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APLICACIN DE CELULASA CEL9B EN REFINADO DE PASTA DE

EUCALIPTO ECF


Cadena, E. M.
1
; Chiriac, I. A
2
.; Vidal, T.
1
; Colom, J. F.
1
; Pastor, F.I.J.
2
; Daz, P.
2
; Torres, A.L
1
.
Telfono +34 93 739 8196; fax: +34 93 739 81 01, torres@etp.upc.edu
1
Departamento de Ingeniera Textil y Papelera. Escuela Tcnica Superior de Ingenieras Industrial y
Aeronutica de Terrassa (ETSEIAT). Universidad Politcnica de Catalua (UPC)
2
Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Barcelona (UB)


RESUMEN

El proceso de refinado de pastas es una de las operaciones fundamentales en la fabricacin del
papel; su accin mecnica sobre las fibras causa efectos primarios y secundarios como la rotura de
enlaces de hidrgeno intrafibra que son sustituidos por enlaces de hidrogeno fibra-agua, fibrilacin
externa, formacin de finos, acortamiento de la fibra, etc. que son cualidades necesarias para fabricar
papel con determinadas propiedades de resistencia.

El uso de enzimas ha crecido rpidamente desde los aos 80 y es punto de estudio para optimizar
diferentes etapas de procesos involucrados en la produccin de pastas y papel. Un nuevo campo de
la biotecnologa aplicada a la industria papelera consiste en la introduccin de enzimas en la
operacin de refinado para mejorar las propiedades fsico-mecnicas del papel. Las enzimas pueden
intervenir como coadyuvantes en la operacin de refinado de pastas a travs de la modificacin de
las fibras al actuar como biocatalizadores altamente eficientes y especficos para determinadas
reacciones qumicas implicando degradacin o transformacin en los componentes celulsicos a
determinadas condiciones de presin, temperatura y pH.

En este trabajo se estudia la influencia de la enzima celulasa Cel9B sobre el refinado de una pasta
kraft (Eucalyptus globulus). La enzima Cel9B ha sido clonada y caracterizada previamente por
algunos miembros del grupo investigador y su efecto se evala en una pasta comercial ECF cedida
por el grupo empresarial ENCE.

El estudio consiste en un tratamiento enzimtico de la pasta, su posterior refinado en un molino PFI a
diferentes revoluciones, la elaboracin de hojas de laboratorio y la caracterizacin de las propiedades
tanto de la pasta como de los papeles elaborados.

En el trabajo se comparan las propiedades estudiadas para la pasta tratada enzimticamente con las
pastas sin tratamiento. De esta comparacin se constata que el tratamiento enzimtico implica una
modificacin tanto en propiedades de la pasta (SR, %IRA -%WRV-) como del papel (densidad,
permeabilidad y resistencias al estallido, desgarro, plegado y traccin). Las pastas tratadas
enzimticamente requieren menos energa mecnica que las refinadas convencionalmente para
alcanzar valores similares de dichas propiedades.

Los resultados obtenidos confirman la modificacin de la estructura de las paredes de la fibra,
causada por el tratamiento enzimtico con Cel9B, lo que provoca una mayor retencin de agua en las
pastas y mejora la capacidad para crear enlaces intrafibras.

PALABRAS CLAVES

Celulasa Cel9B, refinado, pasta de eucalipto ECF, propiedades pastas, propiedades fsicas de
papeles.

ABSTRACT

The refining process of pulps is one of the main operations in the production of paper. Its mechanical
action on the fibres causes primary and secondary effects such as the breaking interfibres hydrogen
bonds that are substituted by fibre-water hydrogen bonds, external fibrillation, formation of fines,
reduction of fibre length, etc. that are necessary qualities to manufacture paper with resistance
properties.

The use of enzymes has grown quickly from the 80s and it is a study point to optimize different stages
of processes involved in the production of pulp and paper. A new field of the biotechnology applied to
the paper industry consists on the introduction of enzymes in the refining operation to improve the
physical-mechanical properties of the paper. Enzymes can participate as helping in the refining of pulp
through the modification of fibres when acting as highly efficient and specific biocatalyst for certain
chemical reactions implying degradation or transformation of cellulose components at certain
conditions of pressure, temperature and pH.

