LA ACETILCOLINESTERASA COMO LA DEL MSCULO ESQUELTICO EN
EL MSCULO LISO REINERVADO POR UN NERVIO MOTOR
Los msculos esquelticos contienen varias formas moleculares de acetilcolinesterasa (AChE) caracterizadas por diferentes coeficientes de sedimentacin 1-4 . En los msculos de rata 1. 2
(pero no en msculos humanos 3 ni de gallina 5 ) la intensa forma de AChE est presente exclusivamente en las regiones de la placa motriz terminal. En contraste, la intensa forma de AChE no ha sido detectada en msculos lisos de gatos 6 ni rata 2 . La placa terminal AChE de msculo esqueltico de rata es selectivamente separada por tratamiento de colagenasa 1. 7 , una enzima que ha sido demostrada especficamente para digerir la cola de tipo colgeno de la intensa forma de AChE de varas fuentes 8. 9 La presencia de placa terminal de AChE es neuronalmente regulada 10 y hay evidencia que este efecto est parcialmente mediado por la actividad muscular 11 y por un factor trfico transmitida por el transporte exoplasmtico 12. 13 . Resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado que la reinervacin de la membrana nictitante del msculo liso de gato por un nervio motor resulta en un aumento de la actividad de AChE 14 . Reportamos aqu que el tratamiento de colagenasa separa el AChE del msculo liso reinervado de gato por un nervio motor colinrgico, y que una nueva forma de AChE con un gran coeficiente de sedimentacin es inducido en estos msculos. Nuestros resultados sugieren que la presencia de los nervios motores determina, en msculos lisos reinervados, la aparicin de un AChE similar a aquel encontrado en msculos esquelticos.
El ganglio simptico cervical superior fue retirado de gatos adultos, el nervio hipogloso fue seccionado y el tronco central suturado a las fibras postganglionares del ganglio cervical superior. Detalles del procedimiento experimental figuran en otra parte 14 . Siete meses despus de la operacin, tanto el nervio hipogloso como el nervio preganglionar fueron estimulados para confirmar que los msculos lisos fueron reinervados exclusivamente por el hipogloso. En todos los casos, la membrana nictitante y la pupila respondieron solo a la estimulacin del hipogloso. La musculatura lisa de las dos membranas nictitantes fueron removidas para ensayo de AChE 15 . En una serie, msculos reinervados y de control fueron incubados in vitro a 37 en un medio 6 conteniendo colagenasa a 0.2 mg ml -1 (preparacin de tipo III, 400 U mg -1 , Sigma). Usamos la tcnica de digestin con colagenasa la cual es conocida por separar selectivamente la AChE de las placas motrices terminales, dejando la AChE de la placa no terminal intacta 7 . En otra serie de experimentos, homogeneizados de msculo liso reinervado y normal fueron sedimentados en una gradiente lineal (5-20%) de sacarosa siguiendo el mtodo de Martin y Ames 17 . Se usaron soluciones de sacarosa (Schwarz-Mann, grado de enzima especial) conteniendo NaCL-Triton X-100 1 . La actividad especfica de AChE en msculos de control fue de 0.57 nmol 3 H-acetato por min por mg de protena, mientras que en msculos reinervados incremento a 1.23. Los msculos lisos reinervados por un periodo ms largo (10 meses) mostraron un ms alto nivel de AChE, alcanzando una actividad especfica de hasta 3.1 (ref.18). Los msculos lisos reinervados incubados con colagenasa liberaron una cantidad de AChE proporcional al tiempo de incubacin mientras que los msculos de control no mostraron ninguna actividad de AChE solubilizado (Fig. 11). Es conocido que la colagenasa interrumpe la membrana basal de la fibra muscular 19, 20 , y libera AChE de la placa motriz terminal la que se localiza parcialmente dentro de la lmina basal en la unin neuromuscular 21 . El desprendimiento enzimtico de la