PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogot D.C 2008
EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CSAR TOVAR CASTAO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de
Microbilogo Agrcola y Veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogot D.C Enero 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N o 13 de Julio de 1946
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma, y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CSAR TOVAR CASTAO
_____________________________ JOSE SALVADOR MONTAA MSc. DIRECTOR.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogot D.C Enero 2008
EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA in vivo DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani
JULIO CSAR TOVAR CASTAO
______________________________ ________________________ Gerardo Moreno Durn MSc. Luis David Gomez MSc. JURADO JURADO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogot D.C Enero 2008
A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi corazn, por su amor de madre y comprensin infinita, a mi padre Julio Csar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a Anglica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por el hermoso regalo de existir en mi vida .
AGRADECIMIENTOS
A Jose salvador Montaa por su calidad humana y enseanzas, por su apoyo y orientacin constante e incondicional, por su comprensin y por la confianza brindada para culminar exitosamente este proyecto de mi vida.
Al Doctor Gerardo Moreno por su orientacin y consejos en la realizacin de los ensayos de la investigacin en la Estacin experimental de la Pontificia Universidad Javeriana.
Al Laboratorio de Microbiologa ambiental y de suelos por el suministro del aislamiento T3 y por la colaboracin durante la realizacin de esta investigacin.
Al CIIA por el suministro del hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani para el desarrollo de la investigacin.
Al LESYHT por el suministro del hongo nativo de Trichoderma T235 para el desarrollo de la investigacin.
A flor Amrica por el suministro de los esquejes de clavel enraizados y el aislamiento Trichoderma Tsp5, Tv1, Tc1 y Ti1.
A Claudia Patricia por su aliento y apoyo incondicional.
RESUMEN
Trichoderma es un hongo de gran importancia a nivel agrcola gracias a las diversas ventajas que ofrece como agente de control biolgico, para la proteccin de plantas frente al ataque de fitopatgenos causantes de enfermedades de importancia econmica, como es el caso de los cultivos hortcolas.
En el presente estudio se evalu la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un fitopatgeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para ello la tcnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes de inhibicin micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento la menor tasas de crecimiento.
Con el fin de confirmar la capacidad antagonista in vivo de los 6 aislamientos de Trichoderma, se realizaron ensayos en esquejes enraizados de clavel de la variedad everest susceptibles a R. solani bajo condiciones de invernadero, Confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de antagonismo in vitro, se observo que el tratamiento silvestre T235 result tener la mejor capacidad antagonista, reflejado en mayores valores de crecimiento de la parte area, raiz y peso de los esquejes de clavel, adems de una mejor apariencia de los mismos y ausencia de signos o sntomas de la enfermedad.
Contrario a lo observado en el ensayo in vitro, donde el aislamiento Tc1 mostro tasas de crecimiento libre y porcentajes de inhibicin micelial bajos, en los ensayos de invernadero este aislamiento presento una buena capacidad antagonista y promocion del crecimiento vegetal indicando que no necesariamente la capacidad antagonista de un aislamiento observada in Vitro sea un indicativo de cmo se va a comportar en condiciones de invernadero o campo
INDICE GENERAL
1. INTRODUCCIN..... 1 2. MARCO TERICO Y ESTADO DEL ARTE 3 2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma .. 5 2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma.. 6 2.2.1. Biocontrol por competencia. 7 2.2.2 Competencia por nutrientes 8 2.2.3 Antibiosis..8 2.2.4 Micoparasitismo.. 9 2.2.5 Sinergismo.........10 2.2.6 Biofertilizacin y mecanismos de defensa en plantas.. 10 2.2.7 Modificacin de la rizosfera . 10 2.3 Trichoderma en el biocontrol..13 2.4 Trichoderma como biofertilizante.. 15 2.5 Rhizoctonia solana...16 2.5.1 BIOLOGA de Rhizoctonia solani.. 17 3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN...20 4. OBJETIVOS..22 4.1. Objetivo General. 22 4.2 Objetivos especficos.. 22 5. MATERIALES Y METODOS. 23 5.1 Diseo de la investigacin.. 23 5.1.1 Ubicacin.23 5.1.2 Microorganismos23 5.1.3. Material vegetal ... 24 5.1.4. Elaboracin del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24 5.1.5 Preparacin del inoculo de aislamientos de Trichoderma .... 25 5.1.6 Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani.... 25 5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro .... 26 5.1.8 Elaboracin de la prueba de antagonismo. .26 5.2 Evaluacin de la capacidad antagonista in vivo... 27 5.3 Diseo experimental ... 28 5.4 Variables de estudio. .. 29
6. RESULTADOS Y DISCUSIN.30 6.1 Evaluacin Macro y Microscpica de aislamientos de Trichoderma .. 31 6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma... 33 6.3 Evaluacin de crecimiento del patgeno R. solani 34 6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio .. 35 6.5 Evaluacin del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma 38 7. CONCLUSIONES ...59 8. BIBLIOGRAFIA .. 61
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Crecimiento en placa de los Aislamientos de Trichoderma T3, TSP5, Tv1, Tc1, Ti1, y T235 en agar PDA durante 48 horas a 30C....31
Figura 2. Porcentajes de crecimiento libre evaluado a las 24,36,48 y 60 horas para 6 aislamiento de Trichoderma.34
Figura 3. Curva de Crecimiento de Rhizoctonia solani.. 34
Figura 4. Tcnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia solani. Fotografa tomada 72 horas despus del inicio de la prueba36
Figura 5. Porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas...37
Figura 6. Aspecto del material vegetal previo a la inoculacin con el Hongo Rhizoctonia solani. 39
Figura 7. Aspecto del material vegetal luego de la inoculacin en campo con el patgeno ... 40
Figura 8. Aspecto del material vegetal 7 das despus de la inoculacin con el patgeno 40
Figura 9. Aspecto del material vegetal 11 das despus de la inoculacin con el patgeno ... 41
Figura 10. Aspecto del material vegetal 15 das despus de la inoculacin con el patgeno ..42
Figura 11. Evaluacin de la longitud de la parte area de esquejes de clavel En respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani.. 42
Figura 12. Sntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani...43
Figura 13. Aspecto del material vegetal 19 das despus de la inoculacin con el patgeno .. 44
Figura 14. Evaluacin de la longitud foliar de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani44
Figura 15. Evaluacin del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani.46
Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 das despus de la inoculacin con el patgeno ...48
Figura 17. Evaluacin del peso seco areo de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani 49
Figura 18. Evaluacin del peso seco raz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani50
Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad en el material vegetal. 51
Figura 20. Evaluacin del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani... 52
Figura 21. Incidencia de Muerte de esqujes de clavel en los tratamientos por accin patognica de R. solani .52
Figura 22. Evaluacin de las races en los diferentes tratamientos durante el desarrollo del ensayo . 54
Figura 23. Evaluacin de la longitud de raiz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani ... 55
Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 das despus de la inoculacin con el patgeno.. 56
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tratamientos para la evaluacin de antagonismos in vivo 28
Tabla 2. Evaluacin macroscpica de los 6 Aislamientos de Trichoderma 31
Tabla 3. Resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre de Trichoderma a las 24, 36, 48 y 60 horas.. 32
Tabla 4. Resultados obtenidos al evaluar el porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas .. 37
INTRODUCCIN
El aumento de la poblacin mundial, el deterioro del medio ambiente y calidad de vida del hombre, son slo algunos de los tantos factores que han motivado al ser humano a buscar nuevos procesos de produccin agrcola que permitan cubrir la demanda, cada vez ms creciente, de alimento y materias primas a travs de procesos donde se aprovechen los recursos naturales de manera sostenible e integrando as los conceptos de conservacin y desarrollo para la plena satisfaccin de las necesidades humanas. No obstante las actividades agrcolas extensivas y la ampliacin de sus fronteras han trado consigo problemas fitosanitarios en los sistemas naturales, especialmente en el suelo, que es considerado el soporte principal de la agricultura.
Uno de los aspectos importantes en la produccin agrcola es el control de plagas y enfermedades; medidas fitosanitarias que minimicen las perdidas econmicas ocasionadas por diferentes efectos como son los agentes qumicos o biolgicos.
La utilizacin extensiva de compuestos qumicos para el control de enfermedades, la emergencia de patgenos resistentes a fungicidas, y el deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la bsqueda de alternativa viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la produccin agrcola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.