The influence of the enzyme cellulase Cel9B is studied on the refining of kraft pulp (Eucalyptus
globulus). The enzyme Cel9B has been cloned and characterized previously by one part of the
research group and its effect is evaluated on a commercial pulp ECF delivered by ENCE company.

The study consists in an enzymatic treatment of the pulp, followed by a refining in a PFI mill at
different revolutions, the elaboration of laboratory sheets and finally the characterization of pulp and
paper sheets properties.

This work let us compare the properties of enzymatically treated pulp and no treated pulp. The
enzymatic treatment implies a modification of pulp properties (SR, %WRV) as well as paper
properties (density, permeability and burst, tearing, folding and tensile strength). The pulps treated
enzymatically require less mechanical energy than the conventionally refined ones to reach similar
properties values.

The results confirm the modification of the structure of the fibre walls, due to the enzymatic treatment
with Cel9B, which causes bigger water retention of the pulp and improves the capacity to create
interfibre bonds.

KEYWORDS

Cellulase Cel9B, refining, Eucalyptus ECF pulp, pulps properties, physical of papers properties.

INTRODUCCIN

El principal objetivo de la operacin de refinado en la fabricacin del papel es preparar las fibras para
alcanzar propiedades de resistencia deseables; durante el refinado las fibras eliminan parcialmente
las paredes primaria y secundaria externa de la fibra, lo que permite la penetracin del agua en el
interior de la misma provocando su hinchamiento [1] al romper enlaces secundarios celulosa-celulosa,
hemicelulosa-hemicelulosa y hemicelulosa-celulosa; la hidratacin de las fibras y la fibrilacin externa
e interna generan un aumento sensible de la superficie y volumen especficos (incremento de los
puntos de contacto en la formacin del papel) favoreciendo las propiedades fisicomecnicas del
papel.

La etapa del refinado implica elevados costos de operacin haciendo indiscutible la bsqueda de
alternativas para disminuir el consumo de energa en este proceso; fuera de la investigacin
concerniente a nuevos diseos de refinadores y a la variacin de los parmetros de operacin de un
refinador se desarrollan alternativas biotecnolgicas para incrementar los mecanismos de cohesin
entre las fibras en la formacin del papel, este campo es punto de estudio para optimizar las etapas
de procesos involucrados en la produccin de pastas y papel.

La investigacin de nuevas tcnicas biotecnolgicas (enzimas) aplicables en la industria papelera ha
revelado un valor aadido para optimizar la efectividad de agentes qumicos en el proceso de
obtencin de pastas y en secuencias de blanqueo. Actualmente se atribuye un efecto adicional de las
enzimas en la modificacin de la morfologa de las fibras de celulosa con una contribucin en el
desarrollo de las propiedades fisicomecnicas de la pasta y papel. En este campo se han evaluado
principalmente celulasas, obteniendo resultados promisorios.

La aplicacin de celulasas se relaciona a su potencial de convertir la celulosa en glucosa y
oligosacridos solubles, de esta forma los principales polmeros vegetales constituidos por celulosa,
hemicelulosa y lignina estn sujetos a degradacin bioqumica. El sistema de celulasa tpico que
intervienen en la hidrlisis de la celulosa esta compuesto por tres tipos de enzimas: endo--1,4-
glucanasa, exo--1,4-glucanasas o celobiohidrolasas y - glucosidasa o celobiasa. En el mecanismo
de hidrlisis cataltica todos los componentes producen rotura del enlace -1,4-glucosdico del
polmero celulsico [2].

Al determinar la capacidad de la celulasa para hidrolizar la celulosa, se introduce su aplicacin sobre
los beneficios que se puede obtener para modificar las paredes celulares de las fibras; las fibrillas de
celulosa, que se hallan aglutinadas por una matriz conformada por hemicelulosa y otros, estn
densamente empaquetadas y dispuestas en haces paralelos frecuentemente formando capas
cruzadas.

