Manual de Prácticas Microbiologia General 2010 - I

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Prctica 1
Bioseguridad
La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y
conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas,
destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biolgicos,
fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o
producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores,
visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicacin adecuada de normas de bioseguridad
as como la importancia de estas normas antes, durante y despus de cada prctica es un deber de
cada estudiante en el laboratorio donde se est desenvolviendo.
Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de anlisis, investigacin
y dems, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeo seguro y garantizar
resultados exitosos. Las normas generales son:
El acceso al laboratorio estar limitado solo al personal autorizado.
El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de
bioseguridad.
Toda rea debe estar marcada con la respectiva seal de riesgo biolgico y su nivel de
contencin.
Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga,
abotonada y limpia, as mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y
dems objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los
bancos o mesas.
Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio para
evitar la contaminacin por corrientes de aire.
Al inicio y trmino de una prctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una solucin
desinfectante.
El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el trmino del
mismo.
Se deben lavar las manos al inicio y al trmino de cada sesin de trabajo, secndolas
posteriormente con toallas de papel.
Se debern usar todos los implementos necesarios para la proteccin segn el nivel de
riesgo biolgico.
Durante la prctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.
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Se debe colocar un calzado adecuado para las practicas en el laboratorio, as como mantener
las uas cortas, limpias y sin esmalte.
Utilizar los equipos segn las instrucciones o los procedimientos operativos estandarizados.
Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de cadas no se
produzca salpicadura.
Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales
potencialmente infecciosos sin la debida proteccin.
Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de
laboratorio.
Utilizar mscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.
Apagar los instrumentos elctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1.Algunos smbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

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1. Principios bsicos de bioseguridad
El trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros para manejar materiales
infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la
contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienes trabajan en laboratorios, de otras personas
y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contencin
El elemento ms importante de la contencin es el cumplimiento estricto de las prcticas y
tcnicas microbiolgicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando las prcticas de
laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o un procedimiento
de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas medidas adicionales
corresponden a los equipos de seguridad diseados para la proteccin del personal y las prcticas de
manejo (barrera primaria), as como el diseo de instalacin y caractersticas de ingeniera
adecuados (barrera secundaria).
1.2 Barreras primarias
Constituyen la primera lnea de defensa cuando se manipulan materiales biolgicos,
qumicos o fsicos. Se considera que las barreras de proteccin primaria son: equipos de proteccin
personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biolgica (con barreras de aire,
que permiten que ste fluya en una sola direccin y a una velocidad constante originando el flujo de
aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que atrapan las partculas contenidas
en el flujo de aire); normas de higiene personal; inmunizacin (vacunacin); desinfeccin
(alcohol, compuestos fenlicos, hipocloritos) y esterilizacin (calor hmedo, calor seco) de
instrumentos y superficies. Principalmente se busca la proteccin del personal presente en un
ambiente frente a los agentes infecciosos o productos qumicos de riesgo. Seguridad.
1.3 Barreras secundarias
El diseo y construccin de un laboratorio se conoce como contencin o barrera secundaria,
contribuye a la proteccin del personal del laboratorio as como el que se localiza fuera del
laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes accidentales de
agentes infecciosos. Se incluye la localizacin del laboratorio fuera del rea de trnsito, acceso
restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble puerta ( nivel 3),
presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al calor moderado,
cidos y lcalis, reas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin, tratamiento de
residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y elctrico de fcil acceso.
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2. Clasificacin de los agentes biolgicos por grupo de riesgo
2.1 Agentes biolgicos del grupo 1
Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de
virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo:
Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la elaboracin
de quesos, embutidos, entre otros.
Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la
colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes
pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patologa infecciosa de
gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre otros.
Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe generalmente
profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patologa grave, de difcil y largo tratamiento, pueden
curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y ms frecuente peligro es la
infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Ejemplo: Mycobacterium.
tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros.
Son aqullos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio peligro
para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad y sin que
exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son microorganismos de dosis
infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus, etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios
Se consideran cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la
combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica descritos:
tcnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseo arquitectnico de las instalaciones del
laboratorio. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de actividades que se realizan,
las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad el laboratorio. De forma
general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contencin necesaria para proteger al personal
y al ambiente.

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3.1 Nivel de bioseguridad 1
Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biolgicos del grupo de
riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros de
enseanza donde se emplean microorganismos no patgenos.
Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal
especializado para el manejo de stos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de
microbiologa clnica y de control de calidad sanitaria (tcnicos de laboratorio, especialistas en
microbiologa).
Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo de riesgo 3. El material
biolgico slo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con infraestructura
apropiada para el nivel de contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin
recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, entre otras caractersticas;
correspondiendo a algunos laboratorios de microbiologa clnica, de produccin de biolgicos y de
control de calidad sanitaria.
Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biolgico de
riesgo 4, especialmente patgeno infecto contagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y
para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar
con animales de experimentacin infectados por microorganismos del grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliogrficas
- Granados, E. y Villaverde C. (1977). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo.
- Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios. Serie
de Normas Tcnicas N 18 (2 ed.). Per: Autor
- Per, Ministerio de Salud. (2001, junio). Buenas Prcticas de Laboratorio. Seminario
Taller, Lambayeque, Per.

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Prctica II
Material y equipo de laboratorio

1. Introduccin
Las tres fuentes del conocimiento son la observacin, la experimentacin y el razonamiento. La
experimentacin exige menos esfuerzo mental pero ms tiempo, es decir ms presencia; por
consiguiente se necesita equilibrar la enseanza con ms horas de laboratorio para un buen
aprendizaje. Una buena enseanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre
observar un fenmeno o una reaccin, y el poder interpretarlo. La correcta observacin le dar el
domino real sobre la materia. La capacidad de interpretacin le proporcionar adems la
preparacin tcnico-cientfica necesaria para ser un buen investigador.
Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio, slo as
se lograr obtener buenas lecturas lo que permitir una buena interpretacin de los resultados.

2. Objetivos
2.1 Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa.
2.2 Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiologa.
2.3 Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiologa.

3. Procedimiento
3.1 Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa
3.1.1 Tubos de ensayo
Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y sin
rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioqumicos se usan tubos de 13 X 100 mm.
y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm.
3.1.2 Placas de Petri
Estn compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el ms grande hace de tapa. Se emplean para
el aislamiento y cultivo de microorganismos.
3.1.3 Tubos de Smith
Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentacin.
3.1.4 Campanas de Durham
Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la
produccin de gas en los procesos de fermentacin.
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3.1.5 Pipetas serolgicas o de medida
Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20C. Las marcas ms
conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos de
precisin, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en Norteamrica y
tienen las siglas NBS y el ao de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX serolgica de 1 mL de
capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una pipeta PIREX del mismo
volumen tiene un ET de 0.02 (2%).
Las pipetas serolgicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL y las de mayor uso son:
Pipetas de 10 mL 0,1 mL
Pipetas de 5 mL. 0,1 mL
Pipetas de 1 ml. 0,1 y 0,01 mL
Pipetas de 0.1 mL. 0,1 y 0,001 mL
Pipetas de Dhan de 0,125 0,0125 mL
Pipetas de Dhan de 0,250 0,0250 mL
Pipetas de Bang de 0,2 0,08 y 0,005 ml
Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la punta
de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la ltima lnea de
graduacin.
3.1.6 Pipetas Pasteur
Son confeccionadas de varillas de vidrio de dimetro de 4 X 20 mm. y de 30 40 cm. de longitud.
La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama del mechero,
para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma de pequeos
inculos de siembra.
Modo de emplear la pipeta Pasteur
- El tallo de la pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio
- Se coloca la punta de la pipeta en el lquido por medir, bastante profundo, para que se pueda
aspirar el volumen necesario sin aire. Con aspiracin suave, se llena el lquido por encima de la
marca de calibracin. Se cierra la pieza de la boca con el dedo ndice.
- Se seca el exceso del lquido en el exterior de la pipeta con un pao o un papel limpio.
- Colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del lquido baje
hasta la marca de calibracin moviendo con suavidad el ndice sobre la pieza de boca. El dedo no
debe retirarse.
- Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepcin, colocando su punta contra la pared.
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- Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vace durante el tiempo
necesario. No se debe soplar para hacer salir la ltima gota al emplear una pipeta volumtrica o
cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el vaciamiento
sea correcto.
3.1.7 Buretas
Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo
corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las ms comunes son de 50 mL y estn graduadas al
dcimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de lquidos o soluciones
y se las usa mayormente en las titulaciones volumtricas.
Modo de usar la bureta
- La bureta limpia y vaca se mantiene en posicin vertical mediante un soporte adecuado.
- Se enjuaga la bureta con el mismo lquido que se va a descargar.
- Se llena la bureta con el lquido hasta un poco ms arriba de la graduacin y se descarga el
lquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduacin y el
pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solucin.
- Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar
errores.
- Despus de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de
ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o tambin pueden colocarse en el soporte con
las puntas hacia arriba.
- Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con cera
y resina. La lubricacin adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca.
3.1.8 Matraces
Son recipientes volumtricos muy tiles en la preparacin y almacenamiento de soluciones,
colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamao son muy variables.
- Matraces cnicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que
reducir a un mnimo la evaporacin; son tiles para las titulaciones. En Microbiologa sirven para la
preparacin de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de alambre
cuando se realiza el calentamiento evitando as el contacto directo entre el matraz y la llama.
- Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el
mechero. Para calentar solventes orgnicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es preferible
emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores correspondientes y
permiten un cierre mucho ms hermtico que los tapones de caucho o de corcho.
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- Matraces aforados o fiolas: Idnticos a los matraces erlenmeyer. Estn calibrados a
medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica la
medida. Se emplean para la preparacin de reactivos y de soluciones buffer.
- Matraces kitasato: Son matraces que adems de la boca tienen una tabulacin corta lateral
para hacer vaco. Se utilizan como complemento del equipo de filtracin (esterilizacin en fro).
3.1.9 Esptulas de Drigalsky
Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fraccin recta y horizontal facilita la siembra y
aislamiento de bacterias por diseminacin.
3.1.10 Probetas
Recipientes cilndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad de
10 mL hasta 2 000 mL. Las ms utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL.
3.1.11 Beacker o vasos de precipitacin
Recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. El vidrio debe ser
necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad.
3.1.12 Varillas de vidrio macizo
Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confeccin de agitadores o baguetas. Las varillas
cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra.
3.1.13 Frascos reactivos
Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color mbar. Son cilndricos, tienen cuello
estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su vaciado y su
tamao vara de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeos se pueden almacenar HCl, H
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SO
4
,
CCl
4
, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u otros reactivos.
3.1.14 Frascos goteros
Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o mbar, y sus tapones son ranurados
para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para colorantes o
para indicadores.
3.1.15 Picetas
Son botellas plsticas de color blanco con una especie de cao que al presionar el frasco permite
que el lquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar lminas portaobjetos con tinciones.
3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos
Los portaobjetos son lminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mnimo grosor. Los
cubreobjetos son finsimas laminillas de mucho menor tamao que los portaobjetos y pueden ser de
forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la observacin
microscpica de las bacterias u otros organismos.
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3.1.17 Jarra de Brewer
Denominada tambin campana de anaerobiosis, est constituida por una tapa de baquelita en cuya
parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un cilindro de
vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada hermticamente
mediante una abrazadera de metal.
3.1.18 Asas de siembra
Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrn resistente a
elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos.
3.1.19 Mangos de Kolle
Vstagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para
insertar el alambre de platino o micrn en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos
de vidrio.
3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta
Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle.
3.1.21 Canastillas o cestos de metal
Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas
conocidas, sin riesgo de roturas.
3.1.22 Gradillas
Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes.
3.1.23 Soportes universales
Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de metal
de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento.
3.1.24 Trpodes
Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al
calentamiento. De variada altura y dimetro.
3.1.25 Rejilla o malla metlica
Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosin a elevadas temperaturas. Se coloca sobre el
trpode.
3.1.26 Mecheros
- Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de
metal por donde se introduce la mecha.
- Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos ms tiles en el laboratorio.
Fue inventado por el alemn Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de mecheros, algunos
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tienen regulacin de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son simples, no regulan el gas, y
queman gas propano.
3.1.27 Autoclave
Consta de una caldera de acero o de cobre batido estaado interiormente, protegida por una camisa
metlica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base est instalada la fuente calrica
(gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, est la placa cribosa para apoyo del
material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa que es pesada (de bronce
fundido) en cuyo borde interno est adaptado un arandel de caucho para el cierre hermtico del
aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el cierre, evitndose el escape del
vapor. Presenta adems, un manmetro (que marca las libras de presin), una vlvula de seguridad,
un termmetro y una llave o espita (para la salida del aire y vapor al empezar a hervir el agua).
El vapor de agua se aplica en una cmara cerrada en la que existe un generador de vapor; cuando
ste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en que ya sale
vapor. Posteriormente se consigue la presin deseada, teniendo en cuenta que el vapor a 1 atm. de
presin corresponde a 121C de temperatura. Esta temperatura, aplicada durante 15 o 20 minutos,
una temperatura de 134 C durante 7 minutos destruye todas las formas vegetativas y
esporuladas.
El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han dado
las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilizacin ms usados son
productos qumicos (que cambian de color segn los niveles alcanzados) y esporas de ciertas
bacterias.
3.1.28 Horno Pasteur
Es un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco. Es cilndrico, de metal, de triple
pared; la intermedia ms corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas
(concntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo. Las
paredes son metlicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los lados o al
fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero mltiple o juego de
resistencia (fuente calorfica).
3.1.29 Espectrofotmetro
Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en
anlisis bioqumicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas
longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo porque
absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas del azul y
el verde.
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3.1.30 Potencimetro
Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biolgicos, medios de
cultivo, etc.
3.1.31 Contador de colonias
Lo ms difcil en la determinacin de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El contador de
colonias soluciona este problema convirtindose en un auxiliar indispensable para todo laboratorio
microbiolgico y adems no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.
3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras
Son incubadoras de temperaturas fras. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros y
reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento ms prolongado de
sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberas de agua caliente.
3.1.33 Estufas de cultivo
Sirven para realizar el proceso de incubacin, que brinda una temperatura adecuada para que los
microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos mtodos de incubacin:
Incubacin por calor seco: Se realiza en incubadoras e incluso en hornos. Las
incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre stos radica en la
temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato que es
capaz de soportar temperaturas de 100 C ms. El ms conocido es el horno Pasteur.
Incubacin por calor hmedo (bao Mara): El llamado bao Mara presenta un
dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio de
una corriente de conveccin, lo que permite que el agua se caliente en forma ms uniforme.
3.1.34 Microscopio ptico
La Microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio.
Podemos encontrar un microscopio simple que no es ms que una lente biconvexa, o un
microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayor
aumento.
Los microscopios se clasifican bsicamente en dos grupos en funcin del tipo de luz utilizada y
amplificacin: microscopio de luz ptica y microscopio electrnico. El microscopio mediante el
cual la amplificacin de la imagen se obtiene por un sistema de lentes pticas, corresponde a los
microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se hace a travs
de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio electrnico.
Los diversos componentes del microscopio ptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