Desde 1980 Rhizhobacterias y hongos biocontroladores han sido investigados como posible alternativa de produccin limpia. El empleo de agentes de control biolgico (BCAs) ha permitido una reduccin en la aplicacin de fungicidas qumicos y por lo tanto un control ms eficiente de patgenos causantes de enfermedades, al ser incorporados a los programas de manejo integrado.
El hongo Trichoderma sp es un eficiente controlador biolgico que est siendo ampliamente usado en agricultura como agente de biocontrol debido a su habilidad para colonizar sustratos rpidamente, inducir resistencia sistmica adquirida en plantas, promover el crecimiento vegetal y poseer actividad antagonista contra un amplio rango de hongos patgenos. El efecto inhibitorio de sus antibiticos y la degradacin de componentes de la pared celular de patgenos de plantas, es citado como aspecto importante de su actividad antagonista.
Las especies de Trichoderma tienen una gran actividad antagonista sobre patgenos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de rbano, clavel, crisantemo, frjol, cafeto, haba, tomate y ctricos entre otros. Durante los ltimos aos, varios investigadores y algunas empresas han mostrado gran inters en estudiar el potencial de Trichoderma como controlador biolgico de patgenos de suelo.
En este contexto, el presente trabajo evalu bajo condiciones de invernadero, la capacidad antagonista de aislamientos nativos y comerciales de Trichoderma spp frente al hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani. Los resultados de esta investigacin ayudaron en la obtencin de informacin tanto en laboratorio como en campo sobre la accin potencial biocontroladora de este gnero.
2. MARCO TERICO Y ESTADO DEL ARTE
El control biolgico de enfermedades en plantas o insectos con agentes microbianos es una posibilidad atractiva, si se tiene en cuenta que los costos respecto al uso de otras prcticas de control tradicionales pueden resultar menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar en forma ms lenta y en menor escala, su accin puede ser ms estable y duradera que el control qumico (Papavizas y Lewis, et al.1984).
El conocimiento concerniente al comportamiento de algunos hongos como antagonistas es esencial para su efectivo uso, debido a que pueden actuar contra organismos blanco de varias formas constituyndose en una alternativa biolgica al empleo de compuestos qumicos convencionales, considerados nocivos para el medio ambiente (Jeffries y Young, 1994).
Mediante el uso de hongos y bacterias antagonistas se han podido conocer estrategias con mayor potencial para el control de enfermedades ocasionadas por patgenos del suelo (Cook y Baker, 1983). Muchas especies saprofitas como Trichoderma harzianum., Gliocladium spp., y Verticillium lecanii son antagonistas de varios organismos plaga, incluyendo patgenos de plantas, malezas e insectos (Gonzlez et al., 1998). De otra parte sobreviven durante periodos relativamente largos como formas de resistencia, haciendo innecesaria la reinfeccin continua con el agente biocontrolador (Wainwright et al., 1995)
Las especies de Trichoderma han sido investigadas como agentes de control biolgico (BCAs) de enfermedades fngicas por cerca de 70 aos (Hjeljord y Tronsmo, 1998), pero es solo recientemente que las cepas han comenzado ha ser comercialmente aprovechables. El xito de las cepas de Trichoderma como (BCAs) es debido a su alta capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir bajo condiciones ambientales desfavorables, eficiencia en la utilizacin de nutrientes, capacidad para modificar la rizsfera, fuerte agresividad contra hongos fitopatgenos y eficiencia en promocin de crecimiento en plantas e induccin de mecanismos de defensa (Bentez y Rincn 2004). Estas propiedades han hecho que Trichoderma se presente en cualquier hbitat en una alta proporcin.
Las diferentes especies de Trichoderma se caracterizan por tener un crecimiento micelial rpido y una abundante produccin de esporas que ayuda a la colonizacin de diversos sustratos y del suelo. As mismo pueden producir enzimas extracelulares, antibiticos antifngicos, ser competidores contra hongos patgenos, promover el crecimiento en plantas, e inducir resistencia (Zimand et al., 1996) Adems compiten muy bien por nutrientes, son micoparasitos muy activos y son competidoras muy eficientes de la rizosfera (Papavizas et al., 1985; Ahmad y Baker, 1987).
Liu y Baker en 1980 y Chet y colaboradores en 1987, demostraron que especies de Trichoderma harzianum y T. hamatum fueron especialmente eficientes en el control de patgenos como Rhizoctonia solani.
Varios aislamientos de Trichoderma harzianum se han utilizado exitosamente en el control de algunas enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani como: damping off en tomate (Rodrguez, 2002), pudriciones radiculares en plantas de frjol (Gutirrez et al., 2006), podredumbre negra de la raz en fresa (Baldarrago,1999), pudricin del tallo en clavel ( Garca et al.,1998), pudrimiento de las races en habichuela ( Cardoso, et al., 1987 ) y mal del talluelo o damping off en el cafeto (Castro et al., 2005 ).
Adems, se ha encontrado que algunas especies de Trichoderma, especialmente Trichoderma harzianum tienen el potencial de aumentar el crecimiento y desarrollo de las plantas; esto parece deberse a la inhibicin de patgenos menores y a la produccin de factores que estimulan el crecimiento de la planta y favorecen la toma de nutrientes (Widham et al., 1986; Chang et al., 1986; Chet, 1987; Baker, 1990).
Los procedimientos por los cules se promueve la actividad de biocontrol contra fitopatgenos fngicos se fundamenta sobre la activacin de mltiples mecanismos entre los que se encuentran: la inactivacin de las enzimas del patgeno, la competencia por el espacio y nutrientes, la secrecin de metabolitos secundarios con efecto antibitico y el ataque directo a otro hongo o micoparasitismo. Adems indirectamente Trichoderma, es capaz de proteger a la planta del patgeno, mediante la induccin de sus sistemas de defensa ( Benitez, 2004 ).
2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma spp
Trichoderma sp, es un habitante natural del suelo, caracterizado por un comportamiento saprfito o parsito, propiedades que benefician su actividad antagnica. (Camargo, 2005). Es considerado un colonizador secundario dado su frecuente aislamiento a partir de materia orgnica en descomposicin, tambin es aislado comnmente a partir de la superficie de races de varias plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patgenos, debido a la competencia por nutrientes y micoparasitismo (Camargo et al., 2005).
Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rpido, que va formando una colonia delgada de sobre la superficie del agar, debido a la conidiacin que presenta a travs de su desarrollo. Las colonias al comienzo son lisas o casi transparentes y algunas veces blancas, posteriormente se presentan penachos blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa, responsable del pigmento caracterstico. (Barnett, y Hunter, 1982).
Las especies del gnero Trichoderma presentan conidiforos complejos y altamente ramificados en forma piramidal o cnica dando origen a esterigmas, con extremos ahusados. Al microscopio las filides se observan ms estrechas en la base que en la parte superior, permitiendo una buena correlacin entre el sistema de ramificacin del conidiforo y la disposicin de estas. (Barnett, y Hunter, 1982). Microscpicamente muchas especies del gnero crecen rpidamente en cultivos artificiales y produce un largo nmero de pequeas conidias verdes o blancas de clulas conidiogenas situadas al final de conidioforos extensamente ramificados. Esta caracterstica permite una relativa fcil identificacin de Trichoderma como gnero, pero el concepto de especies son difciles de interpretar, y all hay una considerable confusin sobre la aplicacin de nombres especficos. Rifai dividi el gnero Trichoderma en nueve especies sobre la base de caractersticas morfolgicas. Bisset, revis el gnero y adems incluy algunas Hypocrea anamorfas en el gnero, resultando en el establecimiento de cinco nuevas secciones (Hermosa et al., 2000).
La abundancia de Trichoderma spp en varios suelos, junto con su habilidad para degradar varios sustratos orgnicos, su versatilidad metablica y su resistencia a inhibidores microbianos, sugiere que este hongo puede poseer la habilidad para sobrevivir en varios nichos ecolgicos, dependiendo de las condiciones que prevalezcan y sobre las especies involucradas. (Riegel y Nielsen, 1996).
Trichoderma spp se encuentra clasificado segn Alexopulus et al., 1996 como:
El entendimiento de la diversidad gentica de cada cepa dentro de las especies de Trichoderma y sus mecanismos de biocontrol ha permitido mejorar la aplicacin de las diferentes cepas. Estos mecanismos son diversos, complejos y pueden actuar sinergicamente para lograr el control de enfermedades (Howell et al., 2003).
Las diferentes especies de Trichoderma ejercen el biocontrol de una manera indirecta bien sea por competencia por nutrientes o espacio, antibiosis (produccin de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o mediante la produccin de sustancias promotoras del crecimiento vegetal y de una forma directa por micoparasitismo (Bentez, 2004).