El uso de enzimas celulasas fue propuesto por Pommier y col. [3] para mejorar el drenaje de las
pastas e incrementar la velocidad de los procesos de produccin, su estudio fue confirmado con la
aplicacin de endoglucanasas en pastas recicladas por Kamaya y col. [4] reportando la posibilidad de
mayor productividad al mejorar el drenaje; estas enzimas adems confieren un incremento en las
propiedades de resistencia de los papeles [5], [6], [7], [8], [9], [10]. No obstante existe polmica sobre
los efectos de la enzima y se han encontrado diferencias en los resultados que pueden variar de
acuerdo al tipo de pasta y celulasa utilizada; Garca y col. [6] encontraron que la aplicacin de
enzimas CelB no mejora la drenabilidad (causa incremento SR); el uso de celobiohidrolasas en
pastas kraft no producen efecto sobre las propiedades mecnicas del papel y las endoglucanasas
producen un importante deterioro de las propiedades del papel y pasta [11]. Otra investigacin reporta
que la celobiohidrolasa proporciona beneficios en la resistencia a la traccin tras un refinado
mecnico [12], tambin la aplicacin de CelB de Paenibacillus s.p. BP-23 mejora el ndice de traccin
y el ndice de estallido, permitiendo ahorros en la energa de refinado, y su uso puede ser muy
prometedor a partir de fibras secundarias debido a la posibilidad de compensacin del efecto de
cornificacin [6].

En este documento se estudia la influencia de la aplicacin de enzimas Cel9B en busca de
respuestas sobre el beneficio de las celulasas para obtener papeles resistentes con menor energa de
refinado, una respuesta positiva permitira catalogar las celulasas como coadyuvantes del refinado
de pastas. La relevancia de esta investigacin radica en la utilizacin de celulasas modificadas en
laboratorio, y as contribuir a identificar las caractersticas moleculares de las celulasas al igual que
factores, condiciones y variables que afecten el tratamiento enzimtico.

EXPERIMENTAL

Materia Prima:
- Pasta kraft (Eucalyptus globulus) con secuencias de blanqueo ECF, 92% de sequedad, 89,5 %
ISO de blancura y 858 cm
3
g
-1
de viscosidad.
- Enzima: celulasa (Cel9B) del tipo B-1,4-endoglucanasa de Paenibacillus barcinonensis,
caracterizada a partir del clon recombinante Escherichia coli/pC7. Las condiciones de operacin
requeridas por Cel9B son: dosis 2500 IU/kg p.s, consistencia 10%, pH 4.0 (tampn Fosfato de
Sodio), tiempo de hidrlisis 1 hora a una temperatura de 45 C.

La aplicacin de enzimas se realiza sobre 30 g.p.s (cantidad requerida para un punto de refinado). En
bolsas de polietileno se hace un pre-acondicionamiento de la pasta al 10% de consistencia con la
solucin tampn a una temperatura de 45 C durante 30 minutos, posteriormente se filtra al vaco y se
desmenuza la torta para nuevamente llevarla a la consistencia del 10% con el tampn ms la dosis
de enzima; tras una homogenizacin manual las bolsas de polietileno se introducen en el bao
termosttico (45 C) durante un tiempo de hidrlisis de una hora; finalizado el tratamiento enzimtico
se realiza la recoleccin de lejas y el lavado de la pasta con abundante agua descalcificada y
desmineralizada.

La pasta tratada es refinada en el molino PFI de acuerdo a la norma EN ISO 5264-2 [13] (ISO 5264-
2) [14]. El refinado se realiza en cuatro puntos: 0, 1500, 3000 y 4500 revoluciones para la pasta inicial
[pi-ECF] y pasta con aplicacin enzimtica [Cel9B-ECF]. Se elaboran hojas de papel (gramaje 75 2
g/m
2
) en el equipo Rapid-Kthen segn norma EN ISO 5269 [15] (ISO 5269) [16].

La determinacin de las propiedades fisicomecnicas de las pastas y papeles se realizan segn las
siguientes normas:
- Propiedades de la pasta:
Grado Schopper-Riegler (SR), EN ISO 5267 (ISO 5267).
ndice de Retencin de Agua (%IRA -%WRV-), TAPPI 256 um-91 y Merkblatt IV/33/57.