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a) Sistema de soporte: Pie, bastidor, revlver portaobjetivos, platina.
b) Sistema de aumento : Objetivos, oculares
c) Sistema de iluminacin: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.
d) Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, condensador, elevador
del diafragma iris, reguladores de la platina mecnica, tornillos para centrar el condensador.

Sistema de aumento
La amplificacin de la imagen en un microscopio ptico se obtiene mediante dos sistemas de lentes
convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del microscopio,
justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan objetivos y forman la
imagen real del objeto que se est observando. El poder de aumento de cada uno de ellos es
indicado por un nmero grabado ejemplo: 40 indica un aumento del objetivo de 40 veces.
El segundo sistema de lentes que se sita en el extremo superior del tubo del microscopio, est ms
alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de ampliar la
imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo
humano. La amplificacin del ocular suele venir indicada en la parte superior del lente ocular o en
la lateral.
Poder de aumento del microscopio
Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea un
objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del
microscopio ser de 450.
Poder de resolucin del microscopio
Es la distancia entre dos estructuras de un espcimen en la cual todava se pueden observar como
estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolucin se define como el espacio de
mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar con claridad como dos
entidades independientes y si se les acerca un poco ms, ya no se distinguen, y se les ve como un
solo punto.
El poder de resolucin est sujeto a la longitud de onda () del espectro de luz visible y a la
propiedad de las lentes conocidas como la abertura numrica (AN). El lmite del poder de
resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 /AN que para un microscopio
ptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes, ser
mejor el poder de resolucin del microscopio

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Abertura numrica de un objetivo
Depende del ndice de refraccin (N) del medio que llena el espacio entre el espcimen y la parte
frontal del objetivo, y del ngulo () de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al objetivo.
Usando una lente con mayor abertura numrica, se obtiene mayor poder de resolucin.
AN = N x Sen /2
El aire tiene un ndice de refraccin de 1, que limita la resolucin que se puede obtener, pero se
puede incrementar la abertura numrica colocando aceite de inmersin entre el especmen y el
objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio
Aceite de inmersin
Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se
desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto
objeto es el aceite. Este tiene un ndice de refracccin de 1,5, lo que aumenta considerablemente la
abertura numrica. La observacin de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los objetivos
secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espcimen y el objetivo, pero para observar las
bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersin de aceite.
Iluminacin
La iluminacin es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolucin de un
microscopio. La luz proceder de la fuente de iluminacin que se situar en la parte ms baja del
microscopio. Dicha luz penetrar en el condensador y ste llegar al objetivo que lo amplificar, as
pues deber llegar un cono de luz muy grande para que su amplificacin sea mayor. Este tamao de
cono de luz que llega al objetivo se podr controlar con el diafragma situado inmediatamente debajo
del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera completamente abierto, se
perdera contraste y nitidez.
Si se utiliza el objetivo de inmersin, la distancia de trabajo es muy pequea y, en estos casos, hay
que abrir ms el diafragma para facilitar una mayor amplificacin que aumente el mximo poder de
resolucin.

3.2 Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiologa
.3.2.1 Microscopio
- Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril.
- Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica estril (1 gota) sobre una lmina porta
objetos.
- Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo.
- Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X.
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3.2.2 Horno Pasteur
- Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura del horno a 180 C y mantener el material por espacio de 2 horas.
Precauciones en el manejo
No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un
cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.
Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de sta manera se evitar la carbonizacin
del papel y tapones de algodn.
No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes
de goma, etc.
3.2.3 Autoclave
- Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla.
- Colocar el material a esterilizar en la canastilla.
- Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en dos
tornillos diagonalmente opuestos.
- Dejar abierta la espita.
- Encender la fuente de calor.
- Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.
- Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la
temperatura (121 C) durante 15 a 20 minutos.
- Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presin
deseada.
- Apagar el sistema de calefaccin, despus del tiempo de esterilizacin.
- Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero.
- Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.
- Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los vapores
lleguen a la cara del operador.
Precauciones en el manejo:
Para evitar la prdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes.
No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la
circulacin del vapor.
No bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar prdida de material y
ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin.
16

3.2.4 Estufa
- Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el medio
de cultivo inoculado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubacin durante 24, 48
horas o ms tiempo si es requerido.
3.2.5 Bao Mara
- Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.
- Encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura deseada.
- Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado.

3.3 Esterilizacin del material de uso en el laboratorio de Microbiologa
3..3.1 Placas de Petri
Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o de descarte y
esterilizar en autoclave a 121 C durante 20 minutos.
Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y dejar
secar.
Envolver con papel y asegurar con pabilo.
Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.
3.3.2 Tubos de ensayo
En una canastilla o un depsito que los sostenga depositar los tubos que contengan
material contaminado o de descarte.
Esterilizar en el autoclave a l21 C durante 20 minutos.
Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y dejar
secar.
Taponar los tubos con algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y
facilite su uso posterior.
Envolver con papel. De preferencia formar grupos de seis tubos, envolver y asegurar
con pabilo.
3.3.3 Matraces
Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recin preparados
o cultivos de descarte.
17

Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar.
Colocar tapones de algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y
facilite su uso posterior.
3.3.4 Pipetas
Colocar un tapn de algodn ligeramente ajustado en el orificio superior de las pipetas.
Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas.

4 Anexo

Figura 2.1 Equipos de uso en Microbiologa, a. Autoclave, b. Incubadora c. Horno,
d. Espectrofotmetro
a
b
c d
18

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiologa, a. Potencimetro, b. Refrigeradora, c. Microscopio
binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Bao Mara.

a
b
c
d
f e
19

- Mendo, M. (1999).Instrumentacin de Laboratorio. Lima, Per: Editorial Cientfica
Mundi E.I.R.L.
20

Prctica III
Observacin de bacterias

1. Introduccin
Leewenhoek realiz observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta entonces
slo se poda especular de la existencia de agentes infecciosos ms pequeos que lo que el ojo
humano poda distinguir. Desde ese momento el microscopio ptico se ha transformado en una
herramienta muy importante en la determinacin y clasificacin microbiana. Muchos agentes
microbianos pueden ser identificados en forma confiable con slo unas pocas coloraciones y un
microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual ms eficiente y econmico
para el diagnstico rpido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos
a. Reconocer la morfologa de las bacterias.
b. Adquirir destreza en la obtencin de un frotis.
c. Describir las tcnicas de coloracin simple y compuesta.
d. Adquirir destreza en la tincin de Gram

3. Procedimiento
a. Obtencin de un frotis
El frotis constituye la extensin y fijacin de la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia y
desengrasada.
Extensin: Se coloca en el centro de una lmina portaobjetos una gota del cultivo lquido.
Si el cultivo fuera slido, se coloca previamente una gota de solucin salina o agua destilada sobre
la lmina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequea porcin de una colonia tomada con
el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa delgada y uniforme
procurando no llegar al borde o extremo de la lmina.
Fijacin: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea arrastrado
durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

21

Figura 3.1 Tecnica para la obtencin de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b)
colocar una gota de solucion salina esteril en una lmina portaobjetos c) tomar una
colonia de la placa de Petri. c), d) realizar una emulsin , luego extender la muestra sobre
la lamina y fijar la muestra al calor .

b. Coloracin simple
Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc.
Procedimiento:
En una lmina portaobjetos realizar el frotis de la muestra.
Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5
minutos.
Lavar el frotis a chorro de agua.
Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
Observar al microscopio y esquematizar.

A
c
b
D
22

c. Coloracin compuesta: Tcnica de Gram
Coloracin compuesta es aquella que utiliza ms de un colorante. La ms comn es la tincin de
Gram, donde las bacterias se tien con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el lugol
forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las bacterias Gram
positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.
Procedimiento:
En una lmina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el frotis.
Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.
Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto.
Lavar a chorro de agua y decolorar rpidamente con alcohol acetona.
Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos.
Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin.
Comparar y esquematizar.

23

Soluc. A
Soluc. B
4. Anexo

Reactivos para la tincin de GRAM

A) Violeta de Genciana de Hucker
Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g
Alcohol etlico ............................................................................... 20,0 mL
Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g
Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B) Solucin de safranina
Safranina ...................................................................................... 0,25 g
Alcohol etlico .............................................................................. 10,0 mL
Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C) Solucin de lugol
Yodo .............................................................................................. 1,0 g
Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g
Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D) Alcohol acetona
Alcohol de 95 ............................................................................... 70,0 mL.
Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10 ed.)
Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

24

Prctica IV
Medios de cultivo

1. Introduccin
Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicacin de los microorganismos
por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de cultivo debe contener una
fuente de carbono y de nitrgeno, debe presentar un equilibrio cido base (pH) y debe estar libre
de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121 C, 15 libras de presin, por 15
a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo segn su naturaleza
1.1.1 Naturales
a. Origen animal: Leche, huevos.
b. Origen vegetal: Papas.
1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composicin qumica conocida y constante
ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo segn su utilidad
1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Entre
ellos estn el caldo comn, agar comn, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo comn (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

Agar comn (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
pH 7.0

25

Caldo nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5 ,0
Extracto de carne 3,0
pH 7,0

Agar nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
pH 7,0

1.2.2 Medios especiales
a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgnicos como
sangre, yema de huevo, suero, etc.
Agar sangre
Agar comn fluidificado y enfriado a 45 C 95 mL
Sangre citratada 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de
microorganismos e inhiben a otros acompaantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio.
Agar Chapman (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 75,0
Manitol 10,0
Agar 15,0
Rojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)
pH 7,4

26

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un sustrato
definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos
y a la vez los diferencian segn la utilizacin del sustrato. Ejemplo: Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)
Peptona 17,0
Peptona proteosa 3,0
Lactosa 10,0
Sales biliares 1,5
Cristal violeta 0,001
NaCl 5,0
Agar 15,0
Rojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)
pH 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioqumica de los
microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)
Peptona 5,0
Extracto de Levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Ctrato amnico frrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0, 04
Prpura de bromocresol 0, 02
Agar 15 g
Agua 1 000 mL
pH 6,7

27

1.3 Clases de medios segn su consistencia
1.3.1 Lquidos
1.3.2 Slidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacrido
extrado de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 100 C y de
solidificarse a 40 C. As mismo, el agar no es degradado por las bacterias.
1.3.3 Semislidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos
2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiologa.
2.2 Adquirir destreza en la preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

3. Procedimiento
3.1 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo
a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y
adicionar la cantidad de agua destilada requerida.
b. Disolver en Bao Mara.
c. Enfriar y ajustar el pH segn convenga.
d. Colocar un tapn de algodn en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y
asegurar con pabilo.
e. Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 libras de presin durante 15 minutos.