Algunas especies del gnero Trichoderma son muy comunes en diversos suelos, principalmente en suelos cidos y ricos en materia orgnica. Estas especies son fciles de aislar, de cultivar y de propagar en diversos sustratos y la mayora presentan un buen micoparasitismo (Bentez, 2004).
A pesar de la cantidad creciente de investigaciones dedicadas a estudiar la actividad antimicrobial de Trichoderma spp in vitro, el conocimiento de los mecanismos exactos responsables de la reduccin en la incidencia de las enfermedades, despus de la aplicacin de Trichoderma spp. es an insuficiente. (Yedidia et al., 1999).
2.2.1. Biocontrol por competencia
Fungistasis. Un buen antagonista es capaz de superar el efecto fungisttico que resulta de la presencia de diferentes metabolitos producidos por otras especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo condiciones adversas o competitivas (Bentez, 2004).
Las cepas de Trichoderma crecen rpidamente cuando se inoculan en suelo ya que son naturalmente resistentes a muchos compuestos txicos incluyendo herbicidas, fungicidas y pesticidas tales como DDT, y compuestos fenlicos (Chet,1997) adems recuperan muy rpidamente despus de la adicin de dosis subletales de algunos de estos compuestos. La resistencia a compuestos txicos puede estar asociada con la presencia en cepas de Trichoderma de sistemas de transporte ABC (Harman et al., 2004). Por esta razn son muy eficientes en el control de muchos patgenos como R. solani, Pythium ultimum o Sclerotium rolfsii, cuando se aplica en combinacin con fungicidas qumicos como el bromuro de metilo, benomyl, captan u otros qumicos (Vyas et al., 1995).
2.2.2 Competencia por nutrientes
La inanicin es la causa mas comn de muerte para microorganismos, la competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control biolgico de hongos fitopatgenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997).
Un ejemplo claro de este mecanismo de accin se encuentra representado en hongos filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de los mismos. Bajo condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreta agentes quelantes especficos de bajo peso molecular llamados sideroforos, que le permiten tomar el hierro en forma reducida (Eisendle et al., 2004), citado por (Chvez, 2004).
2.2.3 Antibiosis
La antibiosis ocurre durante la interaccin de los compuestos difusibles de bajo peso molecular o antibiticos producidos por cepas de Trichoderma que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Adems las cepas de Trichoderma producen metabolitos txicos voltiles y no voltiles que impiden colonizacin por microorgansimos antagonizados; entre estos metabolitos, la produccin de cido harzianico, alameticinas, tricholinas, peptaiboiles, antibiticos, 6-penthyl pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas, cido heptldico y otros estn siendo descritos (Howell et al., 1998).
2.2.4 Micoparasitismo
El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetracin subsecuente y muerte al husped. Trichoderma spp puede ejercer control directo por el rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y creciendo sobre el. (Bentez et al., 2004).
El proceso de micoparasitismo ejercido por Trichoderma se produce en varias etapas sucesivas. Comienza por el crecimiento quimiotrfico de Trichoderma hacia el hospedador, estimulado por molculas procedentes del mismo, de naturaleza desconocida. Las nicas que se han detectado hasta ahora son aminocidos y azcares, por lo que no cabe esperar que la induccin sea especfica del hospedador (Chet et al., 1981).
Los hongos del gnero Trichoderma se adhieren con carbohidratos unidos a lectinas en la pared celular del patgeno. Una vez Trichoderma es adherido se enrosca alrededor del patgeno y forma el apresorio (Howell, 2003). El paso siguiente consiste de la produccin de CWDEs, peptaiboles y enzimas hidrolticas CWDEs (Howell, 2003), lo cual facilita la entrada de la hifa de Trichoderma dentro del lumen del hongo parasitado y la asimilacin del contenido de la pared celular. (Bentez et al., 2004).
Degradacin de la pared celular: La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolticas producidas por los microorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Se ha observado que Trichoderma spp, produce celulasas, glucanasas y quitinasas que degradan in vitro la celulosa de las paredes celulares de microorganismos oomycetes y la quitina y B-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos Deuteromycetes como Gliocladium spp (Elad et al., 1982).
El sistema quitinoltico de Trichoderma comprende muchas enzimas y la lista de estos componentes inicia con la actualizacin de nuevas enzimas y genes reportados. Las quitinasas son divididas dentro de 1,4-- acetylglucosaminidasas (glucanasas ), endoquitinasas y exoquitinasas. De igual forma las (glucanasas) -1,3-glucanasas, as como las quitinasas actan sinrgicamente, e inhiben la germinacin de la espora y el crecimiento de algunos patgenos (Bentez, 1998; El-Katatny, 2001).
Se ha mostrado que 1,3 glucanasas inhiben la germinacin de esporas o el crecimiento de patgenos en cooperacin sinrgica con quitinasas (Bentez, et al., 1998) y antibiticos (Harman et al., 2004).
2.2.5 Sinergismo
El sinergismo entre la actividad de enzimas lticas y antibiticos, es la mejor estrategia para ser un buen controlador, adems de abrir el campo para posibles cepas transformantes que puedan producir las diferentes enzimas logrando un sinergismo que sea relevante (Bentez, 2004).
2.2.6 Biofertilizacin y mecanismos de defensa en plantas
2.2.7 Modificacin de la rizosfera
La habilidad para desarrollarse sobre o amplios rangos de condiciones externas de pH es un importante componente del complejo conjunto de caractersticas que Trichoderma, mejor adaptado a suelos cidos, encuentra durante esta interaccin con otros organismos. (Bentez et al., 2004).
Algunas cepas de Trichoderma harzianum controlan estrictamente su pH externo, asegurando valores ptimos para su propias enzimas secretadas (Bentez et al., 2004). As mismo Diferentes protenas extracelulares son sintetizadas a diferentes valores de pH.
Las cepas de Trichoderma estn siempre asociadas con races de plantas y ecosistemas de races. Algunos autores han definido las cepas de Trichoderma como plantas simbiontes oportunistas, organismos avirulentos, capaces de colonizar races de plantas por mecanismos similares a los de los hongos micorrizales y producir compuestos que estimulan el crecimiento como citoquininas, zeatinas y giberilinas (GA3) relacionadas con GA3; as como promover mecanismos de defensa en plantas. (Harman et al., 2004).
La colonizacin implica la habilidad para adherirse y reconocer races, penetrar y resistir metabolitos txicos producidos en respuesta a la invasin de organismos extraos, sean o no patgenos. (Bentez, et al., 2004). As mismo Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de races y su desarrollo, productividad del cultivo, resistencia a estrs abitico y la toma y uso de nutrientes (Arora y Elander, 1992) citado por Bentez 2004). La productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300% despus de la adicin de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii (Bentez, 2004).
Se ha observado que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia sistmica en las plantas, ya que aplicadas en la rizosfera, producen proteccin contra patgenos del suelo o foliares. Esta resistencia viene acompaada en muchos casos de un aumento de actividades peroxidasa y quitinasas en zonas distantes de la raz (Yedidia et al., 1999).
Las cepas de Trichoderma son generalmente ms resistentes a compuestos como fitoalexinas, flavonoides y terpenoides, derivados fenlicos, agliconas que muchos hongos: sin embargo su habilidad a colonizar fuertemente races de plantas depende de la capacidad de cada cepa a tolerar estos. Esta resistencia es considerada un requerimiento esencial para la colonizacin de plantas, siendo asociada con la presencia de sistemas de transporte ABC en cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004).
Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, pepino, berenjena, arveja, rbano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodn, frjol y pastos ornamentales (www.soil-fertility.com ). Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es as como (Yossen et al.2003), citado por (Castro y Rivillas 2006), demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, adems de reducir el dao causado por R. solani, el antagonista promovi el crecimiento de las plantas. Igualmente, (Inbar, et al 1994), citado por ( Castro y Rivillas 2006), observaron que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentn se increment significativamente el crecimiento de las plntulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adicin del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, desde la etapa de germinador para obtener plantas vigorosas y sanas.
De la misma forma Se han realizado algunos estudios preliminares con Trichoderma para la estimulacin del crecimiento sobre plantas de frjol, donde los aislamientos seleccionados estimularon la germinacin y presentaron un aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso de un 60% aproximadamente, lo que supone un incremento en los rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto Estrella demostr que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana al 23%, en longitud de las races y de estolones este incremento fue de un 30%. (www.soil-fertility.com ).