- Propiedades fsicas del papel:
Determinacin de las propiedades fsicas en hojas de laboratorio, EN ISO 5270 (ISO 5270). Gramaje,
EN ISO 536 (ISO 536). Espesor, Densidad y Volumen, EN 20534 (ISO 534). Permeabilidad al aire
Bendtsen, UNE 57066 -2 (ISO 5636). ndice de Traccin, UNE 57028-1 (ISO 1924). ndice de
Estallido, EN ISO 2758 (ISO 2758). ndice de Desgarro, EN 21974 (ISO 1974). Resistencia al
plegado, UNE 57054 (ISO 5626).

RESULTADOS Y DISCUSIN

El comportamiento de la pasta de eucalipto Kraft ECF tras la operacin de refinado (0-1500-3000-
4500 rev) fue el esperado, el refinado favorece el aumento de la superficie especifica de las fibras
provocando mayor rea de contacto interfibras con un incremento en la resistencia del papel.

La comparacin de las propiedades fsicas de la pasta SR y %IRA (Grfica 1) de la pasta inicial [pi-
ECF] y la pasta tratada con Cel9B [Cel9B-ECF] indica el efecto de la enzima B-1,4-endoglucanasa.
La aplicacin enzimtica antes del refinado causa una mayor modificacin de la fibra que puede llevar
a una deslaminacin de las capas externas -o bien podramos referirnos a un ablandamiento de la
fibra-, de esta forma el refinado ocasionara una mayor formacin de finos, incrementara la
resistencia al desgote y favorecera la accesibilidad del agua a las capas internas de la fibra que
aumenta el grado de hinchamiento de la fibra genera una respuesta positiva sobre el %IRA, efectos
ms acentuados en los refinados correspondientes a 3000 y 4500 rev.

La aplicacin de Celulasa Cel9B no ocasiona una modificacin en la viscosidad de la pasta y no
mejora la drenabilidad; el SR se incrementa hasta un 47% con respecto a la pasta inicial y la
modificacin de la morfologa de la fibra es evidente (Figura 1).

100
110
120
130
140
150
160
170
0 1500 3000 4500
%

I
R
A
pi-ECF Cel9B
20
30
40
50
60
70
80
0 1500 3000 4500

S
R
pi-ECF Cel9B
Grfica 1. Propiedades fsicas de la pasta, %IRA. SR. vs. Revoluciones molino PFI [p - ECF]

Con respecto a las variables de respuesta en la caracterizacin fsica del papel los resultados que se
obtienen son anlogos a un refinado convencional, es decir las propiedades bsicas del papel y las
de resistencia evolucionan con el nmero de revoluciones del molino PFI. En general el incremento
del refinado reduce la resistencia al desgarro e incrementa la resistencia al estallido, traccin y al
plegado debido al aumento en el rea de enlace, las hojas son mas densas causando una reduccin
en la porosidad.

La confrontacin grafica de la serie de refinados de pasta inicial y con tratamiento enzimtico indica
que hay un efecto positivo sobre las propiedades fsicas del papel. En la permeabilidad Bendtsen la
resistencia al paso del flujo de aire incrementa gradualmente (Grfica 2), la accin de Cel9B es mayor
para los refinados de 3000 y 4500 rev (ganancia por encima del 50% con respecto a una pasta
refinada sin tratamiento), solo en la comparacin de la pasta sin refinar (0 rev.) no se observan
cambios. El papel ms denso se consigue con la aplicacin de Cel9B y a mayor compactacin del
papel mayor resistencia a la permeabilidad del aire.


Grfica 2. Propiedades fsicas del Papel respecto al nmero de revoluciones PFI. [p - ECF]

En el caso de los ndices de traccin y estallido, el tratamiento enzimtico mejora los valores
obtenidos en el refinado de la pasta inicial, indicando que la enzima favorece los enlaces fibra-fibra y
confiriendo mayor resistencia a la rotura al aplicar una carga o presin sobre el papel. El mayor
incremento se manifiesta en los refinados de 1500 y 3000 rev.