3.2 Metodologa para servir medios de cultivo
a. Fluidificar los medios slidos al calor, enfriar a 50 C y frente a la llama del mechero servir en
placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso de los
tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.
b. Servir los medios lquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos
a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 C.
b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algn microorganismo
(contaminanate).

28

Figura 4.1 Metodologa para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo
slidos y lquidos


Adicionar los ingredientes
en el matraz.
Agua destilada
Llevar el medio a
autoclave
Llevar el medio de
cultivo a control de
esterilidad.
Servir los medios
a placas
Llevar a control de
esterilidad
Agua destilada Homogenizar
el medio de
cultivo
Servir el
medio de
cultivo
Los tubos son
colocados en una
gradia y son
taponados con
algodn
Los tubos son
llevados a
autoclave
Los tubos son
inclinados y llevados
a control de
esterilidad.
Adicionar los ingredientes
en el matraz.
29

Prctica V
Siembra y aislamiento de bacterias

1. Introduccin
Sembrar es la accin de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que
permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para
trasplante.
La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo comn sta
presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos.
Generalmente se utiliza la tcnica de agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra
simple. Cuando se desea contar el nmero de bacterias se utiliza la tcnica de placa vertida. La
siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie
microbiana (cepa). Tambin se denomina repique. El objetivo es el mantenimiento del
microorganismo conocido cambindolo a un nuevo medio de cultivo.

La siembra por trasplante puede ser:
De un medio slido a otro medio slido
De un medio slido a un medio lquido
De un medio lquido a otro medio lquido
De un medio lquido a un medio slido

2. Objetivos
- Realizar una siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple.
- Realizar una siembra por difusin en placa o placa vertida
- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento
3.1 Siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple
Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biolgica.
Tomar una alcuota de la muestra (inculo) y depositarla en uno de los extremos superiores
de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido y controlado.
30

Realizar movimientos en zig zag (estras) muy juntos en el primer tercio de la placa para
agotar el inculo. Posteriormente realizar estras muy separadas de un extremo a otro lado de la
placa no tomando nuevo inculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la placa.
Incubar a 37 C (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusin en placa o placa vertida
Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biolgica.
Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de Petri
estril y vaca.
Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 50 C.
Homogenizar por movimientos de rotacin de la placa de Petri para la dispersin de
microorganismos en forma ms o menos homognea, hasta la solidificacin.
Incubar a 37 C durante 24 horas.
Realizar el recuento de colonias.

31

3.3 Obtencin de un cultivo puro de bacterias
a. Tratamiento de la muestra
Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo tanto
inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biolgicas que pueden ser de
varios tipos:
a.1 Muestras que contienen abundante nmero y tipo de microorganismos en las que previamente
se deben realizar diluciones en solucin salina fisiolgica estril. Ejemplo suelo.
a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar, por
lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el nmero del microorganismo requerido
y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.
a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo investigado y
los contaminantes) y que se siembran sin ningn pre-tratamiento. Ejemplos sangre,

b. Aislamiento primario
Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a travs de
la siembra en placa de Petri mediante la tcnica de estra en la superficie de medios enriquecidos
(agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales (agar Mac
Conkey). Despus de un periodo de incubacin de 24 horas (puede variar en funcin del
microorganismo), se observarn las colonias de bacterias (masas constituidas por millones de
bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una clula). Se
observar el tamao y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada gnero
y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como caracterstica diferencial. A continuacin se
realizar una tincin de Gram para determinar la morfologa y reaccin tintorial de las bacterias
constituyentes de la colonia.

32

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas
sobre el medio de cultivo

c. Aislamiento secundario
En caso que la morfologa y reaccin tintorial de las clulas bacterianas coincidan con el
microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a travs de una siembra
para trasplante o transferencia de una pequea porcin de la colonia hacia un tubo con medio de
cultivo inclinado que permitir el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano (poblacin de
bacterias que procede de una clula) y que a su vez puede ser mantenido e identificado merced a sus
propiedades culturales y fisiolgicas.

- Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos. Lima,
Per: Direccin General de Salud Ambiental

33

Prctica VI
IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introduccin
Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificacin del
gnero y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificacin comienzan con el
estudio morfolgico de la colonia, estudio morfolgico de las clulas, motilidad, prueba de catalasa,
citocromo oxidasa, prueba de oxidacin fermentacin, metabolismo de carbohidratos, metabolismo
de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas segn la bacteria que va a ser identificada.

2. Objetivos
2.1 Caracterizar morfolgicamente las colonias bacterianas.
2.2 Caracterizar morfolgicamente las clulas bacterianas.
2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.
2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidacin-fermentacin
2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y
compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfolgico de las colonias bacterianas
Determinar el tamao, forma, borde, elevacin, consistencia, aspecto y color de la colonia
bacteriana.
a) Tamao: Pequeo, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo,
invadiendo toda la superficie del medio.
b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.
c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.
d) Elevacin: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.
e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.
f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

34

Forma Elevacin

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevacin de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y
oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos excluyendo a los estreptococos.
Tcnica del porta objetos: En una lmina portaobjetos depositar una colonia bacteriana procedente
de un cultivo joven y aadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes.

35

Interpretacin: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con
desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y
oxigeno molecular.

2 H
2
0
2
= 2 H
2
0 + 0
2
Utilizacin: Se usa para diferenciar cocos Gram positivos

Figura 6.1 Reaccin positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas

Morfologa
Reaccin
catalasa Gram
Cocos
Staphilacocus
Micrococcus
Streptococcus
Enterococcus
+
+
-
-
+
+
+
+
Bacilos
esporulados
Bacillus
Clostridium
+
-
+
+
Bacilos no
esporulados
Listeria
Corynebacterium
Erysipelotrix
+
+
-
+
+
+

36

3.3 Estudio morfolgico de las clulas bacterianas
Realizar un frotis de una pequea porcin de la colonia y una tincin de Gram para determinar la
morfologa celular y reaccin tintorial de las clulas bacterianas.

3.4 Prueba de oxidacin fermentacin
Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al
desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la va oxidativa, el aceptor final de electrones es el
oxgeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la va fermentativa,
el aceptor final de electrones es un compuesto orgnico procedente de la misma va, por
consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez.
La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas producen
cido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias fermentativas
producen mucho cido en todo el tubo.
Tcnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de los
tubos con vaselina o aceite de parafina estril. Incubar a 37 C por 24 horas, aunque a veces es
necesario una incubacin de hasta 14 das.
Interpretacin: Si la va es oxidativa, slo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en la
parte superior al amarillo y ms tarde se extender por todo el tubo, pero nunca con produccin
de gas. Si la va es fermentativa, se observar un viraje intenso al amarillo que se inicia en la
parte inferior de los dos tubos con o sin produccin de gas.
Utilizacin: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos
Investigar la fermentacin de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formacin de acidez (medio
RMVP), utilizacin del citrato como fuente de carbono y energa (medio citrato de Simmons) e
hidrlisis del almidn (agar almidn).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados
Investigar la descarboxilacin de la lisina (agar LIA) y formacin de indol (caldo peptonado)

37

AGAR TSI
(Agar triple azcar de hierro) (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composicin
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 15 g
Peptona proteasa 5,0 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso (FeSO
4
) 0.2 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Tiosulfato de sodio (Na
2
S
2
O
3
) 0,3 g
Agar 15 g
Rojo de fenol 0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)
Agua csp 1 litro
pH 7,4

2. Fundamento
Este medio se utiliza para la identificacin de enterobacterias segn su capacidad para
metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formacin de sulfuro de hidrgeno (H
2
S) y gas.
Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el indicador
rojo de fenol a un color amarillo. La fermentacin de la glucosa se lee al fondo del tubo (amarillo),
la fermentacin de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la fermentacin de la
lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo).
Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las protenas que
alcalinizan el medio por la formacin de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo
acentuado, debido a que la pequea cantidad de glucosa (0.1%) se consume rpidamente en la
superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo).
En la produccin de sulfuro de hidrgeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio
hasta hidrgeno sulfurado (o sulfuro de hidrgeno) y ste se une al fierro (del FeSO
4
) formando un
compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier parte del
tubo, especialmente en el fondo.
38

A/A
amarillo todo el tubo

Gas (+)
H
2
S (-)
glucosa (+)
lactosa (+)
sacarosa (+)
En la formacin de CO
2
e H
2
durante la fermentacin de los carbohidratos: el agar se rompe o
se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.

3. Tcnica
Sembrar por puntura y estra en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI.
Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

Medio MRVP
(Rojo de Metilo Voges Proskauer)
A B
C
K/A
amarillo en el fondo del tubo
y rojo en la parte superior

Gas (-)
H
2
S (-)
glucosa (+)
lactosa (-)
sacarosa (-)
negro
amarillo
amarillo
amarillo
rojo
amarillo
rojo
K/A
amarillo en el fondo del tubo
y rojo en la parte superior

Gas (-)
H
2
S (+)
glucosa (+)
lactosa (-)
sacarosa (-)
39

1. Composicin (g/L)
Polipeptona 7,0
Glucosa 5,0
Fosfato dipotsico 5,0
Agua c.s.p. 1000 mL
Indicador rojo de metilo pH 4,5 = Rojo
pH 6,3 = Amarillo
pH 6,9

2. Fundamento
Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba de
rojo de metilo detecta la formacin de cidos (lctico, actico, frmico) por fermentacin cido
mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir
cantidades suficientes de cidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases
iniciales de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que
pueden mantener el pH bajo despus de una incubacin prolongada de 48 horas.
3. Tcnica
Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP.
Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.
4. Lectura
El desarrollo de un color rojo estable indica que la produccin de cido es suficiente como para
bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir
cantidades menores de cido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el
amarillo y el rojo. sta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna amarillo.

40

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composicin (g/L)
Fosfato amnico 1,0
Citrato sdico 2,0
Cloruro sdico 5,0
Fosfato bipotsico 1,0
Indicador azul de bromotimol 0,08
pH 6 = amarillo, pH 7.6 = azul
Sulfato magnsico 0.20
Agar 15
Agua c.s.p 1000 mL
pH 6.9
2. Fundamento
Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
fuente de carbono y energa. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y
bicarbonatos (C0
2
se junta con el sodio). Simultneamente los microorganismos utilizan el
fosfato amnico como fuente de nitrgeno y liberan amonaco. La presencia de carbonatos,
bicarbonatos y amonaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira del verde
al color azul.
3. Tcnica
Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar citrato inclinado.
Observar el cambio de coloracin del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.
4. Lectura
En caso positivo se observar el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria
utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador,
observndose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se
recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observar crecimiento de la
bacteria y el medio permanecer de color verde.

41

MEDIO AGAR ALMIDN

1. Composicin (g/L)
Agar nutritivo 100 mL
Almidn 1.0

2. Fundamento
El almidn es un polmero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un
complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidn a molculas ms simples
como la maltosa y glucosa, stas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloracin
azul.

3. Tcnica
Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar almidn inclinado.
Adicionar dos gotas de lugol.
Observar la presencia o no de una coloracin azul.

4. Lectura
En una hidrlisis positiva del almidn, despus de adicionar el lugol no se observar coloracin
alguna. Por el contrario, en una hidrlisis negativa despus de adicionar el lugol se observar
una coloracin azul.

AGAR LIA
42

(Agar Lisina Hierro)

1. Composicin (g/L)
Peptona 5,0
Extracto de levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Ctrato amnico frrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0,04
Prpura de bromocresol 0,02
Agar 15,0
Agua 1 litro
pH 6.7

2. Fundamento
Este medio permite evidenciar la descarboxilacin de la lisina y la formacin de cido
sulfhidrico (H
2
S).
Para que se lleve a cabo la descarboxilacin tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0)
por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo debe
utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es
descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color
violeta (K / K).
La produccin de H
2
S se evidencia por la coloracin negra debido al sulfuro de fierro
formado.
Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un
cetocido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales frricas y un color rojizo bajo
la influencia del oxgeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A).
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Tcnica
Sembrar por puntura y estra en superficie en un tubo conteniendo medio LIA
Realizar la lectura correspondiente.