AChE activa de los msculos lisos reinervados sugiere que la nueva forma enzimtica es probablemente anclada a un material como lmina basal - como ha sido propuesto para las formas de AChE que presentan sensibilidad a la colagenasa 8 y corresponderan a una forma de alto coeficiente de sedimentacin, similar a la forma de AChE especfica para la placa motriz terminal de rata 1 . Los experimentos de liberacin de AChE, sin embargo, no entregaron informacin estructural definitiva ya que la colagenasa comercial estn contaminadas con varias proteasas 22 . Las formas moleculares de AChE presentes en msculos lisos reinervados fueron por consiguiente identificadas por anlisis de velocidad de sedimentacin. La Figura 2 muestra que una nueva intensa forma de AChE aparece en los msculos lisos reinervados por un nervio motor colinrgico. Esta forma intensa de AChE que probablemente corresponde a la forma asimtrica A 12 de Bon et al. 8 , que cuenta como el 9% de la actividad total y representa ~25% del aumento total de AChE en los msculos reinervados. Como la forma intensa de AChE no est presente en los msculos lisos normales 6 , es probable que las especies separadas por la colagenasa correspondan a estas formas de alto coeficiente de sedimentacin 23 . Los presentes resultados muestran que un nervio motor puede inducir en el msculo liso una forma de AChE similar a aquel encontrado en el msculo esqueltico. Como innervacin por un nervio motor colinrgico es un factor comn para msculos lisos reinervados y msculos esquelticos, nuestros resultados sugieren que el nervio motor es capaz de regular la AChE en cualquier musculatura que inerva.
Fig. 1 Liberacin de AChE de los msculos lisos inferiores de la membrana nictitante como una funcin de tiempo de incubacin. Condiciones experimentales: msculo liso normal de la membrana nictitante con colagenasa () y sin colagenasa (), msculo liso reinervado de la membrana nictitante con colagenasa () y sin colagenasa (). Muestras de msculo liso (15-20 mg) fueron incubados a 37C en 300 l de un medio conteniendo 138 mM NaCl, 4mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 50 mM fosfato de sodio (pH 7.5), 0.1 mg ml -1 cloranfenicol, y 0 o 5 M BW 284C51 dibromida. Colagenasa (0.2 mg ml -1 ) fue agregada al medio de incubacin de algunas muestras musculares. En distintos tiempos, alcotas duplicados de 10 l medios de incubacin fueron removidos para ensayos de AChE 15 . Subsecuentemente, las muestras musculares fueron homogeneizadas 1/15 (w/v) en buffer congelado pH 7.3 (1 M NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.05 M Tris-HCl, 0.2 mM EDTA) para determinar la actividad de la AChE. El monto absoluto de AChE en muestras incubadas no es la misma para las diferentes situaciones experimentales estudiadas, por lo tanto para evaluar comparativamente la liberacin de AChE en cada caso 16 la cantidad inicial de enzima presente en las muestras debe considerarse. % flujo salida de AChE:
AChE activity (%efflux) Actividad AChE (% flujo de salida)
Time of incubation Tiempo de incubacin Varios mecanismos diferentes pueden estar en regulacin neural de la AChE: (1) actividad neuronal; (2) acetilcolina en s; (3) liberacin de AChE del nervio terminal; y (4) control neurotrfico. Estos cuatro mecanismos son discutidos a continuacin: (1) Actividad ha sido demostrado que juega un papel en la modulacin de AChE en el cultivo de msculo de pollo 24 , y estimulacin de la actividad muscular puede inducir manchas de AChE en msculos de rata 11 . La forma 16S AChE reaparece en la placa terminal original en msculos denervados, despus de reinervar en un sitio diferente 25 . Una posible es explicacin para esto es que la actividad muscular estimula la sntesis o estabilizacin de AChE 16S en sitios en el msculo previamente determinados por el contacto del nervio 25. 