La relacin de la permeabilidad Bendtsen y el ndice de estallido con la resistencia a rotura por
traccin (Grfica 3), indica que la dosis de enzima aplicada en este estudio acta como coadyuvante
del refinado en la modificacin de la pasta ECF, indicando que se puede disminuir el nmero de
revoluciones del molino PFI para conseguir un valor determinado de resistencia en el papel.

Densidad Permeabilidad Bendtsen
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 1500 3000 4500

m
/
(
P
a
.
s
)
0,54
0,58
0,62
0,66
0,70
0,74
0,78
0 1500 3000 4500
g
/
c
m
3
pi- ECF Cel9B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
I. Traccin (Nm/g)
P
.

B
e
n
d
t
s
e
n

(

m
/
(
P
a
.
s
)
pi-ECF Cel9B
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
I. Traccin (Nm/g)
I
.

E
s
t
a
l
l
i
d
o

(
k
P
a
.
m
2
/
g
)
pi-ECF Cel9B

Grfica 3. Propiedades fsicas del papel vs. ndice Traccin. [p - ECF]

La relacin de la enzima como coadyuvante del refinado se asocia al hecho de que acta como
agente catalizador al acelerar la modificacin de la pasta en la etapa del refinado, de esta forma el
tratamiento sigue la tendencias de las curvas de refino de la pasta inicial sumando un incremento en
algunas propiedades fsicas de las hojas analizadas.

El efecto de un catalizante se observa con mayor claridad en la Grfica 4; con el aumento de la
energa de refinado la resistencia al desgarro llega al mximo a 3000 rev para la pasta inicial y con la
enzima el mximo se alcanza con menor energa de refinado (1500 rev). En la resistencia al plegado
se observa que la pasta tratada con la enzima Cel9B puede conseguir mayor resistencia para un
determinado valor de densidad que una pasta sin tratamiento y en los puntos terminales de la curva
que corresponde a refinados de 3000 y 4500 rev su valor tiende a estabilizarse despus del un
incremento, tanto la pasta inicial como la tratada siguen tendencia similar.
















5
6
7
8
9
10
11
12
0,53 0,58 0,63 0,68 0,73 0,78
Densidad (g/cm
3
)
/
g
)
N
.
m
2
Grfica 4. Propiedades fsicas del papel vs. Densidad. [p - ECF]

El anlisis global de las propiedades fsicas de las pastas tratadas con enzima Cel9B indica la accin
de la actividad enzimtica sobre la morfologa de la fibra, acelerando el desarrollo de las propiedades
de resistencia del papel. Las propiedades que ms se favorecen con la aplicacin de celulasas
corresponden a la permeabilidad Bendtsen con incrementos hasta de un 75% con respecto a la pasta
inicial. El ndice de estallido y resistencia al plegado aumentan su valor en un 32% 37%, de igual
forma se favorece el ndice de traccin. El efecto de Cel9B sobre la resistencia al desgarro es positivo
hasta 1500 rev, a mayores valores de refino decae, lo que podra ser relacionado con la presencia de
finos generados por la aplicacin de Cel9B y al acortamiento de la fibra, tales efectos son
respaldados con el valor del SR donde la celulasa causa una mayor resistencia al desgote.

La transformacin que presenta la fibra al efectuar la operacin de refinado con y sin aplicacin de
Cel9B se observan en las imgenes (Figura 1) obtenidas por microscopia electrnica de barrido
(Scanning Electron Microscopy, SEM); stas revelan el trabajo mecnico que hace el molino PFI
sobre la pasta, se percibe el cambio en la morfologa de la pasta inicial al ser refinada, el rompimiento
de las paredes externas de la fibra genera una fibrilacin externa (fibra deshilachada), acortamiento
de la fibra, formacin de finos, enderezamiento de la fibra y flexibilidad. Con respecto a la capacidad
de enlace de las fibras es visible que con el tratamiento de Cel9B se genera una superficie fibrosa
ms cerrada y compacta. Estas imgenes pueden proporcionar una explicacin al efecto de Cel9B en
el incremento de la resistencia al paso del flujo del aire.