43

4. Lectura

K / K R / A K / A A / A

LIA (+)

.
Rojo
LIA (-)
Violeta
Amarillo
Negro
Violeta
Amarillo
Amarillo
44

MEDIO CALDO PEPTONADO
1. Composicin (g/L)
Peptona 10,0
Na Cl 3,0
H
2
O csp 1000
pH 7,0
Reactivo de Kovac : Alcohol amlico o isoamlico puro 150
p dimetilaminobenzaldehido 10
HCl concentrado 50
2. Fundamento
Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrlisis del
aminoacido triptfano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima
triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y
amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido
del p dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac)
3. Tcnica
Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio.
Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.
4. Lectura
Observar la formacin de un anillo coloreado en la zona de reaccin (color rojo) = Indol (+)

45

Tabla 6.2. Reaccin a ciertas pruebas bioqumicas claves para la diferenciacin de
bacterias entricas

Gneros

H
2
S

Indol

Rojo de
metilo
Lisina
descarb.

Citrato
Gas (glucosa)
Lactosa
Escherichia - + + d - + +
Enterobacter - - + + + + +
Shigella - +/- + - - - -
Salmonella + - + + +/- + +
Klebsiella - - - + + + +
Citrobacter +/- - + - + + d
Proteus +/- +/- + - D +/- -

- Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque,
Per.
- MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de
Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per.
- Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos.
Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental
- Doyle, M., Beuchat, L. y Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos.
Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10
ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

46

Prctica VII
MICROORGANISMOS INDICADORES

1. Introduccin
Microorganismos indicadores son aquellos cuya presencia en nmero superior a un lmite
establecido evidencia la presencia de un patgeno ecolgicamente relacionado. Ejemplo
Escherichia coli indica que probablemente exista Salmonella o Shigella (las cuales son
difciles de aislar). Permiten determinar la calidad y seguridad del alimento respecto a su
inocuidad y tiempo de vida til.

Coliformes termotolerantes : Indican contaminacin con una probable fuente fecal
Microorganismos aerobios mesfilos: Indicador del estado microbiolgico de un alimento.
Coliformes totales: Indicadores de un proceso o estado sanitario defectuoso.
Escherichia .coli: Indicador de contaminacin fecal reciente.
Enterococcus: Indicador de contaminacin fecal muy remota.
Staphylococcus: Indica contaminacin por manipulacin inadecuada.

La numeracin de microorganismos aerobios mesfilos viables en los alimentos ha sido uno de
los indicadores microbiolgicos de calidad mas convenientemente utilizados. Sus valores
indican si la limpieza, desinfeccin y control de la temperatura durante los procesos de
tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado en forma adecuada. Esta
determinacin permite tambin informacin sobre la alteracin incipiente de los alimentos, su
probable vida til, la descongelacin incontrolada de los alimentos congelados o las fallas en el
mantenimiento de las temperaturas de refrigeracin en los alimentos refrigerados. Asimismo,
pone de manifiesto el origen de la contaminacin durante el proceso de elaboracin de los
alimentos.

Las coliformes son bacterias Gram negativas en forma de bacilos, aerobios, no esporulados,
que fermentan la glucosa y la lactosa con produccin de gas luego de 24 48 horas de
incubacin a 35C y son: Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacte y Klebsiella. Las
coliformes termotolerantes son las bacterias que fermentan la glucosa y la lactosa con
produccin de gas a 45 c y son: E. coli, Enterobacter.sp.
47

E. coli es un microorganismo que se encuentra en el tracto intestinal de los mamferos y el
hombre cuya presencia en un alimento sugiere una falta general de limpieza en el manejo del
mismo y un almacenamiento inadecuado. Tambin evidencia el riesgo de que pudieran existir
en el alimento otras bacterias patgenas como Salmonella y Shigella que no pueden ser tan
fcilmente detectadas en pequeas cantidades.

2. Objetivos
2.1 Determinar el nmero de microorganismos mesfilos viables en una muestra de
alimento.
2.2 Determinar el nmero ms probable de coliformes totales y termotolerantes en una
muestra de alimento.

3. Procedimiento
3.1 Numeracin de microorganismos mesfilos viables
Se utiliza el mtodo de Recuento estndar en placa o Recuento en placa de microorganismos
aerobios o Recuento en placa por siembra en todo el medio. Se usa el medio de cultivo Plate
Count Agar que es un agar peptona de casena glucosa extracto de levadura exento de
sustancias indicadoras y de inhibidoras.

a. Pesar 10 g o medir 10 mL de la muestra y depositarlos en un recipiente conteniendo 90
mL de agua peptonada 0,1%.
b. Homogenizar durante 30 segundos.
c. Realizar diluciones decimales con 9 mL de agua peptonada al 0,1 % ms 1 mL de la
dilucin anterior.
d. Pipetear 1 mL de cada dilucin a placas de Petri, estriles y debidamente codificadas
e. Verter en cada placa de Petri el agar fundido y temperado a 44 46 C. Acto seguido
mezclar por movimientos de rotacin.
f. Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubar a 35C durante 48 horas
g. Contar las colonias resultantes utilizando el contador de colonias.

48

Clculo del recuento estndar en placa

Elegir las dos placas correspondientes a una dilucin que presenten entre 30 a 300 colonias.
Hallar la media aritmtica de los valores y multiplicarla por el factor de dilucin.
200 +
280
480 2 240 x 100 = 24 000
- 00 240 = 2.4 x 10
4
UFC/mL

Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 3000 caloras, hallar los
recuentos de cada dilucin y dar como resultado la media de los dos valores obtenidos.
200 + 58 + 2400 +
280 94 7600
480 2 152 2 10000 2
- - - 240 x 10 12 76 x 100 5000
2400 - 7600 = 5 x 10
3

UFC/mL

10
-1

Incontables
200 280 320
20 10 15
200 280 340 58 73 94 21 15 10
10
-2

10
-3

10
-1
10
-2
10
-3

49

10 g o 10 mL
1 mL 1 ml
10
-3
10
-2

9 mL
H
2
O peptonada
9 mL
H
2
O peptonada
1 mL
1 mL
90 mL H
2
O peptonada 0,1%
HOMOGENIZAR 30
Dilucin 10
-1

400 mL capacidad
1 mL de dilucin sobre
placas estriles.
Verter agar fundido y
temperado 44-46C.
Homogenizar por rotacin.
Dejar solidificar.
Incubar 35C x 48 h
Contar el nmero de colonias en placas que presentan entre 30 y 300 colonias.
50

3.2 Numeracin de bacterias coliformes totales y termotolerantes : Mtodo de Tubos
mltiples de Fermentacin - Nmero ms Probable (NMP)
a. Pesar 10 g de la muestra y depositarlos en un recipiente de 400 mL de capacidad con 90 ml.
de agua peptonada al 0,1%
b. Homogenizar durante 30 segundos.
c. Realizar diluciones decimales con 9 mL. de agua peptonada al 0,1% ms 1 mL de la
dilucin anterior.
d. De cada dilucin transferir 1ml. a tres tubos con 10 mL. de caldo EC. Trabajas con tres
diluciones consecutivas.
e. Incubar a 35-37 C por 24 horas a 48 horas.
f. Examinar los tubos para determinar gas luego de 24 horas. Reincubar los tubos negativos
por 24 horas adicionales. Tomar una ansada de cada tubo positivo e inocular en caldo Brila y
caldo EC.
g. Incubar los tubos con caldo Brila a 35-37 C por 24 a 48 horas. Determinar la presencia de
gas y anotar el nmero de tubos positivos en cada dilucin. Expresar los resultados como NMP
de coliformes totales / g o mL, considerando las diluciones.
h. Incubar los tubos con caldo EC a 44,5 C por 24 a 48 horas. Determinar la presencia de gas
y anotar el nmero de tubos positivos en cada dilucin. Expresar los resultados como NMP de
coliformes termotolerantes / g ml. considerando las diluciones.

Per.
- MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de
Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per.

51

52

53

Practica VIII
Reconocimiento de hongos: mohos y levaduras

1. Introduccin
Los hongos son organismos hetertrofos, eucariotas que pueden ser unicelulares (levaduras)
o pluricelulares (mohos). Entre las levaduras la ms reconocida es Saccharomyces
cerevisiae y entre los mohos los gneros Aspergillus y Penicillium.
54

1.1. Gnero Aspergillus
Reino Fungi
Phyllum Ascomycota
Clase Euascomycetes
Orden Eurotiales
Familia Tricomaceae
Gnero Aspergillus

Para identificar a los hongos del gnero Aspergillus se les cultiva en medio Czapek durante 8
das y se observa la pigmentacin de las colonias, longitud de los conidiforos, forma de la
vescula, presencia de mtulas y posicin de las filides.

El gnero Aspergillus se caracteriza por presentar:
- Conidiforos que terminan en vesculas dilatadas.
- Filides o estructuras en forma de botella que originan a las conidias.
- Conidias dispuestas en cadena.
- En algunas especies se presentan las mtulas o estructuras de soporte de las filides y
las clulas de Hlle o estructuras hialinas de funcin desconocida.

1.1.1 Aspergillus niger
a. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son lanosas y blancas en un inicio y
posteriormente son negras. En el reverso presentan un color crema o gamuza.
b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas son esfricas cubiertas en su totalidad por las
mtulas, filides y conidias.
- Biseriado: Mtulas grandes y filides pequeas.
- Conidias lisas en un inicio y posteriormente rugosas.

1.1.2 Aspergillus terreus
a. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son aterciopeladas de color canela beige o
marrn y posteriormente se tornan granulosas con un exudado color mbar. En el reverso
presentan matices amarillos y marrones.
55

b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas tienen forma de cpula cubiertas solo en el
tercio superior por la mtulas, filides y conididas.
- Biseriado: Mtulas y filides.
- Conidias elpticas y lisas.

Figura 8.1 Aspergillus terreus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.1.3 Aspergillus fumigatus
a. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son vellosas y blancas en un inicio y
posteriormente se tornan aterciopeladas o granulosas, color azul verdoso, gris verdoso o verde
esmeralda. En el reverso presentan un color blanco o crema.
b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas tienen forma de cpula, cubiertas en su mitad
superior o dos tercios de su superficie por las filides.
- Uniseriado: Filides.
56

- Conidias globulosas y equinuladas.

Figura 8.2 Aspergillus fumigatus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.1.4 Aspergillus clavatus
a. Caractersticas macroscpicas: Las colonias tienen aspecto de fieltro y color verde azulado
o verde petrleo. En el reverso presentan tonalidades marrones.
b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas son claviformes y alargadas.
- Uniseriado: Filides.

Figura 8.3 Aspergillus clavatus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observacin microscpica

1.1.5 Aspergillus flavus
a. Caractersticas macroscpicas: Las colonias son aterciopeladas de color amarillo, verdoso,
marrn o verde amarillento. En el reverso presentan un color dorado a marrn rojizo.
b. Caractersticas microscpicas: Las vesculas estn cubiertas totalmente por las mtulas,
filides y conidas.
- Uniseriado o biseriado: Filides o mtulas y filides.

57

Figura 8.4 Aspergillus flavus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observacin microscpica.

1.2 Gnero Penicillium
Reino Fungi
Phyllum Ascomycota
Clase Euascomycetes
Orden Eurotiales
Familia Tricomaceae
Gnero Penicillium

Para identificar a los hongos del gnero Penicillium se les cultiva en PDA (Agar papa dextrosa)
durante 7 das y se observa la morfologa y color de las estructuras microscpicas.

El gnero Penicilliun se caracteriza por presentar:
58

- Conidiforos ramificados, distinguindose ramas y mtulas.
- Mtulas son las penltimas ramas que sostienen a las filides.
- Todas las clulas entre las mtulas y el conidiforo principal (estipe) son denominadas
ramas. El patrn de ramificacin puedes ser simple, con una ramificacin, con dos
ramificaciones o con tres a ms ramificaciones. Las colonias son de color verde con
aspecto pulverulento fino.

2 Objetivos
2.1 Diferenciar macroscpicamente levaduras y mohos
2.2 Diferenciar microscpicamente levaduras y mohos
2.3 Diferencias macroscpicamente Aspergillus y Penicillium
2.4 Diferenciar microscpicamente Aspergillus y Penicillium

3 Procedimiento
4.1 Caractersticas macroscpicas de levaduras y mohos
Levaduras: Las colonias se asemejan a las de las bacterias pero son ms grandes,
cremosas, mucosas, brillantes, de consistencia muy pastosa y a veces rugosa
Mohos: Las colonias son irregulares. Pueden ser algodonosas, aterciopeladas,
filamentosas, secas y presentar diferentes coloraciones.