26 . Lmo y Slater 11 sugieren que la actividad muscular podra convertirse en sntesis de la unin de AChE adems de apagar la sntesis de los receptores de uniones adicionales de acetilcolina en msculos esquelticos de rata. Sabemos que la reinervacin de la membrana nictitante del msculo liso por un nervio motor colinrgico determinan tanto una disminucin en la hipersensibilidad al acetilcolina 27 , y la induccin de una intensa forma de AChE; por lo tanto, el efecto sugiri para la actividad muscular en msculos esquelticos 11 puede tambin aplicarse en msculos lisos reinervados por un nervio motor. Recientemente, sin embargo, se ha demostrado que, en la rata, la placa terminal de la forma AChE 16S est influenciada por el largo del tocn del nervio 28 . Como los msculos se vuelven inactivos en el momento de la seccin del nervio, independientemente de la longitud del tocn del nervio, se deduce que la placa terminal de la forma de AChE S16 tambin depende en el mecanismo de actividad independiente 28 . (2) Acetilcolina per se no parece ser un factor importante en la regulacin de AChE: durante la reinervacin del msculo esqueltico con fibras preganglionares parasimpticas colinrgicas, la AChE disminuyo y casi desapareci cuando la reinervacin fue completada, a pesar de la liberacin de acetilcolina normal 30 . (3) Liberacin de AChE neural ha sido demostrada en el nervio frnico hemidiafragma 31 . Aunque el nervio motor contiene una intensa forma de AChE 32. 33 , solo la forma 10S de AChE ha demostrado ser liberada de las terminales nerviosas. Evidencia que una forma intensa de AChE es transportado por un flujo axonal fue obtenido estudiando la acumulacin de material en el mun proximal de un nervio daado 32 , as que es posible que una intensa forma de AChE es producida localmente ya sea en Schwann o en otras clulas extra-axonales, en el sitio del mun herido. En este contexto, ha sido recientemente demostrado que la fosfato acida de clulas gliales es transportada a axones daados 34 . En cualquier caso, como el flujo axonal es un importante mediador en la regulacin neurotrfica de la unin de AChE 12 , el nervio motor que inerva el msculo liso de la membrana nictitante proveera una fuente para la intensa forma de AChE. (4) Sustancias trficas de AChE 35. 36 son llevadas por transporte exoplasmtico 12. 13 y en nervios motores un factor trfico ha sido detectado el cual es capaz de mantener el nivel de AChE en cultivos de msculo embriotico aneural o msculos adultos denervados de gallina 36 . Por otra parte, un factor trfico, aparte de la AChE, aislado del nervio frnico de rata y transportado por un flujo axonal, ha demostrado mantener el nivel de la placa terminal de AChE en los cultivos de tejido del diafragma de rata 13 . Este descubrimiento sugiere fuertemente que una sustancia diferente de la AChE, transportada por un flujo axonal a la terminal nerviosa, sera un factor importante en la regulacin neurotrfica de la placa terminal de la AChE. El efecto que observamos en el msculo liso reinervados puede ser parcialmente mediado por un factor similar. Por lo tanto, los nervios motores regulan la AChE, pero los nervios parasimpticos 30 no poseen esta capacidad. Adems, los nervios motores pueden inducir coeficiente de alta sedimentacin de AChE, similar a la forma especfica de las placas terminales motoras de rata, como ha sido reportado para placas terminales de msculos denervados 2 , segmentos no sinpticos de los msculos esqueleticos 2 , placas terminales originales en msculos denervados despus la reinervacin en un lugar diferente 25 , cultivos primarios de clulas musculares de rata 37 , y msculo liso (en este trabajo).