Se han evaluado parmetros de crecimiento y desarrollo del control de la enfermedad de R. solani por parte de Trichoderma spp. Estudios desarrollados (Rincn et al., 1991) demostraron el efecto antagnico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de caf, obteniendo una reduccin de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (Trichoderma 1644).
2.3 Trichoderma en el biocontrol
El biocontrol por parte de trichoderma en el manejo integrado de enfermedades en campo, causadas por hongos fitopatgenos, ha sido demostrada en su capacidad antagnica frente a agentes causales de pudriciones radiculares y marchitamientos como Rhizoctonia solani, Sarocladium sp y Sclerotinia sp en Arroz, Flores, Papa, Hortalizas, Frutales y Frjol, Fusarium oxysporum en Clavel, Botrytis cinerea en Flores, Colletotrichum gloesporioides, causante de Antracnosis en Tomate de rbol, Fresa, Frjol y Flores; as como la reduccin en la incidencia de la enfermedad llamada pata prieta , ocasionada por Phytopthora nicotianae var. nicotianae.
En 1990, Lewis, report que bajo condiciones de invernadero y de campo T. viride ejerca un control biolgico promisorio sobre Rhizoctonia solani en cultivos de tomate.
Por su parte, Salmando en 1996, report que la tcnica de pregerminacin controlada de semillas de Tomate Variedad chonto, en presencia de T. koningii, es una alternativa promisoria para contrarestar el efecto de R. solani en condiciones de semillero, mostrando porcentajes de proteccin del 70 %, mientras que el tratamiento que consista en semillas no pregerminadas y tratadas con T. koningii present slo un 15 % de proteccin.
As mismo Ochoa en 1996 determin en condiciones de invernadero que la utilizacin individual y combinada de T. hamatum, P.fluorescens y Sterptomyces coelicolor, ofreca un alto nivel de proteccin a claveles variedad Nora. Barlo contra Fusarium oxysporum.
Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, ms verstil y polifactico que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo sea patgeno de ninguna planta. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su produccin masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hbitat, donde los hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos significativos de pesticidas y otros qumicos. Adems su gran variabilidad se constituye en un reservorio de posibilidades de control biolgico bajo diferentes sistemas de produccin y cultivos ( www.infojardin.com/foro/showthread.php). Cuando se aplica Trichoderma en campo se deben tener en cuanta varios aspectos importantes que permitan su adecuada expresin, que se relacionan con la interaccin planta hospedante fitopatgeno susceptible ambiente favorable (Temperatura del suelo, humedad, presencia de oxigeno, pH), Condiciones del suelo (estructura, contenido de materia orgnica y nutrientes) y tiempo ( Villegas, 2005).
Asi mismo existen algunos principios bsicos de vital importancia para el xito del control biolgico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la importancia de un propgalo efectivo ( jven, hifa de activo crecimiento ) en tenencia a una base de alimento, edad de la preparacin, habilidad de los hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el patgeno; la consideracin de la cantidad de preparacin y el tiempo de aplicacin, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y despus de la aplicacin. ( Lewis and Papavizas ). Varios Autores han realizado estudios tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a R. solani. Rodriguez, en 2002 evalu la eficiente accin inhibitoria de la utilizacin de cepas de Trichoderma y Pseudomonas Como antagonistas contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero.
La adicin de hongos tales como Trichoderma y gliocladium antes de realizar la siembra, en suelos infestados por R. solani, disminuye de manera considerable la incidencia y severidad de las enfermedades que ocasiona este patgeno en la mayora de los cultivos como la zanahoria, el frijol, el tomate, el clavel y la papa, en los cuales se ha intentado controlar el hongo. Al parecer el mtodo da buenos resultados en el aumento de las poblaciones de Trichoderma y otros microorganismos que son antagonistas de Rhizoctonia solani y, quiz la liberacin de algunos compuestos qumicos fungitxicos ( Agrios G, et al.,1998). De la misma manera Cook y Baker distinguen varias especies de Trichoderma: T hamatum, T viride, T harzianum, T. koningue y T. polyspermun, en el control de hongos fitopatgenos ( Chet I, et al.,1980).
2.4 Trichoderma como biofertilizante
En Colombia se han realizado algunos estudios enfocados a la optimizacin de parmetros para la produccin de Trichoderma. Chvez, (2006) evalu la produccin de este hongo mediante fermentacin slida, lquida o bifsica empleando diferentes sustratos como arroz, avena, soya, trigo, cebada, entre otros y diferentes condiciones de temperatura y fotoperodo. Los resultados indicaron que el proceso de fermentacin slida empleando como sustrato arrozagua destilada a 25C y la exposicin constante a la luz permiti mayor recuperacin (45x10 18 conidios/mL), con 88 y 96% de germinacin a las 18 y 24 horas respectivamente y una pureza estimada de 92.1%.
Este proceso representa una alternativa viable para produccin tanto industrial como artesanal de un inoculante biolgico de buena calidad a base del Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero, recin transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el crecimiento y desarrollo de las mismas.
Algunas industrias agrcolas y biolgicas en Colombia como: agrobiolgicos del campo Ltda, biolgicos y ecolgicos de Colombia y Orius biotecnologa entre otros, han desarrollado productos biolgicos para el agro, como biofertilizantes y biocontroladores de organismos fitopatgenos. Cepas especficas a base de hongos como Trichoderma harzianum (exporaxx wp) desarrollada por Orius Biotecnologa, as como (Fitoripen wp) a base del hongo Trichoderma spp como agente microbial, desarrollado por saber agrobiolgicos y Trichode wp de Orius biotecnologa, han permitido la activacin de mecanismos antagonistas frente a hongos fitopatgenos que afectan los cultivos de importancia agrcola.
Ahora bien, el conocimiento de estos nuevos biofertilizantes a base de concentracin de esporas a partir del hongo Trichoderma spp ha permitido el desarrollo de estudios in vivo para la induccin de respuesta en plantas e incremento en la produccin de cultivos.
Brunner y Zeilinger, en 2005), en estudios in vivo, demostraron los progresos del hongo de biocontrol Trichoderma atroviridae para la induccin de respuestas de defensa en plantas de frjol, frente al patgeno foliar B. cinerea, conteniendo 1x10 8 esporas/ml tipo salvaje.
Reynoso y colaboradores (2006), demostraron en estudios de biocontrol bajo condiciones de cultivo, que la aplicacin de diferentes concentraciones de inculo de T. harzianum (10 2 y 10 6 ), produjo un notable incremento en la cosecha de man. Se encontr un incremento en el porcentaje de 45 a 76% en zonas naturalmente infestadas y de 57 a 95% en suelos artificialmente infestados, cuando las semillas fueron tratadas con T. harzianum 10 6 .
2.5 Rhizoctonia solani
Es uno de los hongos ms importantes reconocido como patgeno de plantas. Por lo general causa enfermedades en una amplia gama de hospederos, afectando tanto partes areas como subterrneas. Usualmente se le conoce como hongo estril, debido a que durante muchos aos se pens que era incapaz de producir algn tipo de espora, ya fuera sexual o asexual. Actualmente se sabe que Rhizoctonia solani produce basidiosporas que hacen que esta especie sea un basidiomiceto al que se le denomin Thanatephorus cucumeris (Agrios, 2004). Un considerable nmero de aislamientos de Rhizoctonia son saprtrofos, aunque otros son micorrizales sobre orqudeas u otras plantas.
2.5.1 Biologa de Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani segn Agrios (2004) ha sido clasificado como:
La especie R solani, fue definida por Candolle (1815), Sobre la base de la produccin de esclerocios de textura uniforme con hilos hifales emanantes de estos, y la asociacin del micelio con races de plantas vivas. (Sneh, et al, 1991). Es la especie ms conocida dentro del gnero Rhizoctonia sp. Fue originalmente descrito en 1858 por Julis Kuhn (Barnett y Hunter 1982).
Dentro de las caractersticas que permiten clasificar taxonomicamente aislamientos de R.solani son: tendencia de pigmentacin hifal caf, ramificacin prxima al septo distal de clulas en hifas vegetativas jvenes, estrechamiento de hifa y formacin de septos a una distancia corta del punto de origen a la ramificacin hifal, Septo dolpora y clulas multinucleadas en hifa vegetativa joven (Parmeter y Whitney, 1970).