59

Figura 8.5 Colonias en medios de cultivo a. Levaduras, b. Mohos
.

4.2 Caractersticas microscpicas de levaduras y mohos
Levaduras: Estn formadas por clulas esfricas u ovaladas, algunas de las cuales pueden estar
gemando.
Mohos: Estn formados por estructuras tubulares, filamentosas, denominadas hifas, que pueden
presentar septas (hifas septadas) o carecer de ellas (hifas cenocticas).

60

Figura 8.6 Caractersticas diferenciales de mohos y levaduras. a y b. Clulas levaduriformes c.
Hifa cenoctica d. Hifa septada.

4.3 Caractersticas macroscpicas diferenciales de los gneros Aspergillus y Penicillium

a b
c d
61

Figura 8.7 Colonias en medio de cultivo, a. Aspergillus niger, b. Penicillium sp.

3.4 Caractersticas microscpicas diferenciales de los gneros Aspergillus y Penicillium

Figura 8.8 Observaciones microscpicas, a. Aspergilluis niger, b. Penicllium sp.

62

Figura8.9 Caractersticas microscpicas del gnero Aspergillus

Figura 8.10 Caractersticas microscpicas del gnero Penicillium

63

Per.
- Muntaola, M. (1999). Gua de los Hongos Microscpicos. Barcelona, Espaa:
Ediciones Omega, S.A.

Prctica IX
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus aureus

1. Introduccin
64

Para aislar Staphylococcus aureus se utiliza el agar Baird Parker que es altamente selectivo
y permite el fcil reconocimiento de las colonias. Es un medio para el aislamiento y
diferenciacin de estafilococos en alimentos y muestras clnicas. Contiene cloruro de litio y
telurito que inhibe la biota acompaante en tanto que el piruvato y la glicina favorecen
relativamente el crecimiento de estafilococos. Sobre este medio opaco por su contenido de yema
de huevo las colonias de S. aureus muestran liplisis y protelisis a travs de halos y anillos
caractersticos y debido a la reduccin del telurito a teluro se desarrollan colonias negras.
La reaccin en la yema de huevo y la reduccin de telurito se presentan con notable
paralelismo con la prueba de coagulasa positiva y por lo tanto puede utilizarse como ndice de
esta ltima.
S. aureus utiliza la lipoprotena de la yema de huevo (lipovitelina) originando en el entorno
y debajo de la colonia reas de aclaramiento. Tambin se puede observar un precipitado blanco
en las reas total o parcialmente aclaradas debido a la formacin de sales de calcio y magnesio
de los cidos grasos liberados.

Agar Baird- Parker (g/L)
Peptona de caseina 10,0
Extracto de carne 5.0
Piruvato sdico 10
Glicina 12
Cloruro de litio 5,0
Agar- Agar 15
Agua destilada csp 1000 ml.
pH 6.80.2

Despus de esterilizar, enfriar a 45- 50C y aadir mezclando 50 mL de una emulsin de
yema de huevo y 3 mL de telurito de potasio.
2. Objetivos
2.1. Adquirir destreza en el aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de muestras de
alimentos

3. Procedimiento
3.1 Pesar 10 g. o medir 10 mL de muestra y homogenizar con 90 mL de agua peptonada
0.1% durante 30 segundos (10
-1
).Si es necesario realizar diluciones 10
-2
y 10
-3
.
65

3.2 Depositar 0,1 mL de la ltima dilucin en la superficie de placas de Petri con agar
Baird Parker y extender el inculo con la ayuda del ansa bacteriolgica en anillo.
(estriar en toda la superficie)
3.3 Incubar las placas de Petri a 37C por 48 horas.
3.4 Seleccionar las colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco rodeadas de
reas claras que se extienden en el medio opaco y repicar a viales con agar Tripticasa
soya (TSA). La probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus es muy
elevada (sucede lo contrario con las colonias negras brillantes con o sin margen
estrecho blanco pero que no presenten el rea de aclaramiento).
3.5 A cada colonia sospechosa se le realiza la prueba de la coagulasa la cual debe salir
positiva para confirmar S. aureus. Para realizarla sembrar cada colonia en caldo BHI
(caldo infusin cerebro corazn) e incubar 24 horas a 37C.
3.6 Tomar 0,2 ml de caldo BHI y llevar a tubos conteniendo 0,2 ml. de plasma (sangre de
conejo oxalatada)
3.7 Incubar a 37C. Examinar los tubos a las 4 horas para detectar la presencia de
cogulos. Si no se observan volver a leer a las 24 horas. La presencia de cogulos
demuestra una prueba de coagulasa positiva.
La presencia de S. aureus en un alimento en un nmero mayor de 10
4
clulas/g puede
indicar una manipulacin o condiciones sanitarias deficientes. Esto significa que la
contaminacin generalmente se da despus de la coccin, donde debido a una mala
manipulacin la bacteria se multiplica y forma suficientes cantidades de toxina como
para desarrollar una intoxicacin.

66

Figura 9.1 Staphylococcus aures, a. Colonias de S. aureus sobre medio Baird Parker,
b. Observacin microscpica de S. aureus.

Per.

PRCTICA X
RECONOCIMIENTO DE ALGUNAS BACTERIAS PATGENAS
TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS

1. Introduccin
Las enterobacterias son agrupadas de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa:
fermentadoras rpidas (coliformes: Escherichia, Enterobacter y Klebsiella), fermentadoras
lentas (coliformes: Citrobacter, Serratia, Hafnia, Yersinia) y no fermentadoras de la lactosa (no
coliformes: Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Providencia y Edwarsiella). Debido a
su accin patgena se distinguen Salmonella, Shigella, Yersinia y algunas cepas de Escherichia
67

coli. Como enterobacterias oportunistas son consideradas Klebsiella, Serratia, Hafnia,
Citrobacter, Proteus, Morganella, E. coli y Providencia, que en ciertas ocasiones pueden
comportarse como patgenos originando infecciones gastrointestinales, urinarias, supurativas,
etc.

Escherichia coli es un habitante comn de la microbiota facultativa del tracto
gastrointestinal de las personas y animales de sangre caliente. La mayora de las cepas de E.
coli son comensales inofensivos, sin embargo, algunas son patgenas y provocan enfermedad
diarreica. Estas cepas se agrupan en E. coli enteropatgenas (EPEC), enterotoxigncias (ETEC),
enteroinvasoras (EIEC), de adherencia difusa (DAEC), enteroagregantes (EAggEC) y cepas de
E. coli enterohemorrgicas (EHEC). El serotipo E. coli 0157:H7 es la causa de muchos brotes a
nivel mundial. El carcter grave de los sntomas de la colitis hemorrgica y del sndrome
urmico hemoltico (HUS) producidos por E. coli 0157:H7, sitan a este patgeno como uno de
los ms graves transmitidos por alimentos.

Salmonella spp. son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con un crecimiento
ptimo a 37 C, catabolizan la D-glucosa con produccin de cido y gas y no fermentan la
lactosa o la sacarosa.. La mayora son mviles por medio de flagelos peritricos, aunque hay
algunas especies inmviles, son catalasa positivas y oxidasa negativas, crecen en citrato como
nica fuente de carbono, generalmente producen sulfuro de hidrgeno y decarboxilan la lisina
con una reaccin alcalina por la produccin de cadaverina en el agar lisina hierro.

Las especies de Shigella son bacilos inmviles, con incapacidad para fermentar la lactosa
o para utilizar el cido ctrico como fuente de carbono, no producen H
2
S, y excepto por lo que
se refiere a S. flexneri, no producen gas de la glucosa. La disentera bacilar o shigelosis es
causada por las especies de Shigella y es una enfermedad de origen alimentario.

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, esporgeno, mvil, aerobio, pero crece bien en
anerobiosis y produce dos tipos diferentes de intoxicaciones alimentarias: el tipo diarreico y el
tipo entrico. Es un organismo saprfito habitual de la tierra y se propaga fcilmente a varios
tipos de alimentos, especialmente de origen vegetal, pero tambin se aisla con frecuencia en la
carne, huevos y productos lcteos. En los ltimos aos la aparicin de cepas psicrtrofas en la
industria lechera ha conducido a una vigilancia aumentada de Bacillus cereus.

2. Objetivos
2.1 Reconocer Escherichia coli, Salmonella sp. Shigella sp. y Bacillus cereus.

68

3. Procedimiento
3.1 Reconocimiento de Escherichia coli

Medio de aislamiento: Agar Mac Conkey
Colonias rojas Lactosa (+)
Reaccin tintorial Gram (-)
Morfologa celular Bacilos
Movilidad (+)
TSI A/A
Gas (+)
H
2
S (-)
LIA K/K
H
2
S (-)
Citrato (-)
Indol (+)

3.2 Reconocimiento de Salmonella sp.
Agar Mac Conkey Colonias incoloras, lactosa (-)
Agar SS Colonias incoloras o transparentes con o sin centro
negro.
Morfologa celular Bacilos
Movilidad (+)
TSI K/A
H
2
S (+) Algunos H
2
S (-)
Gas (+) Algunos Gas (-)
LIA K/K
H
2
S (+)
Citrato (+) Algunos (-)
Indol: (-)

3.3 Reconocimiento de Shigella sp.
69

Morfologa Bacilos
Movilidad (-)
Agar Mac Conkey Colonias incoloras, lactosa (-)
Agar SS Colonias incoloras o transparentes
TSI K/A
H
2
S (-)
Gas (-)
LIA K/A
H
2
S (-)
Citrato (-)
Indol (-) Algunos (+)

a b
70

Figura 10. 1 Colonias desarrolladas en agar Mac Conkey, a. Lactosa positivas, b. lactosa
negativas.

Figura 10. 2 Colonias de Salmonella sp. circulares con centro negro desarrolladas en agar SS.

3.4 Reconocimiento de Bacillus cereus
Medio de aislamiento Agar manitol yema de huevo polimixina
Reaccin tintorial Gram (+)
Morfologa Bacilos esporulados. Espora central no deformante
Movilidad (+)
Fermentacin de la glucosa (+)
Reduccin de nitrato a nitrito (+)
Hidrlisis de la gelatina (+)
Almidn (+)
B hemolisis (+)
Manitol (-)
71

Arabinosa (-)
Aerobio y anaerobio facultativo

4. Anexo
Agar Mc Conkey (g/L)
Peptona de casena 17,0
Peptona de carne 3,0
Cloruro de sodio 5,0
Lactosa 10,0
Sales biliares 1,5
Rojo neutro 0,03
Cristal violeta 0,001
Agar- Agar 15,0
H
2
O C sp 1000 mL
pH 7.1

Las placas servidas con este medio de cultivo son claras y de color rojo parduzco. Es un
medio diferencial para enterobacterias. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo
de las bacterias Gram (+) y de algunas otras Gram (-) no entricas. Las bacterias fermentadoras
de la lactosa forman colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo
neutro (rojo a pH menor de 6.8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias no
fermentadoras aparecen incoloras o transparentes.

Agar SS (Agar para Salmonella- Shigella) (g/L)
Extracto de carne 5.0
Peptona proteasa 5.0
Lactosa 10,0
Bilis de buey disecada 8,5
Citrato sdico 8,5
Trisulfato sdico 8,5
Citrato de amoniaco frrico 1,0
Verde brillante 0,0003
Rojo neutro 0,025
Agar- agar 14,0
H
2
O C sp 1000 ml
pH 7,00,1

72

Las placas servidas con este medio de cultivo son claras y parduzcas. La mezcla de sales
biliares, citrato de sodio y el verde brillante inhiben a la biota Gram positiva y lo hacen en parte
con el grupo de coliformes permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. El tiosulfato
sdico adems de ser inhibidor, permite demostrar el poder de formacin del sulfuro al unirse
con iones de hierro del citrato amoniacal frrico. En este caso las colonias presentarn un
ennegrecimiento. La lactosa permite diferenciar a las bacterias que la fermentan de las que no la
fermentan.
Salmonella y Shigella presentan colonias incoloras, transparentes lisas. Algunas
Salmonellas producen H
2
S formando colonias con el centro negro. E. coli presenta colonias de
color rosa o rojo.