Fig. 2 La velocidad de sedimentacin de los extractos de msculo liso en una gradiente de sacarosa. Perfil de actividad de AChE de: a, control de musculo liso; b, msculo liso reinervado. Msculo liso (~10 mg) fue homogeneizado en buffer congelado de NaCl-Triton, pH 7.3 (1M NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.05M Tris-HCl, 0.2 mM EDTA). Despus de varias veces de extraccin de enzima, muestras de 0.2 ml (2.4 mg de protenas) fueron capas en gradientes (5-20%) lineal de sacarosa, en la presencia del mismo buffer como para homogeneizacin y sujeta a la velocidad de sedimentacin. Se realiz ultracentrifugado en un Beckman L5-65 ultracentrfuga, con un rotor SW 65 a 39.000 r.p.m. por 12 horas a 20|C. Un volumen de 0.05 ml de cada fraccin fue ensayada para actividad de AChE. La actividad fue mesurada por un procedimiento radioqumico en el cual la liberacin de 3 H-acetato de 3 H-ACh yoduro (NEN, 50 mCi mmol -1 ) fue cuantificado por intercambio inico cromatogrfico y espectroma de centelleo 15. 16 . La actividad de AChE es expresado en unidades arbitraras. En nuestras condiciones de ensayo estndar la hidrlisis de acetilcolina fue inhibidor de la actividad de AChE. La catalasa, usada como marcador de enzima (11.3S), fue determinada colorimetricmente 38 y las protenas por el mtodo de Lowry et al. 39 . La flecha representa la posicin de la catalasa.
Agradecemos a los Dres. H. L. Fernndez, J. Koening, T. Lmo y a J. Massouli por hacer sus resultados disponibles antes de la publicacin. Esta investigacin fue respaldada por becas de UNDP/UNESCO, DIUC y Gildemeister Foundation.
NIBALDO C. INESTROZA BERNARDITA MENDEZ JOAQUIN V. LUCO
Laboratorio de Neurofisiologa, Departamento de Biologa de la clula, Universidad Catlica, Santiago, Chile
INFORMACIN RELEVANTE
Reinervaciones Cruzadas y la Induccin Molecular El cmo un nervio motor modifica la expresin molecular en un msculo liso, con el que nunca tuvo contacto previo, es otro tema de investigacin que Luco persigui por aos. Conceptualmente, este trabajo se inserta en el postulado de que la adecuada funcin del Sistema Nervioso depende del desarrollo y la mantencin de conexiones especficas entre clulas nerviosas y sus rganos inervados. As en 1957, Christian Vera, Juan Vial y Luco publicaron en el Journal of Neurophysiology, que la membrana nictitante del gato formada por musculatura lisa e inervada por fibras adrenrgicas provenientes del ganglio cervical superior, poda ser reinervada por fibras colinrgicas motoras, los msculos lisos reinervados eran capaces de contraerse y perdan la hipersensibilidad a la adrenalina. Diez aos ms tarde, junto a Ana Mara Lennon mostraban que la acetilcolinesterasa aumentaba a valores no observados previamente en un msculo liso; finalmente en 1979, quien les habla, junto a Bernardita Mndez y Luco publicamos en la revista Nature, que el nervio motor era capaz de inducir en el msculo liso reinervado, una forma sinptica de la acetilcolinesterasa, llamada 16 S o forma asimtrica, que solo se encuentra en la unin neuromuscular de los msculos esquelticos. De esta manera, tomaba forma el concepto que Luco imaginara muchos aos antes: El nervio motor posee propiedades inductivas que definen la expresin gnica de macromolculas relevantes a la funcin neural en el elemento inervado. RELAJACIN Despus de la contraccin, dos cambios permiten que la fibra muscular vuelva a relajarse. La acetilcolina es rpidamente degradada por una enzima llamada acetilcolinesterasa, la AchE se encuentra en la hendidura sinptica. Cuando los potenciales de accin cesan en la neurona motora, no se libera ms Ach, y la AchE degrada con rapidez la Ach ya existente en la hendidura sinptica, lo que ocasiona la relajacin del msculo.
Resumen de la accin de la AchE en la relajacin muscular Cuando una neurona motora, libera ACh, se produce una cascada de reacciones en el msculo que acaba con el acortamiento de las fibras msculos, para que se produzca la relajacin del msculo, es necesario que se libere una sustancia antagnica que elimina ACh, la Acetilcolinesterasa.
La gradiente de sacarosa permite separar fracciones celulares en relacin a su densidad En // // utilizan la colagenasa, para obtener resultados ms precisos ya que su funcin permite degradar nicamente acetilcolinesterasa Actividad muscular, acetilcolina presente, factor neurotrfico