El anamorfo es denominado Rhizoctonia solani y su teleomorfo Thanatephorus cucumeris, es un basidiomiceto no productor de esporas asexuales (conidios) y productor ocasional de basidiosporas (esporas sexuales). En la naturaleza se reproduce asexualmente y se encuentra en forma de micelio vegetativo y/o esclerocios (Agrios, 2004). Macroscpicamente las colonias jvenes de Rhizoctonia solani se caracterizan por ser incoloras, algodonosas y planas aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse la maduracin, la colonia toma una coloracin marrn (Ceresini et al., 1999).
Microscpicamente el micelio est constituido de hifas fraccionadas en clulas individuales polinucleadas y comunicadas entre si a travs de un poro septal que permite el movimiento del citoplasma, las mitocondrias y los ncleos de una clula a otra (Ceresini et al., 1999). Caractersticas tales como clulas moniliales, esclerocio, hifas ms grandes a 5 um en dimetro, rpida tasa de crecimiento y patogenicidad estn usualmente presentes. Aunque puedan estar ausentes en algunos aislamientos.
Este hongo, parasiticamente no especializado forma escleorcios en el suelo sobrevive por largos periodos de tiempo en ausencia de hospederos, mediante tales estructuras o por medio de hifas de pared gruesa sobre residuos de plantas; al conservar estas caractersticas de patgeno no especializado, es un buen competidor saproftico, puede colonizar muchos sustratos y puede tolerar cambios amplios de ambiente; esta condicin le favorece tanto para su supervivencia como para su accin patognica sobre tejidos juveniles o en stress fisiolgico inadecuado (Gonzlez et al., 1989 ; Contreras et al., 1996).
La especie fitopatgena Rhizoctonia solani ocasiona perdidas importantes, en la mayora de plantas perennes y anuales, incluyendo casi todos los cultivos hortcolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. Entre las enfermedades ms comunes causadas por este fitopatgeno est el llamado damping-off o cada de las plntulas, como consecuencia del estrangulamiento y necrosis del tallo a nivel de cuello en plntulas recin emergidas. Produce una reduccin Significativa del vigor de las plantas y de la produccin de tubrculos en cultivos de papa (Cedeo, 2001).
En clavel el marchitamiento lento fungoso causado por una raza de R. solani produce una enfermedad que se caracteriza por la reduccin en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente y la planta se marchita y muere. Al hacer un corte del tallo, se observa a nivel vascular una coloracin marrn. http://www.ica.gov.co/publicaciones/plagas/clavel/endemica/clavel35.htm
Para entender la relacin que se establece entre patgenos y antagonistas, es necesario realizar estudios in vivo e in Vitro , que permitan por una lado conocer a fondo los aspectos biolgicos, bioqumicos y ecolgicos de la interaccin y por otro lado monitorear la actividad de los microorganismos biocontroladores en campo para enfocar de manera ms precisa el control y manejo de la enfermedad.
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 Formulacin del problema
El incremento de enfermedades en plantas, causadas por un gran nmero de hongos fitopatgenos ha obligado a los agricultores a la aplicacin de grandes cantidades de fungicidas e insecticidas qumicos durante dcadas. Este uso plantea una grave amenaza para la salud de los humanos y el medio ambiente, provocando la aparicin de organismos resistentes a estos productos. La accin nociva de fungicidas qumicos sobre los cultivos agrcolas ha originado entre otros problemas resistencias de plagas y patgenos, contaminacin de los suelos y aguas de riego, de los animales y de los mismos seres humanos.
3.2 Justificacin
La utilizacin de fungicidas qumicos durante dcadas para el control de enfermedades en cultivos agrcolas ha hecho inminente la bsqueda de alternativas amigables, que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre el medio ambiente. Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado al hombre a buscar metodologas de control, que contribuyan en la prevencin o reduccin de los efectos a corto o a mediano plazo de estos compuestos frente al dao ambiental.
El desarrollo basado en la conservacin, debe proteger la estructura, funcin y la diversidad biolgica de los sistemas naturales agrcolas, buscando mantener un equilibrio y un control de nuestro medio ambiente y los recursos naturales. Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de la agricultura. El manejo biolgico y controlado de los cultivos, se presenta como una alternativa ecolgica y eficaz frente a los numerosos y crecientes problemas causados por microorganismos patgenos presentes en nuestro agro ecosistema.
Los hongos biocontroladores como Trichoderma spp ofrecen buenas posibilidades como antagonista de hongos patgenos de plantas, actuando como hiperparasitos competitivos, de la misma manera debido a su ubicuidad, facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rpido en gran nmero de sustratos esta presente en todos los suelos agrcolas; sumado a la resistencia y persistencia de estos hongos en cultivos y cosechas, promueve una continua y progresiva investigacin y anlisis en estudios de control biolgico de enfermedades en plantas.
En este contexto el presente trabajo evalu la capacidad biocontroladora de algunos aislamientos nativos y comerciales de Trichodema spp. Frente al hongo fitopatgeno R. solani bajo condiciones de invernadero. Los resultados del presente estudio permitirn apoyar los programas de manejo integrado de plagas empleando tecnologas limpias y amigables con el medio ambiente.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Evaluar la capacidad antagonista in vivo de 6 aislamientos Trichoderma frente al hongo fitopatgeno Rhizoctonia solani
4.2 Objetivos especficos
Confirmar la patogenicidad de un aislamiento de R solani sobre plantas de clavel.
Obtener inculos de 6 aislamientos de Trichoderma y confirmar su viabilidad y pureza
Verificar la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el fitopatgeno R solani bajo condiciones in vitro
Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el hongo patgeno Rhizoctonia solani.
Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo in vivo con resultados obtenidos en condiciones in vitro
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Diseo de la investigacin:
5.1.1 Ubicacin
Este proyecto se desarroll en la estacin experimental San Francisco Javier ubicada en la vereda el Mortio, municipio de Cogua Cundinamarca 61 Km al norte de la ciudad de Bogot y las instalaciones del laboratorio de Microbiologa ambiental y de suelos del Departamento de Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana.
5.1.2 Microorganismos
Se utiliz un aislamiento nativo de Trichoderma ( T3 )aislado en trabajo previo el cual fue suministrado por el cepario de micologa del Departamento de Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana, 4 aislamientos provenientes de suelo de cultivos de flores de la sabana de Bogot ( Tsp5 Tc1,Tv1,Ti1, y un aislamiento nativo procedente de bosque alto andino, suministrado por la Doctora Amanda Varela del Laboratorio de Ecologa Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT).del departamento de biologa
Para las pruebas de antagonismo se evaluaron aislamientos del patgeno Rhizoctonia solani suministrados por el laboratorio de fitopatologa del Centro de Investigaciones Agroindustriales (CIAA) de la Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano. Se seleccion un aislamiento por la capacidad de infectar esquejes de clavel de la variedad Everest.
5.1.3. Material vegetal
Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo in vivo se utilizaron esquejes enraizados de clavel Dianthus caryophyllus suministrados por la compaa Amrica flor.
5.1.4. Elaboracin del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma spp
Con el fin de determinar la estabilidad de las cepas durante el estudio y el mantenimiento de las condiciones iniciales, se realiz un banco de trabajo a partir de 6 aislamientos de Trichoderma evaluados por Chves 2004 y que se encuentran conservados a -70 o C. A partir de los aislamientos, se realizaron repiques sobre agar papa dextrosa (PDA).
De cada uno de los aislamientos se prepar una suspensin con una concentracin igual a 10 8 esporas/ml, en un volumen final de 10ml en PBS. Esta suspensin se utiliz posteriormente como inculo 10% para la fermentacin discontinua de 24-48 horas, 100rpm, y una temperatura de 25 O C en caldo papa dextrosa, en un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.
La evaluacin del crecimiento, viabilidad y evaluacin de cada una de las cepas, se realiz mediante cultivo en placa, tincin con azul de lactofenol, y microcultivo de acuerdo al mtodo propuesto por Sergey et al., 2000.
Guevara y Urcia en 2002 demostraron que se puede realizar la fermentacin discontinua, en un Erlenmeyer de 250ml conteniendo caldo papa dextrosa con 10 ml de una suspensin conidial en una concentracin de 10 8 conidias/ml. El cultivo se incub a una temperatura de 28C por 48 horas con agitacin a 100 rpm logrando as un volumen efectivo de trabajo de 50 ml.
5.1.5 Preparacin del inoculo de aislamientos de Trichoderma.
Para evaluar el crecimiento libre de cada uno de los 6 aislamientos del antagonista, a partir de los aislamientos crecidos en tubos de vidrio de (16X150), se realiz un repique en cajas de PDA hasta obtener un crecimiento radial de 90mm aproximadamente. Posteriormente se tomaron discos de 0.5cm de dimetro de zonas de crecimiento similares y sern sembradas sobre PDA (Cundom, 2003)
Para cada cepa de Trichoderma en estudio se tomaron por triplicado datos sobre el crecimiento radial en mm a las 24, 48, 60 y 72h.