Agar Manitol yema de huevo polimixina (g/L)
Peptona 10,0
D manitol 10,0
Cloruro sdico 10,0
Rojo de fenol 0,025
Agar- agar 12,0
Emulsin de yema de huevo 100 mL
Polimixina B sulfato 0,01 a 0,1
H
2
O csp 1000 ml
pH 7,10,1
Este medio permite diferenciar Bacillus cereus de Bacillus thuringiensis. B. cereus forma
lecitinasa y al actuar sobre la yema de huevo sta se acumula alrededor de las colonias
formando un precipitado blanco. B. thuringienses no forma lecitinasa.
B. cereus resiste frente a ciertas concentraciones de polimixina que inhiben a la biota usual
de acompaamiento (0,01 a 0,1 g/litro de medio), es manitol negativo y forma colonias
amarillas secas aserradas en la periferia de la colonia.

Per.
73


74

Prctica XI
Aislamiento, identificacin y mantenimiento de Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano

1. Introduccin
Leuconostoc mesenteroides es un microorganismo gramnegativo, con un porcentaje de G
+ C en su ADN que se encuentra dentro del margen de 37 41%. Son cocos dispuestos en pares
o en cadenas ms o menos cortas, heterofermentativos con produccin de cido D(-) lctico,
etanol y CO
2
, son mesfilos con desarrollo ptimo a 28C . Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides se caracteriza por utilizar citrato y sintetizar el polisacrido dextrano pero no
producir acetona ni diacetilo.
El dextrano es una goma soluble en agua que se utiliza ampliamente como espesante,
gelificante, agente de suspensin y coloide protector en distintos productos de consumo
humano. Este polisacrido muestra caractersticas propias aplicables en productos alimenticios
como estabilizador de jarabes azucarados, helados, dulces y clnicamente como expansor del
plasma sanguneo.
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides es una bacteria constituyente de la
microbiota del jugo de la caa de azcar que procede de la molienda en las empresas azucareras
del Per y dems fbricas del mundo y es la subespecie de mayor inters industrial como
productor de dextrano.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.
2.2 Seleccionar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides segn la produccin de
dextrano.
2.3 Mantener adecuadamente Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides productor de
dextrano.

3. Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificacin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
a. Muestra
Jugo Crusher o jugo primario de la molienda de caa de azcar (tambin se
puede utilizar jugo mezclado y jugo residual).
b. Procesamiento de la muestra
Realizar diluciones de la muestra en solucin salina fisiolgica estril hasta
10
-2
.
75

c. Aislamiento de Leuconostoc
Tomar una alcuota de 0,1 mL de la dilucin 10
-2
y sembrarla mediante la
tcnica de agotamiento y estra sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)
Incubar en aerobiosis a 28 C durante 48 horas.
Seleccionar las colonias puntiformes que al estar rodeadas de dextrano
presentan tamao grande (0.5- 3.0 cm dimetro), forma circular, bordes
enteros, elevacin convexa, consistencia gomosa, aspecto opaco, y son
incoloras.
Repicar las colonias seleccionadas hacia una placa conteniendo agar
hipersacarosado modificado.

d. Identificacin de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
Utilizar las colonias desarrolladas sobre agar hipersacarosado e identificar
tomando en cuenta la morfologa y la fisiologa. Para determinar la morfologa observar las
colonias caractersticas sin dextrano: puntiformes, 0.5 1 mm de dimetro, bordes enteros, lisas,
brillantes, incoloras. Realizar una tincin de Gram y reconocer la morfologa celular: cocos
Gram positivos, dispuestos en pares y en cadenas cortas sin formas esporuladas.
Cultivar tres cepas de L. mesenteroides ssp.mesenteorides en dos viales, uno con
agar hipersacarosado y otro con agar hipersacarosado modificado.

Tabla 11.1 Caractersticas diferenciales de Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc mesenteroides
ssp. cremoris ssp. dextranicum ssp. mesenteroides
Arabinosa - - +
Fructosa, Sucrosa o Trehalosa - + +
Formacin de dextrano a partir de
sucrosa
- + +
Fuente : Holt et al . 1994

3.2 Seleccin de Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides segn la produccin de
dextrano
a. Obtencin del inculo
76

Sembrar cada una de las cepas de Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroides mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre agar
Hipersacarosado (placas de Petri)
En cada una de las placas de Petri, seleccionar las tres colonias con dextrano
que presenten el mayor dimetro.
b. Produccin de dextrano
Transferir cada una de las tres colonias seleccionadas hacia matraces de 250
mL con 40 mL de caldo Hipersacarosado. Para lograrlo utilizando el asa
micolgica cortar el disco de agar de aproximadamente 0,5 cm de dimetro
que contiene integramente a cada una de las colonias seleccionadas.
Incubar a 28C durante 72 horas para permitir la produccin y acumulacin de
dextrano.
c. Recuperacin del producto dextrano
Verter el caldo Hipersacarosado fermentado en un vaso de precipitacin y
adicionar 30 mL de metanol absoluto lentamente y agitando constantemente
con movimientos rotatorios -
Dejar en reposo 5 horas o centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos
Filtrar el caldo fermentado y llevar el dextrano precipitado a estufa a 40 C
durante 24 horas para permitir su deshidratacin.
Pesar el dextrano seco acumulado.
Seleccionar la cepa de L. mesenteroides ssp. mesenteroides que alcanze el
mayor peso en dextrano seco.
3.3 Mantenimiento de cepas de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
productoras de dextrano
Repicar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides en viales con agar
hipersacarosado modificado. Incubar a 28 C y mantener en refrigeracin.

4. Anexo
4.1 Agar hipersacarosado (g/L)
Triptona 10,0
Citrato sdico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2.5
77

Sacarosa 100
Agar 15,0
Agua destilada 1000 mL
pH 7
Adicionar aspticamente 0,75 mL de una solucin estril al 1% de azida de sodio a
100 mL de agar hipersacarosado.

4.2 Agar hipersacarosado modificado (g/L)
Triptona 10,0
Citrato sdico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2.5
Agar 15,0
pH 7

4.3 Caldo hipersacarosado (g/L)
Triptona 10,0
Citrato sdico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2.5
Sacarosa 100 ,0
pH 7


- Gastelo, E. y Ortiz, J. (2005) Niveles de contaminacin por Leuconostoc mesenteroides
y Leuconostoc dextranicum en el proceso de elaboracin del azcar de caa. Empresa
agroindustrial Tumn, S.A. 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Velsquez, M. (2005) Leuconostoc mesenteroides productores de dextrano aisladas del
jugo de caa de cooperativas de produccin azucarera. Chiclayo. Enero, Marzo.2002.
Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
78

- Marguet, E. y Vallejo, M. (2007) Curso Internacional: Biotecnologa de Bacterias
AcidoLcticas. Su importancia en Procesos Industriales. Universidad Nacional Mayor
de San Marcos, 23 al 28 de abril de 2007, Lima

79

Prctica XII
Aislamiento, identificacin y mantenimiento de bacterias acticas

1. Introduccin
La actividad metablica microbiana no tiene siempre como consecuencia la proliferacin
celular. Si se considera la actividad metablica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la
curva crecimiento se diferencian aquellos procesos metablicos asociados al crecimiento celular
(metabolismo primario) de aquellos que tienen lugar en la fase estacionaria, una vez que ha
cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario). Como resultado se producen
diferentes tipos de compuestos, metabolitos primarios y secundarios.
Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen bien
como productos finales o intermediarios en las distintas rutas anablicas y catablicas y se
forman durante la fase primaria del crecimiento microbiano. Los ms importantes desde el
punto de vista industrial son alcoholes (etanol), aminocidos (cido glutmico, lisina, treonina),
cidos orgnicos (cidos lctico, actico, propinico, succnico, fumrico, mlico, tartrico,
ctrico, glucornico), polioles (glicerol, manitol), polisacridos (xantano, dextrano), azcares
(fructosa, sorbosa), vitaminas (riboflavina B
2
, cianocobalamina B
12
).
Las bacterias acticas son microorganismos bacilares o pleomrficos Gram negativos
(grampositivos en cultivos viejos) y estrictamente aerobios. Se distribuyen en los gneros
Acetobacter y Gluconobacter segn tengan o no capacidad de oxidar el acetato (presencia del
ciclo de Krebs funcional). Los integrantes de ambos grupos pueden diferenciarse cultivndolos
en agar slido que contenga alcohol y una suspensin de cal. Como consecuencia de la
formacin de cido actico a partir de alcohol primero se formar alrededor de las colonias de
ambos grupos un halo claro en el agar que tiene aspecto opaco y turbio porque el cido actico
transforma la cal en acetato de cal soluble. En las del grupo Gluconobacter esta zona se
mantiene y aumenta lentamente. Por el contrario en Acetobacter el acetato clcico se precipita
como CaCO
3
que se degradar a CO
2
y H
2
O con lo que la zona clara en torno a las colonias se
enturbiar otra vez si se siguen incubando las placas.
La caracterstica metablica que define al grupo de las bacterias acticas es la capacidad de
utilizar una gran diversidad de sustratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar
de tratarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio que crecen una gran cantidad de
catabolitos diferentes. Son responsables de la fermentacin actica a partir del etanol y
tambin de la formacin de cido glucornico a partir de la glucosa, sorbosa del sorbitol,
dihidroxiacetona de la glicerina y 5 cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del cido
80

actico, adems de muchos alcoholes, oxidan cidos orgnicos como el pirvico y el lctico y
algunos de ellos producen celulosa.
Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero dentro del gnero Acetobacter la prueba de la
catalasa puede dar una reaccin dbil e incluso nula (A. peroxydans). Pueden aislarse fcilmente
del vinagre y tambin del vino, la cerveza o los zumos de frutas agriadas.
El gnero Acetobacter inicialmente fue dividido en tres grupos: peroxydans (A.
peroxydans y A. paradoxum); oxydans (A. pasteurianus, A. levanicux, A. ascendens y A.
rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y A. mesoxydans). Actualmente se aceptan solo
tres especies: A. aceti, A. pasteurianus y A. peroxydans. Las dems seran subespecies.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar bacterias acticas.
2.2 Seleccionar bacterias acticas segn su produccin de acidez.
2.3 Mantener adecuadamente las bacterias acticas productoras de acidez.

3. Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificacin de bacterias acticas
a. Muestra
Frutas, jugo de caa de azcar.

b. Enriquecimiento de la muestra
Depositar 20 mL de cerveza en frascos de boca ancha.
Sumergir por 15 minutos y en frascos separados uva, manzana, limn, naranja
o jugo de caa de azcar.
Retirar los frutos.
Cubrir el frasco con gasa o malla para evitar la entrada de insectos.
Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 das.
Observar el crecimiento bacteriano en forma de un velo o pelcula blanquecina
sobre la superficie.
Realizar una tincin de Gram para determinar la presencia de bacilos cortos
Gram negativos.
c. Aislamiento
Tomar una alcuota de la pelcula bacteriana desarrollada en las muestras
enriquecidas y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre
agar Lee.
Incubar en aerobiosis a 28 C durante 24 o 48 horas.
Seleccionar las colonias amarillas.
81

Realizar tincin de Gram.
Repicar a viales conteniendo agar manitol o cultivar en cerveza.

d. Identificacin
Catalasa: Positiva para Acetobacter y Gluconobacter.
Crecimiento a pH 4.5: Positivo en caldo levadura glucosa pH 4,5.
Oxidacin del etanol a CO
2
: Cultivar en tubos conteniendo Agar Lee.
A las 24 horas el medio de cultivo y las colonias que produjeron cido actico se
observarn de color amarillo. A las 48 o 72 horas el medio de cultivo y las colonias
que oxidan el etanol a CO
2
retornan al color inicial del medio de cultivo.

Tabla 12.1 Caractersticas diferenciales de los gneros Gluconobacter, Acetobacter y
Pseudomonas
Caractersticas Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas
Flagelacin
Crecimiento a pH 4.5
Oxidacin de:
Etanol a cido actico a CO
2
cido actico a CO
2

Lactato a CO
2

Glucosa a gluconato
Aminocidos por clulas en reposo
Ciclo de Krebs
Produccin de 5 cetogluconato
Cetognesis
Quinonas Q10
Quinonas Q9
Hidrlisis de:
Lactosa y almidn
Gelatina
Pigmentos verdosos o fluorescentes
Polar o ninguna
+

+ (M)
-
-
+

-
-
+
+
+
-

-
-/D
-
Peritrica o ninguna
+

+ (F)
+
+
d

+
+
d
d
-
+

-
-
-
Polar

-

-
d
+
d

+
+
-
-

d
d
d
M: marcado, F: fuerte, d: variable
Fuente: Pars y Jurez , 1997
3.2 Seleccin de bacterias acticas segn su produccion de acidez
Sembrar 5 mL de una suspensin en solucin salina fisiolgica de cada una de las
cepas de bacterias acticas en matraces conteniendo 50 mL de cerveza.
Determinar la acidez titulable a travs del mtodo acidimtrico de Mann (Factor
para cido actico = 0, 006005)
Realizar los clculos correspondientes.

