonar una alarma, una si la temperatura sube por encima de -170 C y uno por encima de -150
C. Si el almacenamiento de nitrgeno lquido no est disponible , las clulas se pueden
almacenar en un congelador convencional . La temperatura en este congelador debe ser tan
baja como sea posible ; mnimo el deterioro se ha encontrado a -196 C [ Green et al. , 1967 ] ,
pero el deterioro significativo ( 5-10 % anual ) se puede producir a -70 C.
20.3.6 Congelador Registros
Los registros deben proporcionar (a ) un inventario que muestra lo que est en cada parte del
congelador, ( b ) la indicacin de los espacios de almacenamiento gratuito, y ( c ) un ndice de
cepa de clulas , que describe la lnea celular, su denominacin , su origen , los detalles de
procedimientos de mantenimiento y congelacin, cules son sus caractersticas especiales son,
y donde se encuentra . Este registro puede guardarse en un fichero convencional, sino una
base de datos informatizada dar el almacenamiento de datos superior y recuperacin. Este
tipo de datos puede ser proporcionada por tablas separadas dentro de la misma base de datos
utilizada para la procedencia de la lnea celular (Tablas 20.2 , 20.3 , ver tambin las secciones
12.3.10 , 13.8) . Material almacenado en discos o cintas debe tener copias de seguridad en
disco o en cinta o debe tener una copia impresa en papel . Utilizando una base de datos
informatizada exige que el curador de los congeladores gestiona esta base de datos. Si las
entradas se deben hacer los usuarios , las acciones de los usuarios pueden tener tanto de
lectura y escritura , mientras que el stock de semillas y la distribucin de valores debe ser
accesible slo a la comisaria . Por otra parte, todo el archivo puede ser de slo lectura y
actualizado por el curador de entradas de papel en las tarjetas o un libro de registro .
20.3.7 Descongelar Ampollas almacenados
Cuando sea necesario , las clulas se descongelan y se sembraron de nuevo en una
concentracin relativamente alta para optimizar la recuperacin . La ampolla debe
descongelarse tan rpidamente como sea posible , para minimizar el crecimiento de cristales
de hielo intracelular durante el proceso de calentamiento . Esto se puede hacer con agua tibia ,
en un cubo o bao de agua , pero , si la ampolla se ha sumergido en nitrgeno lquido durante
el almacenamiento , el bao de calentamiento debe estar cubierto en caso de que la ampolla
se ha filtrado e inspirado nitrgeno lquido, cuando se va a explotar violentamente en el
calentamiento . La suspensin de clulas se debe diluir lentamente despus de la
descongelacin como dilucin rpida reduce la viabilidad . Este proceso gradual es
particularmente importante con DMSO , con la que la dilucin repentina puede causar daos
graves osmtica y reducir la supervivencia celular por medio . La mayora de las clulas no
requieren la centrifugacin , como la sustitucin del medio al da siguiente ser suficiente para
una monocapa o de dilucin para una suspensin . Sin embargo , algunas clulas (a menudo las
clulas en suspensin de crecimiento ) son ms sensibles a los crioprotectores ,
particularmente DMSO, y se deben centrifugar despus de la descongelacin , pero todava
necesitan diluirse lentamente en un medio de primera . La viabilidad de exclusin del
colorante y la toma aproximada (por ejemplo, la proporcin de clulas unidas a las 24 h) se
deben registrar en la tarjeta de registro apropiado o archivo para ayudar en el futuro de la
descongelacin. Una ampolla debe descongelarse de cada nuevo punto de congelacin, para
comprobar que la operacin fue un xito
Congelacin frascos. Matraces enteros pueden congelarse haciendo crecer las clulas hasta la
fase logartmica tarda, la adicin de 5-10% de DMSO hasta el volumen ms pequeo de medio
que cubrir efectivamente la monocapa, y colocar el matraz en un contenedor de poliestireno
expandido de espesor de pared de 15 mm [Ohno et al., 1991]. El recipiente aislado se coloca
en un -70 C a -90 C congelador y se congela a aproximadamente 1 C / min. La
supervivencia es bueno para varios meses, siempre y cuando el frasco en su recipiente no se
retira del congelador. Placas de veinticuatro pocillos tambin se pueden congelar de la misma
manera [Ure et al., 1992] con aproximadamente 150 l medio de congelacin por pocillo y se
pueden utilizar para almacenar un gran nmero de clones durante los procedimientos de
evaluacin
20.4 DISEO Y CONTROL
DE STOCKS CONGELADOR
Tan pronto como un pequeo supervit de las clulas que se disponga , del subcultivo un
cultivo primario o una lnea celular recin adquirido , y demostraron que estaban libres de
contaminacin , a pocas ampollas deben congelarse como lo que se llama una congelacin de
token. Cuando la lnea celular se ha propagado con xito , o una cepa de clulas clonadas
seleccionado con las caractersticas deseadas , y su identidad y ausencia de contaminacin se
han confirmado , a continuacin, una reserva de semillas deben almacenarse congelados
(Tabla 20.4 ) .