5.1.6 Preparacin del inculo de Rhizoctonia solani
Para la preparacin del inculo de Rhizoctonia solani se tuvieron en cuenta su crecimiento en agar papa dextrosa durante 7 das. El micelio del hongo se resuspendi en agua destilada esterilizada, hasta obtener 10 3 UFC/ml en PDA.
5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro
Previo al enfrentamiento del patgeno y el antagonista Trichoderma spp, se evalu el crecimiento libre en el centro de la caja de petri con agar PDA del patgeno Rhizoctonia solani y los seis aislamientos del antagonista Trichoderma spp ( T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1, T235 ). Se inocul por triplicado en cada caso en el centro de la caja de petri.
5.1.8 Elaboracin de la prueba de antagonismo
Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de Trichoderma, sobre el patgeno Rhizoctonia solani, se aplic un diseo completamente al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental correspondi a una caja de Petri con agar PDA.
Para las pruebas de enfrentamiento se tomarn discos de 0,5cm de dimetro obtenidos a partir de propgulos del patgeno (crecimiento libre), y se sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centmetro del borde de la caja (Cundom, et al., 2003).
Este procedimiento se realiz por triplicado. Despus de 24 horas de incubacin a una temperatura de 28C el patgeno Rhizoctonia solani fue sembrado a 1cm del borde de la caja pero en posicin opuesta un disco de 0,5cm de dimetro del antagonista (Cundom, et al., 2003; Holmes, et al., 2004).
5.2 Evaluacin de la capacidad antagonista in vivo
Esta prueba se llev a cabo bajo condiciones de invernadero en un sustrato de Cascarilla/Turba 3.1. Se utilizaron los aislamientos Trichoderma T3. TrichodermaTsp5, TrichodermaTc1, TrichodermaTV1, Trichoderma Ti1 y TrichodermaT235.
Para evaluar la capacidad antagnica de los 6 aislamientos de Trichoderma se utilizaron esquejes enraizados de clavel. Est prueba se llev a cabo bajo condiciones de invernadero en materos con Cascarilla/Turba humedecida.
Los esquejes fueron inicialmente inoculados por inmersin de las races lesionadas levemente en una suspensin de Rhizoctonia solani por 5 minutos. Posteriormente cada uno de los esquejes de clavel infectados con el patgeno, fueron colocados individualmente en materos con la mezcla de cascarilla: turba.
Una vez inoculado el patgeno, despus de 48 h, se realiz la aplicacin al suelo con una suspensin de 10 8 conidias/ml de cada uno de los aislamientos de Trichoderma spp. (Tabla 1). La concentracin de conidias se ajust utilizando la cmara de Neubauer.
Luego de ser inoculado el material vegetal con el patgeno y el sustrato con el antagonista, cada cuatro das se realizaron registros de: altura de la planta, incidencia de la enfermedad (% de plantas vivas), longitud de la raz, peso seco de la parte area y de raz, nmero de hojas, color y apariencia de las plantas.
El peso seco total, de la parte area y de raz del material previamente medidio, se determin mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55 O c durante 48 horas. La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo, durante todo el ensayo.
5.3 Diseo experimental
El ensayo de antagonismo in Vitro se realiz por triplicado para cada uno de los tratamientos.
El ensayo de antagonismo in vivo se desarroll empleando esquejes de clavel (Dianthus caryophyllus) La metodologa del ensayo se desarrollar con un diseo completamente al azar con 3 repeticiones para cada tratamiento. Cada tratamiento constar de 24 plantas de clavel para cada uno de los 9 tratamientos.
Tabla 1. Tratamientos para la evaluacin de antagonismos "in vivo
Tratamiento nomenclatura Controlador Patgeno 1 T 3 Aislamiento nativo (PUJ) R. solani 2 Tsp 5 Cultivo de Flores R. solani 3 Tv 1 Cultivo de Flores R. solani 4 Tc 1 Cultivo de Flores R. solani 5 Ti 1 Cultivo de Flores R. solani 6 T-235 Aislamiento nativo ( LESYHT) R. solani 7 Control infeccin -------------------- R. solani
8 Control Trichoderma Trichoderma Tsp ------------- 9 control Ccto -------------------- ------------
5.4 VARIABLES DE ESTUDIO
Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 das registros de:
Altura de la planta Longitud parte area Longitud raz Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas) Sntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos. Peso fresco total Peso seco parte area Peso seco de raz Peso seco total
Los tratamientos control corresponden a:
Control de infeccin: Plantas con el patgeno Rhizoctonia solani Control de crecimiento: Plantas sin patgeno ni antagonista Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235
Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se llev a cabo un anlisis de varianza ANOVA y la comparacin entre los tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los anlisis in Vitro como para los in vivo .
Figura 4. Tcnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia solani. Fotografa tomada 72 horas despus del inicio de la prueba.
La expresin de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de metabolitos difusibles y altamente txicos de carcter enzimtico (Celulasas, Quitinasas y Proteasas) acompaados por otros compuestos encargados de la inhibicin del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles, antibiticos, 6-pentil--pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas, acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limn, et al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son motivos para la utilizacin de este microorganismo como antagonista, para el control de fitopatgenos.
Tabla 4. Porcentaje de inhibicin micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas.
FIGURA 10. Aspecto del material vegetal 15 das despus de la inoculacin con el patgeno
Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer este hongo fitopatgeno cuando encuentra accin directa sobre sin la eficiente accin biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13). Barrera et al.,1997, afirman que la aparicin de los primero sntomas, se ve influenciado por la agresividad del aislamiento del patgeno. Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un crecimiento a nivel radicular y de la parte area progresivo en el tiempo y mayor al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue menor, en comparacin con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14).
Figura 11. Evaluacin de la longitud de la parte area de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani.
Figura 12. Sntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani.
Por otra parte, la accin positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y calidad en los esquejes, as como un mayor crecimiento total, al ser comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de infeccion present los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G), amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes.
Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las races de las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los dems tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion (Figuras 13 y 13H). Esto confirma adems los resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre in vitro donde se observ que los aislamientos T3 y T235 tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patgeno R.solani (Tabla 3, Figura 3).
FIGURA 13. Aspecto del material vegetal 19 das despus de la inoculacin con el patgeno.
Figura 14. Evaluacin de la longitud total de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepcin de Tsp5, muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento areo y radicular, as como ausencia de signos o sntomas de la enfermedad por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani. Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte area y radicular en el control con Trichoderma, el cual muestr un crecimiento de 16,1 cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control con el patgeno el cual mostr para estas mismas variables, resultados de 15,3 cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados coinciden con los descritos por Lpez et al., 1999, el cual establece que Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas, que actan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas races) en las partes jvenes de stas, acelerando su reproduccin celular, logrando que las plantas alcancen un desarrollo ms rpido que aquellas plantas que no han sido tratadas con dicho microorganismo.
De la misma forma que lo observado al da 15, en el da 19, la patogenicidad del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia dbil de los esquejes y una menor tasa de crecimiento, adems se present amarillamiento, marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19). Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este tiempo, respecto a la longitud de la parte area, ( Figura 10), donde se manifiesta que la accin patgenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ). Los sntomas observados en las plantas de clavel en el da 19, han sido reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978, quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reduccin en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera.
En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicacin de los diferentes aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel, as como de la accin antagonista ejercida por los diferentes tratamientos frente al hongo fitopatgeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05) con relacin al control de infeccin.
Figura 15. Evaluacin del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los mayores valores de longitud de la parte area, longitud total y peso fresco total (Figuras 10 y 13 y 15) as como altos valores en cuanto a la longitud radicular (Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con mejor apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1, present valores significativamente altos para las variables de peso fresco ( Figura 15)(Anexo 1C ). Varios autores han demostrado que la adicin de aislamientos especficos de Trichoderma en la rizsfera pueden resultar en promocin de crecimiento en plantas ; Bailey et al., 1998; Bjorkman et al., 1998; Yedidia et al., 1999; Harman, 2000; Naseby et al., 2000; Rojo, et al., 2006). Es interesante anotar que a partir de la tercera semana se observa un crecimiento significativo en la longitud y el peso de las plantas de clavel con el tratamiento TC1, logrando alcanzar niveles similares para los observados en el control Trichoderma y el aislamiento T3 (Figura 15). Al parecer la accin promotora del crecimiento de Tc1 sobre los esquejes de clavel es un poco ms lenta en el tiempo, si se compara con las dems cepas de Trichoderma utilizadas, ya que solo a partir de la segunda a tercera semana se evidencia una real actividad de crecimiento de los esquejes de clavel, Estos resultados difieren notablemente de los obtenidos in vitro, donde se estableci que la menor tasa de crecimiento libre de las sps de Trichoderma cultivadas en el tiempo perteneci a la cepa TC1 (Figura 2, Tabla 3). Se confirma lo observado por otros autores (McLeod et al., 1995; Smith et al., 1990) respecto a que la seleccin previa de antagonistas mediante cultivos duales es til, pero no garantiza el comportamiento de stos en invernadero.