82

3.3 Mantenimiento de las bacterias acticas
Repicar las bacterias acticas a tubos tapa rosca conteniendo medio Estndar GYC
incubar a 28 C y mantener en refrigeracin. Repicar mensualmente.
Las bacterias acticas tambin se pueden mantener en cerveza, renovndola
semanalmente.

4. Anexo

4.1 Medio de Enriquecimiento: Cerveza
Colocar aspticamente en frascos de boca ancha 10 mL de cerveza.

4.2 Medio Lee (g/L)
CaCO
3
0.2
KH
2
PO
4
0.01
K
2
HPO
4
0.02
Peptona 1,0
Casaaminocidos 0.1
Extracto de Levadura 1.0
Glucosa 1.0
Agar 1.6
pH 7
Indicador Azul de bromotimol
Disolver y esterilizar a 121C x 15 minutos
Antes de su uso incorporar 0,5 mL etanol 75C

4.3 Medio Estndar (GYC) (g/L)
Extracto de malta 0.3
Extracto de levadura 1.0
D glucosa 5.0
Agar 2.5
Agua csp 100 mL
Mantener en frascos con tapa rosca

4.4 Medio agar manitol (g/L)
Peptona 0,3
83

Manitol 2,5
Agar 1.5
H
2
O csp 100 mL
pH 7.0

- Alva, R. y Romero, J. (2001). Obtencin de vino y vinagre a partir de la banana. Tesis
Ingeniero Qumico .Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Castillo, M. y Chavarri, N. (2004) Optimizacin de la concentracin de inculo, sustrato
y tiempo de incubacin en la optimizacin de vinagre utilizando Acetobacter aceti CECT
298T a partir de licor de maz en biorreactor Airlift. Tesis de Licenciatura. Lambayeque,
Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Pars, R. y Jurez, A. (1997). Bioqumica de los Microorganismos. Mxico: Editorial
Revert.

84

Prctica XIII
Aislamiento, identificacin y mantenimiento de Aspergillus niger
productor de cido ctrico

1. Introduccin
Los cidos orgnicos producidos por microorganismos se obtienen en fermentaciones
clsicas o anaerobias (cido lctico, cido propinico) y en las fermentaciones oxidativas u
oxidaciones incompletas (cido actico, cido glucnico, cido fumrico, cido ctrico, cido
glutmico, cetocidos, oxocidos).
Los microorganismos productores de cidos pueden ser detectados cuando son sembrados
en medio con agar y carbonato de calcio. Los carbonatos insolubles como el carbonato de calcio
(CaCO
3
) finamente pulverizado son muy tiles, porque debido a su insolubilidad no crean en el
medio de cultivo condiciones fuertemente alcalinas, especialmente si se usan con otros
amortiguadores; sin embargo, cuando el pH disminuye por debajo de 7.0, el carbonato se
descompone con desprendimiento de CO
2
. Las colonias microbianas productoras de cidos
disuelven la caliza precipitada o insoluble observndose fcilmente zonas claras sobre el fondo
opaco del medio de cultivo.
Muchos cidos se obtienen a escala industrial con la ayuda de hongos. La ventaja de su
utilizacin se basa sobre todo en la fcil recuperacin de los organismos a partir del caldo de
cultivo. Entre los principales cidos producidos por hongos se encuentran el cido lctico
(Rhizopus), fumrico (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus), cidos glucnico y
ctrico (Aspergillus, Penicillium).
El cido ctrico se produce en su totalidad por fermentacin. El descubrimiento de la
capacidad de algunos hongos filamentosos de producir cido ctrico se remonta a 1893, gracias
a los estudios de Wehmer. En 1917 Currie demostr que cepas de Aspergillus niger acumulaban
cido ctrico a la par con cido oxlico. Posteriormente se definieron las condiciones que
reducan la produccin del cido oxlico contaminante. A partir de entonces, variedades de
Aspergillus niger han dominado la produccin industrial, fundamentalmente porque su
fisiologa es ms conocida que la de otros hongos y porque utilizan materias primas de bajo
costo como melazas de caa.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar Aspergillus niger.
85

2.2 Detectar y seleccionar cepas de A. niger productoras de cidos orgnicos.
2.3 Mantener adecuadamente cepas de A. niger productoras de cidos orgnicos.

3. Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificacin de Aspergillus niger

a. Muestra
100 g de suelo agrcola

b. Procesamiento de la muestra
Tamizar la muestra de suelo (tamiz con malla de1.6 mm) y del material
obtenido tomar 10 g y llevarlos a un matraz conteniendo 90 mL de solucin
salina fisiolgica estril (10
-1
).
Homogenizar durante 20 minutos.
Realizar diluciones en solucin salina fisiolgica hasta 10
-3
.

c. Aislamiento e identificacin de Aspergillus niger
Tomar una alcuota de la dilucin 10
-2
y sembrarla por agotamiento y estra
sobre agar Sabouraud Dextrosa (placas de Petri)
Incubar las placas a temperatura ambiente (28 C ) hasta por 5 das.
Seleccionar las colonias caractersticas de Aspergillus niger, tomando en
cuenta las caractersticas macroscpicas y microscpicas.
Repicar las colonias seleccionadas a tubos conteniendo agar Sabouraud
Dextrosa inclinado.

d. Caractersticas macroscpicas de la colonia de Aspergillus niger
La colonia es inicialmente blanca o amarilla y rpidamente desarrolla un efecto de
pimienta negra sobre la superficie a medida que se forman las conidias (que pueden
volverse densas) de tal manera que la colonia se vuelve negra con el reverso de la
colonia de color crema. El aspecto de la colonia es pulverulenta y uniforme.

e. Caractersticas microscpicas de la colonia de Aspergillus niger
86

Hifas vegetativas: Hifas tabicadas que forman micelio filamentoso irregular,
ramificado, tabicado y de pared gruesa.
Conidiforo (esporforo de sostn): Hifas frtiles que emergen o parten de
una clula alargada del micelio vegetativo denominada clula pie (foot cell) y
terminan en una porcin ensanchada denominada vescula. Son incoloras, o
amarillo pardo, lisas, no tabicadas y de paredes gruesas.
Vescula o cabeza esporifera: Vescula esfrica de la cual emergen estructuras
de forma de botella denominados fialides cuyos extremos son puntos de
crecimiento de donde las conidas se estn continuamente formando. La conidia
ms joven es la que est ms cerca de la fialide y la ms vieja es la que est ms
lejos, al final de la cadena (Basipetalmente).
Segn algunos autores las filides se presentan en dos series: primarias y
secundarias. Segn otros autores las estructuras que salen directamente de la
vescula se denominan mtulas y estn adosados en paquetes cubriendo la
vescula (forma radial) y sobre ellos estn las filides que son ms pequeas,
con distribucin ms uniforme y es a partir de ellos de donde emergen las
conidias.
Conidias: Se ubican sobre las fialides formando cadenas (catenuladas) y al
madurar presentan una pared gruesa y rugosa debido a una sustancia negra
(aspergilina) que se deposita sobre su superficie y por tanto oscurecen la
superficie de la vescula.

3.2 Deteccin y seleccin de cepas de A. niger productoras de cidos orgnicos
a. Deteccin de cepas de A. niger productoras de acidez (screening primario)
Tomar un pequeo fragmento de colonia de cada una de las cepas de A. niger y
colocarlo en el centro de placas de Petri servidas con agar Carbonato de Calcio.
Incubar a temperatura ambiente (28 C) por 5 a 6 das.
Reconocer la produccin de acidez por la formacin de un halo traslcido
alrededor y por debajo de la colonia.

b. Seleccin de cepas de A. niger segn su produccin de acidez (screening
secundario)
Sembrar un pequeo fragmento de las colonias de A. niger productoras de
acidez en matraces de 250 cc de capacidad conteniendo 50 mL de medio de
fermentacin.
87

Determinar la acidez inicial (mtodo acidimtrico de Mann).
Incubar a T ambiente (28 C) durante 5 das.
Determinar la acidez final (mtodo acidimtrico de Mann).
Factor para cido ctrico: 0.007005

3.3 Mantenimiento de cepas de A. niger productoras de cidos orgnicos
Sembrar cada cepa de A. niger productora de acidez s en tubos conteniendo agar Papa
dextrosa. Incubar a 28 durante 5 das. Mantener en refrigeracin.

4. Anexo

4.1 Agar Papa Dextrosa (g/L)
Infusin de papa 500 mL. (200 g de papa pelada, picada y hervida con
500 mL de agua destilada).
Dextrosa 20
Agar 20
H
2
O destilada csp 1000 mL
pH 5,6

4.2 Agar Sabouraud Dextrosa
Dextrosa 20
Peptona 10
Agar 20
H
2
pH 5.6
Para inhibir el desarrollo bacteriano agregar cloramfenicol al 0.05% (disolver una
cpsula de cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol). Agregar 2 mL del antibitico
en 1 L de agar Sabouraud Dextrosa estril a 45 50 C.

4.3 Agar carbonato de calcio ((g/L)
NaCl 0,5
Glucosa 30,0
Peptona 5,0
Na
2
HPO
4
.12H
2
O 1,0
Agar 15.0 g
88

Carbonato de calcio (CaCO
3
) 10.0 g
H
2
pH 6.5

4.4 Caldo sacarosado para produccin de cidos orgnicos o medio de fermentacin
(g/L)
Sacarosa 190,0
MgSO
4
.7H
2
O 0.3
(NH
4
)NO
3
2.3
CaCO
3
5.0
KH
2
PO
4
1,0
H
2
pH 3 (ajustar con HCl 2M)


- Aldana, W. y Espinoza, M. (2001). Estudio paramtrico de la produccin de cido
ctrico a partir de Ipomoea batata (camote) variedad morado con Aspergillus. Tesis
Ingeniero Qumico .Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Claudio, E. y Zegarra, I. (1998). Aislamiento y seleccin de mohos productores de cido
ctrico a partir de sacarosa. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Per. Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Felipe, G. y Minchn, H. (2000). Optimizacin de la concentracin de sustrato, pH y
tiempo de incubacin en la produccin de cido ctrico por A.. niger en cultivo
sumergido. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz
Gallo.
- Torres, P. y Uriarte, M. (2002). Efectos del metanol en la produccin de cido ctrico
por Aspergillus niger en un medio de glucosa. Tesis ingeniero Qumico. Lambayeque,
Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Prctica XIV
Aislamiento, identificacin y mantenimiento de una cepa enolgica de
Saccharomyces cerevisiae

1 Introduccin
En el mercado existen levaduras enolgicas como por ejemplo las levaduras secas: S.
cerevisiae Montrachet y Pasteur Champagne; sin embargo, se prefiere el uso de cepas
levaduriformes que procedan de la zona vincola donde se van a utilizar. Estas levaduras
89

nativas o levaduras seleccionadas, estn adaptadas a las condiciones climticas de la zona, a la
materia prima, es decir al mosto a fermentar y son responsables, al menos parcialmente de las
caractersticas nicas de los vinos obtenidos.
1.1 Aislamiento de levaduras
El primer paso para seleccionar una levadura nativa, es conocer la biota autctona a travs de
un estudio ecolgico en el que se hacen aislamientos de levaduras de las fermentaciones
espontneas en la zona a estudiar durante varias campaas. De esta manera, adems de tener un
nmero mayor de cepas, el aislamiento de una misma cepa durante aos consecutivos puede ser
un buen indicador de que se trata de una cepa bien adaptada a las condiciones de la zona.
1.2 Identificacin de cepas de levaduras
La primera diferenciacin que se debe realizar a las colonias de levaduras aisladas es a
nivel de especie mediante medios selectivos, concretamente el medio lisina en donde las cepas
de Saccharomyces cerevisiae no crecen (porque la nica fuente de nitrgeno es la lisina), pero
si desarrollan otras levaduras. La segunda diferenciacin, para la cual se eligen aleatoriamente
40 a 50 colonias de S. cerevisiae, permite la identificacin a nivel de cepa utilizando tcnicas
de biologa molecular (anlisis de los perfiles de restriccin del ADN mitocondrial :RFLP s).
1.3 Proceso de seleccin en laboratorio
Los criterios utilizados hasta ahora para la seleccin de S. cerevisiae consistan en una
sucesin de pruebas para determinar la ausencia o presencia de determinados caracteres
importantes en cepas vnicas como presencia de factor killer, tiempo de fermentacin, capacidad
fermentativa en mostos con elevadas concentracin de azcar, formacin de sulfuro de
hidrgeno; sin embargo, el ir probando cada una de las cepas en fermentaciones individuales y
caracterizar todos los productos finales es una labor muy tediosa, por lo que es preferible
realizar la seleccin de cepas en fermentaciones masivas por competencia.
Se elige un nmero definido de cepas de S. cerevisiae, se inoculan en un mismo
fermentador y se hace un seguimiento de su crecimiento durante la fermentacin. La
poblacin inicial de las cepas debe ser la misma para que todas tengan las mismas
posibilidades de imposicin (1 x 10
5
UFC/ mL). El nmero de cepas a analizar depender
de las cepas aisladas, pero no sera aconsejable utilizar un nmero superior a 20 cepas
(poblacin final de 2 x 10
7
UFC / mL).
Si se tiene un nmero superior a 20 cepas, es recomendable descartar algunas. Un
criterio a seguir puede ser tomar como referencia las fermentaciones espontneas y elegir
aquellas cepas que hayan tenido una presencia relevante a lo largo de stas. De hecho, se
pueden dar casos de cepas, que se hayan aislado en porcentajes muy bajos en un
momento determinado de la fermentacin y en 1 solo ao y que por tanto, no puedan
considerarse levaduras representativas de la zona, ya que probablemente se trate de cepas
90