20.4.1 . Control de Inventario Congelador
La reserva de semillas debe ser protegido y no estar disponible para su emisin general.
Cuando una ampolla se descongela para comprobar la viabilidad del cultivo patrn de
congelacin, y si se prev el uso de la lnea celular en un futuro prximo , las clulas se pueden
cultivar para una accin de distribucin y congelados ; ampollas de esta poblacin se expiden a
las personas segn sea necesario. Los usuarios individuales que requieren las existencias
durante un perodo prolongado luego deben congelar abajo de sus propias existencias de
usuario , que deben ser descartados cuando se acaba el trabajo. Stocks de usuarios nunca
deben ser transmitidos a otro usuario ya que no han sido plenamente validado ; los nuevos
usuarios deben solicitar una cultura o ampolla de las existencias de distribucin. Cuando las
acciones de distribucin se agota , puede ser repuesta por la reserva de semillas . Cuando el
caldo semilla cae por debajo de cinco ampollas , debe ser repuesta antes de la expedicin de
cualquier otro ampollas , y con el aumento mnimo en el nmero de generacin de la primera
congelacin.

20.4.2 Sustitucin de serie de la Cultura de la
Las cepas deben ser reemplazados desde el congelador a intervalos regulares para minimizar
los efectos de la deriva gentica y la variacin fenotpica. Despus de una lnea celular ha
estado en cultivo durante 212 meses , descongelar a otro vial , comprobar sus caractersticas,
asegrese de que est libre de contaminacin ( vase la Seccin 19.3 ) , y ampliarlo para
reemplazar las reservas existentes . Deseche las reservas existentes cuando han estado fuera
de la nevera durante 3 meses, y pasar a la nueva accin (Fig. 20.10 ) . Repita este proceso cada
3 meses con las clulas que tienen un tiempo de poblacin se duplica ( PDT ) de
aproximadamente 24 h ; lneas celulares con contactos conmutados cortos o ms largos
pueden necesitar intervalos de sustitucin ms o menos largos , respectivamente.

20.5 bancos de clulas
Existen varios bancos de clulas ( vase el Apndice II ) para el almacenamiento y la
distribucin de lneas de clulas validadas seguro. Debido a que muchas lneas de clulas
pueden estar bajo las restricciones de patentes , en particular los hibridomas y otras lneas de
clulas modificadas genticamente , tambin ha sido necesario para proporcionar depsitos
de patentes con acceso limitado. Como regla general, es preferible obtener su semilla inicial de
acciones de un banco de clulas de renombre, donde se han llevado a cabo la caracterizacin
necesaria y el control de calidad
Adems, es muy recomendable que usted enve culturas valiosos a un banco de clulas,
adems de mantener su propia madre congelada, ya que el primero que va a proteger contra
la prdida de sus propias lneas y permitir su distribucin a los dems. Si usted siente que sus
clulas no deben ser distribuidos, entonces pueden ser depositadas con esa restriccin
impuesta sobre ellos. La mayora de los bancos de clulas tambin se ganan la informacin del
catlogo disponible on-line, donde actan como una importante fuente de informacin.
Tambin hay varios bancos de datos que se puede acceder en lnea y que mantienen
informacin sobre las lneas celulares en manos de los suscriptores en sus propios laboratorios
(vase el Apndice II). Este tipo de banco de datos proporciona un gran aumento en la
cantidad de material que es potencialmente disponible, pero hay que recordar que las lneas
celulares obtenidas de otros laboratorios pueden variar de manera significativa en la cantidad
de caracterizacin que han tenido y en la calidad de su mantenimiento .
20.6 CELLS TRANSPORTE
Los cultivos pueden ser transferidos de un laboratorio a otro como ampollas congelados o
como culturas vivas. En cualquiera de los casos:
(1) Asesorar al destinatario sobre cundo las clulas deben ser enviados;
(2) Fax o E-mail instrucciones de la siguiente:
a) Qu hacer en la recepcin,
b) medio o suero requerida,
c) todos los suplementos especiales, y
d) rgimen de subcultivo;
(3) Pegue la hoja de datos para las clulas y una copia de las instrucciones para el exterior del
paquete, para que el destinatario sepa lo que debe hacer antes de abrirlo.
20.6.1 Frozen Ampollas
Barco congelado ampollas en CO2 slido, en un recipiente de espuma de poliestireno de
paredes gruesas (fig. 20.11a). Transferir la ampolla del congelador de nitrgeno lquido para el
CO2 slido lo ms rpidamente posible, ya que se calentar a ~ 10-20 C / min y no debe
elevarse por encima de -50 C. Coloque un tubo de centrfuga de polipropileno sellable en CO2
slido en una caja aislada. Retire la ampolla del congelador, envulvalo rpidamente en el
tejido de papel absorbente (en caso de fuga), y lo coloca en el tubo de polipropileno y sellado
con una tapa apretada. La caja debe ser de unos 30 30 30 cm (12 12 12 cm) con un
espesor de pared de 5 cm (2 pulgadas) y un espacio central de unos 20 20 20 cm (8 8 8
cm). Se necesitan unos 5 kg (12 libras) de CO2 slido para llenar el centro
espacio. Por lo general, las clulas permanecern congeladas hasta por 3 das si
debidamente lleno, pero si se descongelan lentamente su viabilidad se
declinar rpidamente. El vehculo debe ser informado cuando las clulas son
enviado en CO2 slido..