En la cuarta semana se confirma la capacidad antagonista in vivo en los tratamientos con Trichoderma donde se observ un desarrollo normal de las plantas, con hojas, tallos y races saludables (Figura 16). Los esquejes de clavel en los tratamientos T235 y control Trichoderma siguen presentando el mayor ndice de crecimiento (Figura 16E-16F), reflejado en mayores valores de peso seco de raz y parte area (Figuras 17,18 ). Yedidia, et al., en 1999, en trabajo con Trichoderma harzianum afirman que esto es debido posiblemente a que Trichoderma penetra y se desarrolla en la epidermis exterior, estimulando el sistema de defensa de la planta por cambios metablicos. por otra parte, Arora et al. en 1992, afirma que la colonizacin de raz por cepas de Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raz en muchos cultivos de plantas bajo condiciones de invernadero.
Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 das despus de la inoculacin con el patgeno
Vale la pena resaltar que entre los das 19 y 23, se encuentran los resultados de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho mayores al encontrado en el control del patgeno que mostr un rendimiento negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235 respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente, fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de Trichoderma. Estos resultados confirman an ms la accin promotora del crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes aislamientos de Trichoderma, as como el efecto antagonista ejercido por el hongo, sobre el fitopatgeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005, determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300% despus de la adicin de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii.
Figura 17. Evaluacin del peso seco areo de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
El peso seco de la parte area y de las races de las plantas inoculadas con Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenci claramente de las inoculadas slo con el patgeno, observndose un desarrollo significativo de races y parte area en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E- 1F). Harman et al., en 1998, determina que la promocin del crecimiento vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciacin de la germinacin de las semillas, una floracin ms abundante y temprana y aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986). Por otra parte el Control con R.solani evidenci la presencia activa del patgeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento, marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel ( Figura 19-21).
Figura 18. Evaluacin del peso seco raz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de crecimiento de la parte area y radicular de los esquejes de clavel, comparado con el control de crecimiento y con el control de infeccin ( Figura 9 ) ( Figura 23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento Tsp5. Esto se confirm por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de sntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de la parte area y peso evaluadas, con relacin a los tratamientos control de crecimiento y control de infeccin hacia el da 23 del ensayo. Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es as como Yossen et al.,en 2003 demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, adems de reducir el dao causado por R. solani, el antagonista promovi el crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentn se increment significativamente el crecimiento de las plntulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adicin del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el
beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas y sanas ( Castro 2005).
Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad por R. solani en el material vegetal.
La apariencia y calidad de los esquejes, sntomas visibles de amarillamiento, y marchitamiento, as como tejidos necrosados, la disminucin en la calidad y cantidad de las races y muerte en los esquejes de clavel (Figura 19- 21), confirma la actividad del hongo fitopatgeno , durante los ensayos en invernadero, para los tratamientos con el control R.solani (Figura 19 A y B) y el Tratamiento con el aislamiento Tsp5 ( Figura 19 CyD). Benitez et al., 2004, establece que las cepas de Trichoderma pueden colonizar races de plantas en crecimiento y proteger contra infecciones. La colonizacin implica la habilidad para adherirse y reconocer races de plantas, penetrar la planta y resistir metabolitos txicos producidos por las plantas en respuesta a la invasin de organismos extraos, sean o no patgenos.
Figura 20. Evaluacin del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La evaluacin del nivel de dao radical, mostr que este fue menor en presencia de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el control de infeccin (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella demostr que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las races y de estolones este incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php).
Figura 21. Mortalidad de esquejes de clavel en los tratamientos por accin patognica de R. solani La buena actividad biocontroladora ejercida por parte del hongo Trichoderma sobre el fitopatgeno R. solani (Figura 21, 24), qued demostrado con la ausencia de sngos y sntomas de la enfermedad, asi como la baja incidencia de muerte de los esquejes bajo la accin de las diferentes especies de Trichoderma a travs del tiempo, a excepcin de Tsp5, que a lo largo del ensayo demostr una baja accin antagonsita sobre R .solani ( Figura 19C,19D- 21). Tal y como lo establece Meera et al ., en 1994, quien determina que la accin de biocontrol ejercida por el hongo antagonista, puede ser debido a que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia sistmica de plantas, ya que aplicadas en la rizosfera producen proteccin contra patgenos del suelo o foliares.
No obstante al excelente antagonismo ejercido por Trichoderma, se pudo determinar una clara actividad patognica del hongo R. solani en los esquejes de clavel, cuando este se aplico como tratamiento control ( Figura 19A,19B- 21). Castro y Osorio en 2005, demostraron el efecto antagnico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de caf, obteniendo una reduccin de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (T1664).
Es interesante notar que los resultados obtenidos durante la experiencia para el desarrollo radicular de los esquejes de clavel muestran que existi una actividad directa de Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en los esquejes de clavel y del aumento de la zona rizosfrica ( Figura 22-23-24). La habilidad de cepas de Trichoderma para proteger plantas contra patgenos de races esta siendo atribuido a su efecto antagnico contra patgenos invasivos, Sin embargo esta asociacin hongo-raz adems estimula mecanismos de defensa en plantas. ( Benitez., et al 2004)
T3 TSP5 Tc1
Tv1 Ti1 T235
Control Trichoderma Control R. solani Control de crecimiento
Figura 22 Apariencia de las races en los diferentes tratamientos.
De igual manera se observ que los tratamientos con el aislamiento T235 y el control Trichoderma ( Figuras 22E, 22G y 23) mostraron los mayores valores de longitud de raz, adems de una excelente apariencia de sus races. As mismo el tratamiento Tc1 mostro valores significativos a nivel radicular durante las ultimas dos semanas de evaluacion. El mayor tamao de races influye de manera directa en el crecimiento areo de la planta, tal y como quedo en el crecimiento de los esquejes con el control de Trichoderma demostrado en diferencias mayores al 25% respecto al control de crecimiento y del 75% aproximadamente para el control con R. solani (Figuras 22C,D y E y Figura 23)
Figura 23. Evaluacin de la longitud de raiz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicacin de Trichoderma spp posterior a la infeccin con R. solani
Benitez et al., 2004 en estudios con Trichoderma demostraron que la colonizacin de races por este hongo frecuentemente incrementa el crecimiento y desarrollo de races, productividad de cultivos, resistencia a estrs abiticos y la toma y uso de nutrientes. De igual forma Bjorkman et al., en 1998 estableci una hiptesis en la que propone que Trichoderma es capaz de limitar el efecto del dao oxidativo en la raz.
Para el dia 27 despus de la aplicacin del antagonista se confirm el efecto ejercido por Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en plantas y antagonista del hongo fitopatogeno R .solani ( Figura 24). Se observa una excelente apariencia y calidad de los esquejes, as como un gran desarrollo de la parte area y radicular. Por otra parte para la ltima semana se hace mas evidente la accin patognica de R. solani, sobre las plantas, evidenciado por el aumento en el nmero de marchitamientos y necrosamiento de tejidos, as como la muerte de esquejes ( Figura 19 y 21). No obstante estos sntomas estuvieron ausentes durante el desarrollo del ensayo en las plantas bajo la accin del hongo Trichoderma, a excepcin del aislamiento Tsp5
Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 das despus de la inoculacin con el patgeno . Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rpido desarrollo y colonizacin de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infeccin, como reas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden fsicamente el acceso y establecimiento del patgeno en su hospedador.