Figura 1. Fotografas de Microscopia SEM. Pasta ECF

Tambin se demuestra la influencia de la enzima Cel9B con el anlisis de cromatografa de capa fina
(TLC) sobre los efluentes de los tratamientos enzimticos, este ensayo da una valiosa informacin
sobre la capacidad de hidrlisis de la celulasa Cel9B en las pastas ECF. La placa presentada en la
R
.

D
e
s
g
a
r
r
o

(
m
pi-ECF Cel9B
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0,53 0,58 0,63 0,68 0,73 0,78
Densidad (g/cm
3
)
R
.

P
l
e
g
a
d
o

(
l
o
g

(
N


v
u
e
l
t
a
s
)

)
pi-ECF Cel9B
Pasta sin Refinar Pasta Refinada en Molino PFI

Pasta Inicial [pi-ECF] Pasta Inicial [pi-ECF]

Pasta [Cel9B-ECF]
Figura 2 revela la aparicin de los oligosacridos correspondientes a los productos de degradacin
confirmando la capacidad de hidrlisis de Cel9B sobre la celulosa. Los resultados inducen a
relacionar la degradacin de la pasta ECF con el incremento porcentual positivo en la variacin de las
propiedades fisicomecnicas del papel para una dosis de aplicacin Cel9B de 2500 IU/kg p.s sobre la
pasta; la dosis de aplicacin permite la modificacin de la fibra sin ocasionar una disminucin en la
viscosidad de la pasta.


G1

Anlisis de cromatografa de capa fina
(TLC) de productos liberados en efluentes
de los tratamientos enzimticos con Cel9B
en pasta ECF.
Tiempo de hidrlisis 1 hora.
Notacin:
G patrn glucosa
G1 glucosa
G2 celobiosa
G3 celotriosa
G2
G3

G Muestras
Figura 2. Anlisis de efluentes mediante TLC, tratamientos Cel9B en pasta ECF

CONCLUSIONES

Los resultados de la caracterizacin final de pasta refinada y del papel obtenido con ella indican un
incremento en las propiedades fisicomecnicas cuando la pasta es tratada con enzimas celulasas
(Cel9B) del tipo B-1,4-endoglucanasa, respecto a la pasta sin tratamiento. Estos resultados son
promisorios debido a que la enzima Cel9B sobre la pasta ECF acta como agente catalizador al
acelerar la modificacin de la pasta en la etapa del refinado.

La utilizacin de la enzima Cel9B como coadyuvante del refinado sobre una pasta de eucalipto ECF
sigue las tendencias de las curvas de refino de la pasta inicial sin tratamiento, y se obtiene un
incremento positivo en propiedades de resistencia y permeabilidad del papel. El resultado ms
sobresaliente de la aplicacin de Cel9B indica que para determinados valores de densidad se
obtiene: mayor ndice de traccin, permeabilidad Bentsen, ndice de estallido y resistencia al plegado;
de esta manera es posible la disminucin de energa de refinado requerida para alcanzar valores
concretos en las propiedades fsicas. As el uso de Cel9B con la dosis estudiada puede generar
ahorros en la energia del refinado.

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16. ISO 5269 - Preparation of laboratory sheets for physical testing -Part 2: Rapid Koethen method.

AGRADECIMIENTOS

- Proyectos Nacionales MCyT PPQ2001- 2161-C02-01 Aplicacin de mtodos biotecnolgicos en el
reciclado del papel. Evaluacin de las propiedades de las pastas, papeles y su permanencia
Acrnimo general: BIORECIPAP y MEC: CTQ2004- 07560-C02-01/PPQ Estudio y optimizacin
de nuevos procesos de refinado y blanqueo de pastas de papel reciclado aplicando mtodos
biotecnolgicos. Acrnimo: REFILAP. Proyecto Europeo EU FP6-2004-NMP-NI-4 White
Biotechnology for added products from renewable plant polymers: Design of taylor-made biocataysts
and new industrial bioprocesses. Acronym: BIORENEW.

- Grupo empresarial ENCE S.A. que suministra los diferentes tipos de pastas.

- Programa Alan Becas de alto nivel de la Unin Europea para Amrica Latina. Cdigo Alan
E04D036666CO.