Es claro que a pesar de la inoculacin del hongo patgeno Rhizoctonia solani sobre los esquejes de clavel, el antagonista ejerci un biocontrol efectivo sobre el hongo fitopatgeno en condiciones de invernadero a lo largo del la investigacin. Se encontr que el tratamiento con el control con Trichoderma, mostr los mejores resultados respecto a crecimiento de la parte area y radicular (Figura 22)(Anexos1A-1B), evidenciado por un mayor crecimiento y un aumento en el crecimiento total de cerca del 46% respecto al control de crecimiento ( Figura 14) ( Anexo 1C); de igual manera reflejados en las mayores rendimientos en peso fresco y peso seco total frente a los controles del patgeno y de crecimiento ( Figura 15 y 20). Por otra se pudo confirmar que los mejores resultados en todas las variables evaluadas se obtuvieron en los aislamientos de Trichoderma ( T235 y T3). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en los estudios in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), que demostraron que los aislamientos T235 y T3 presentaron las ms altas tasas de crecimiento libre en el tiempo, del mismo modo el aislamiento T235 present el mayor PIM en las pruebas de antagonismo in vitro frente al hongo fitopatogeno R .solani. Vale la pena resaltar que el aislamiento con Tc1 mostr una buena actividad bajo condiciones de invernadero a partir de la segunda semana, convirtindose junto al control con Trichoderma, T235 y el T3 en los mejores aislamientos. No obstante a los buenos resultados obtenidos en campo para el aislamiento Tc1, estos difieren notablemente a los desarrollados in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), donde Tc1 mostr los menores valores de crecimiento libre en el tiempo. Estos resultados confirman lo dicho por Macleod, quien establece que los resultados in vitro de especies de Trichoderma no garantiza plenamente su actividad y antagonismo sobre hongos fitopatgenos en condiciones de campo o invernadero. Por otra parte se puede inferir que el que el tratamiento Tsp5 no ejerci un biocontrol efectivo en esquejes de clavel para el control de enfermedades ocasionadas por el hongo fitopatgeno R. solani ( Figura 19,21); Siendo Tsp5 un hongo utilizado en cultivos de flores en la sabana de Bogot, debera ejercer una accin efectiva sobre el fitopatgeno en cultivos de clavel, situacin por la cual es evidente buscar alternativas tendientes a mejores rendimientos en pro del control de organismos fitopatgenos tales como R. solani, y que pudieran encontrar solucin en el aislamiento nativo T235, el cual mostr los resultados ms relevantes para el control del hongo patgeno en condiciones de invernadero y en la promocin del crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest.
Los resultados demuestran, la actividad antagonista diferencial de los aislamientos de Trichoderma estudiados frente a la accin patog`+enica ejercida por el hongo fitopatgeno R. solani, y su accin en la promocin en el crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest .
En este trabajo de investigacin se demostr que 5 de los 6 aislamientos de Trichoderma aplicados en la rizsfera de esquejes de clavel de la variedad Everest en condiciones de invernadero ejercen una buena accin antagonista frente al fitopatgeno R. solani.
Los aislamientos (Control Trichoderma, T3 y T235) adems de mostrar una excelente capacidad de biocontrol, confirmaron los mayores valores en cuanto a todas las variables evaluadas en el ensayo, asi como la mejor apariencia de las plantas comparada con los controles. Estos resultados corroboran los obtenidos por varios autores con relacin a la habilidad de Trichoderma para promover el crecimiento vegetal.
CONCLUSIONES
Se logr evaluar la capacidad antagonista in vitro de seis aislamientos de Trichoderma frente al fitopatgeno Rhizoctonia solana. Donde el aislamiento nativo T235 mostr los mayores valores de crecimiento libre y porcentaje de inhibicin micelial ( PIM).
Bajo las condiciones evaluadas, los aislamientos control Trichoderma, asi como T235 y T3 pueden ser considerados los de mayor importancia en la promocin del crecimiento vegetal y en pro del control biolgico del hongo fitopatgeno R .solani y la reduccin de los sntomas de la enfermedad en esquejes de clavel variedad Everest en condiciones de invernadero.
Los resultados obtenidos en condiciones de invernadero fueron consistentes a los obtenidos en condiciones in vitro para los aislamientos que demostraron tener una mayor tasas de crecimiento y un mayor PIM, tal y como quedo demostrado con los aislamientos T235 Y T3.
Los resultados presentados a travs de la presente investigacin sugieren que la utilizacin de especies de Trichoderma para el control de R. solani en esquejes de clavel es una estrategia promisoria para el manejo de las enfermedades en condiciones de invernadero. Esta afirmacin esta soportada por el factor de que todos los aislamientos de Trichoderma spp evaluados, a excepcin de Tsp5, redujeron la severidad de la enfermedad en plantas. Tales reducciones fueron evidentes debido al bajo nmero de plantas afectadas por R. solani cuando se enfrentaron al hongo Trichoderma y a la baja aparicin de signos y sntomas de la enfermedad sobre los esquejes de clavel evaluados.
RECOMENDACIONES
Para futuros estudios seria indicado la utilizacin de un mayor nmero de especies de Trichoderma en esquejes de clavel en condiciones de invernadero.
Sera importante el uso de camas de enraizamiento para el desarrollo de futuros estudios con especies de Trichoderma para el control biolgico de hongos fitopatgenos, con el fin de asegurar la confiiablidad de la investigacin.
Uno de los objetivos a futuro ser el de combinar bacterias y hongos antagonistas como una alternativa promisoria en el control biolgico, de patgenos con alta versatilidad ecolgica en condiciones de invernadero, tal y como es el caso de Rhizctonia solani..
Las grandes posibilidades de uso del microorganismo en el control de enfermedades en cultivos hortcolas, estimula las investigaciones al respecto. Sin embargo orienta a la seleccin de un mayor nmero de especies de Trichoderma o de lineas ms eficientes de los organismos antagnicos; adems de la alteracin del medio ambiente de manera que el, o los antagonistas resulten favorecidos; el aprovechamiento de las sustancias antibiticas que producen y la aplicacin precisa de ellos de acuerdo al ciclo de la enfermedad del fitopatgeno que se desea controlar son variables de importancia para la mayor efectividad y confiabilidad de las especies de Trichoderma investigadas.
Realizar pruebas entre las especies del hongo Trichoderma con otros fitopatgenos de importancia agrcola, para identificar las posibles interacciones y antagonismos.
TIEMPOS TEMPERATURAS MXIMAS ( O C ) TEMPERATURAS MINIMAS ( O C ) 6 de octubre 32 14 7 de octubre 33 13 8 de Octubre 33 13 9 de octubre 32 14 10 de octubre 32 14 11 de octubre 31 13 12 de octubre 31 14 13 de octubre 32 13 14 de octubre 31 13 15 de octubre 34 12 16 de octubre 30 14 17 de octubre 31 12 18 de octubre 30 13 19 de octubre 31 13 20 de octubre 30 12 21 de octubre 30 13 22 de octubre 29 13 23 de octubre 27 10 24 de octubre 28 11 25 de octubre 29 13 26 de octubre 29 13
ANEXO 3.
ANALISIS ESTADISTICO
ANALISIS DE VARIANZA PARA LAS VARIABLES DE CRECIMIENTO
ANOVA
Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 21,395 8 2,674 1,076 ,408 Within Groups 67,093 27 2,485 Long parte area Total 88,487 35 Between Groups 84,259 8 10,532 3,237 ,010 Within Groups 87,838 27 3,253 Long raz Total 172,096 35 Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035 Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04 Long total Total 2,786E-02 35 Between Groups ,344 8 4,294E-02 2,170 ,063 Within Groups ,534 27 1,979E-02 Peso seco Parte aerea Total ,878 35 Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035 Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04 Peso seco raz Total 2,786E-02 35 Between Groups 1,191E-02 8 1,488E-03 2,519 ,035 Within Groups 1,595E-02 27 5,907E-04 Peso seco total Total 2,786E-02 35
TEST DE DUNCAN PARA LAS VARIABLES DE PESO
Subset for alpha .05 TRATA N 1 2 3 8,0 4 4,250E-02 9,0 4 6,500E-02 6,500E-02 1,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02 3,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02 2,0 4 7,000E-02 7,000E-02 7,000E-02 4,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02 5,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02 7,0 4 1,000E-01 1,000E-01 6,0 4 ,108 Sig. ,139 ,086 ,051 Means Ior groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size 4,000
TEST DE DUNCAN PARA LAS VARIABLES DE LONGITUD
Subset for alpha .05 TRATA N 1 2 3 8,0 4 4,250E-02 9,0 4 6,500E-02 6,500E-02 1,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02 3,0 4 6,750E-02 6,750E-02 6,750E-02 2,0 4 7,000E-02 7,000E-02 7,000E-02 4,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02 5,0 4 7,250E-02 7,250E-02 7,250E-02 7,0 4 1,000E-01 1,000E-01 6,0 4 ,108 Sig. ,139 ,086 ,051 Means Ior groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size 4,000
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