que son poco resistentes al etanol y a las condiciones existentes, y que por tanto, no se
impondran en un fermentacin competitiva.
Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeos
fermentadores (botellas de 500 mL de capacidad). Es importante intentar simular las
condiciones de fermentacin que posteriormente se utilizarn en bodega. Para ello, lo
ideal es utilizar mosto concentrado diluido (450 mL con una concentracin final de
azcar de 200 g/L, una acidez de 6 y un pH inicial de 3.3), ya que tiene todos los
nutrientes necesarios para una correcta fermentacin. Adems, al utilizar este mosto
concentrado se puede regular la concentracin de azcares, lo cual ya supone una
caracterstica adicional de seleccin al poderse fijar unas condiciones ms o menos
restrictivas de fermentacin (por ejemplo altos contenidos en azcar, condicionarn altos
grados alcohlicos).
Aparte de la propia competencia entre cepas, se puede aplicar algn otro criterio de
seleccin que pueda resultar interesante, y as acelerar el proceso de seleccin. Este
criterio depender del tipo de fermentacin al que se dirija la seleccin (Tabla 14. 1). El
seguimiento de las cepas se realiza por RFLPs del ADN mitocondrial seleccionando las
cepas que se imponen en la fermentacin.

Tabla 14.1 Algunas de las caractersticas deseables y no deseables en la seleccin de una cepa
enolgica de Saccharomyces cerevisiae

Caractersticas deseables Caractersticas no deseables
Alta tolerancia al etanol.
Total degradacin de los azcares
fermentables.
Resistencia al SO
2
.
Capacidad fermentativa a bajas temperaturas.
Mxima reduccin de la fase de latencia.
Degradacin del cido mlico.
Capacidad fermentativa a altas presiones.
Produccin de glicerol.
Produccin de B glucosidasa.
Produccin de SO
2
.
Produccin de H
2
S.
Produccin de acidez voltil.
Produccin de acetaldehdo y
piruvato.
Produccin de espuma.
Formacin de precursores del
carbamato de etilo.
Produccin de polifenol oxidasas.
91

Fenotipo Killer.
Fuente :Torija, 2002

1.4 Fermentaciones industriales en el laboratorio (bodega experimental)
Cada una de las cepas seleccionadas, se inocula de forma individual en un fermentador con
mosto concentrado diluido y se monitorea la fermentacin. Aunque parezca de poca importancia,
se trata de un paso bsico, ya que el hecho de una cepa se haya impuesto en una fermentacin
masiva no garantiza que pueda realizar una fermentacin completa por ella sola. Adems, se
deben analizar las caractersticas organolpticas del vino obtenido con cada cepa, anlisis que
hasta ahora no se haba podido hacer porque al ser un conjunto de cepas no se poda saber cual
era la que proporcionaba las diferentes caractersticas, favorables o desfavorables.
Despus de las pruebas en el laboratorio que permiten determinar que cepas presentan
buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duracin de la fermentacin), resistencia
a elevadas concentraciones de azcares (debido a las caractersticas particulares de la zona de
seleccin), resistencia a elevadas concentraciones de etanol, produccin de glicerol, steres,
alcoholes superiores, baja acidez voltil y resistencia a SO
2
, se realiza una cata y se eligen las
cepas que adems de fermentar correctamente, tengan un mejor perfil cromtico, aromtico y
gustativo.

1.5 Fermentaciones industriales (bodega industrial)
Las levaduras elegidas se inoculan de forma independiente en un depsito a escala
industrial. Se hace el seguimiento de la fermentacin, controlando la imposicin de la cepa
estudiada sobre la biota autctona de la zona mediante RFLPs del ADN mitocondrial. En el caso
de imposicin, se realiza una analtica completa de los vinos obtenidos, tal y como se ha
explicado en las fermentaciones en laboratorio, con la posterior cata realizada por especialistas.
Las cepas que cumplan todos stos requisitos estarn aptas para ser seleccionadas. Si se tienen
varias, en la eleccin de una u otra se deber valorar, principalmente, las caractersticas
organolpticas, es decir, aquella que proporciona un vino de mayor calidad.
1.6 Deshidratacin
Si las cepas levaduriformes seleccionadas son de inters comercial, queda un ltimo paso
por investigar, que es su deshidratacin. No todas las cepas resisten bien ni mantienen sus
caractersticas tras el secado y la posterior rehidratacin y por tanto, aunque se trate de una cepa
de caractersticas extraordinarias, sino se puede deshidratar, no ser una buena levadura para su
uso industrial.
92

La produccin de levaduras secas activas (LSA) es un proceso muy importante, ya que se
realiza en condiciones de aerobiosis (presencia de oxgeno), para conseguir una elevada
biomasa y una reserva de cidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios durante el
proceso fermentativo (semianaerobiosis) donde la sntesis de estos compuestos est inhibida.
Este proceso hace que las levaduras estn metablicamente activas cuando se rehidratan y por
tanto, su imposicin sea ms rpida. Por este motivo, no es necesario hacer un pie de cuba antes
de inocular estas LSA. De hecho, el hacer demasiadas rplicas al preparar el pie de cuba antes
de inocular, puede restarle efectividad a las LSA.
Una vez que la levadura ha superado todas estas fases, an se hace necesario el anlisis de su
estabilidad gentica. Es conocida una cierta inestabilidad, que hace que despus de muchas
generaciones (que es el caso de la produccin industrial de LSA), el porcentaje de mutaciones
sea elevado, por lo que dicho anlisis es un requisito imprescindible.
1.7 Proceso de seleccin en bodega
Una vez superadas las diferentes fases del proceso de seleccin y de la produccin
industrial (incluido el secado), queda la ltima fase y definitiva: su uso industrial en bodega y su
aceptacin final, que es la autntica prueba de fuego de todo el proceso.

2 Objetivos
2.1 Aislar e identificar Saccharomyces cerevisiae de mosto fermentado.
2.2 Seleccionar S. cerevisiae segn el tiempo de duracin de la fermentacin y grado
alcohlico alcanzado.
2.3 Mantener adecuadamente la cepa enolgica de S. cerevisiae seleccionada.

3 Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificacin de S. cerevisiaea partir de mosto fermentado
3.1.1 Obtencin de mosto fermentado
a) Adquirir 0,5 k de uva dulce tinta (pulpa y hollejo prpura) o tintrea
(hollejo prpura).
b) Proceder al desgranado: Manualmente separar los granos del raspn, y
colocarlos en un depsito limpio. En simultneo eliminar los frutos
deteriorados.
c) Realizar el estrujado: Triturar los granos de uva, lo suficientes para lograr
la separacin total de hollejo y la pulpa pero no para deteriorar las pepas.
d) Depositar el material resultante o mosto en un matraz de fermentacin
previamente esterilizado. Tapar con algodn e incubar a 28 C durante 24
93

horas. Cambiar el algodn por una tapa hermtica de goma que presenta un
agujero en el centro para permitir la salida de CO
2
a travs de una cnula
que desemboca en un frasco con una solucin de NaCl. Incubar a 28 C
durante 72 horas.

3.1.2 Aislamiento de levaduras
a) Tomar una alcuota del mosto fermentado y sembrar mediante la tcnica de
agotamiento y estra sobre agar Sabouraud glucosado (placas de Petri).
b) Incubar a 28 C durante 24 a 48 horas.
c) Seleccionar las colonias redondas, blancas o cremosas, convexas, con
bordes enteros, de consistencia mantecosa, con un dimetro aproximado de
hasta 5 mm y realizar una tincin simple con azul de metileno para
verificar la presencia de levaduras.
d) Cultivar las colonias de levaduras en viales con agar Sabouraud glucosado
inclinado e incubar a 28 C durante 24 horas.

3.1.3 Identificacin de S. cerevisiae
a) Para identificar el gnero Saccharomyces inducir la formacin de la fase
sexual de la levadura (facultad esporulante). Cultivar cada una de las cepas
levaduriformes en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas y
sembrarlas por dos veces consecutivas en el medio de preesporulacin agar
nutritivo enriquecido contenido en tubos de prueba.
Despus de incubar a 28 C durante 48 horas en cada una de las resiembras,
sembrar en el medio de esporulacin agar acetato contenido en tubos de
prueba. Incubar a 28 C y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20
das mediante extensiones coloreadas con la tincin de Schimwell
modificada por Mc Chung para investigar la presencia de ascas con
acosporas.
El mtodo de coloracin consiste en:
Tomar una pequea muestra del cultivo examinado y mezclar con una gota
de agua sobre una lmina portaobjetos. Fijar en la llama del mechero muy
lentamente y cubrir con verde de malaquita al 5% durante 30 a 60
segundos.
Calentar por tres veces hasta la emisin de vapores. Enjuagar con agua
tibia durante 30 segundos. Cubrir con una solucin acuosa de safranina al
0.5% durante 30 segundos.
Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin.
94

Anotar la presencia de ascosporas coloreadas de verde y el resto de
material color rojo. Contar su nmero y la forma de las mismas en el
interior del asca.
Las ascosporas de S. cerevisiae se forman en nmero de una a cuatro en un
asca. Son redondas y lisas con un dimetro aproximado de 3,5 um. Con
frecuencia se forma una cua protoplasmtica entre las ascosporas.
b) Para identificar la especie S. cerevisiaerealizar la prueba de fermentacin
de carbohidratos. Obtener una suspensin de clulas (de cada una de las
cepas de levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado durante 24
horas) en solucin salina fisiolgica estril e inocular 0,1 mL en tubos de
16 x 160 mm (con campana de Durham) con 9 mL de medio base de
fermentacin ms carbohidratos al 2%: glucosa, galactosa, sacarosa,
maltosa y lactosa. Incubar por 48 horas (hasta por 15 das) a 28 C. No
ajustar hermticamente el tapn de los tubos. La fermentacin es positiva
cuando en las campanas de Durham se observa la presencia de gas. Un
color amarillo indica la utilizacin del carbohidrato ms no la fermentacin
de ste.
c) Para determinar las caractersticas morfolgicas de las levaduras, sembrar
0,1 mL de la suspensin de clulas en tubos conteniendo 9 mL de caldo
extracto de malta. Incubar a 28 C durante 2 a 10 das. A partir del tercer
da de incubacin tomar una gota del cultivo, realizar un frotis y una
tincin con azul de metileno. Determinar la forma de las clulas,
dimensiones y reproduccin vegetativa. S. cerevisiae puede tener forma
elptica y redondeada siendo la forma de la mayor parte de las clulas
jvenes redondeada u oval. Miden de 3 a 7 um de ancho por 4 a 14 um de
longitud (la relacin entre la longitud y ancho por lo general es menor que
2). Su reproduccin vegetativa es por gemacin multilateral.

3.2 Seleccin de S. cerevisiae segn el tiempo de duracin de la fermentacin y
concentracin de alcohol alcanzado
3.2.1 Obtencin del mosto
Adquirir 1 k de uva dulce, lavarlas con agua potable y obtener mosto de
manera similar a lo explicado en el item 3.1.1. Filtrar el mosto, determinar su volumen y
proceder a su acondicionamiento (correccin del azcar, acidez y primer sulfitado). Para la
correccin del azcar, homogenizar el mosto con una paleta de madera y determinar los grados
Brix. Para iniciar el proceso de fermentacin el mosto debe tener un mximo de 24 Brix. Si el
95

deseado Brix 100
) inicial Brix - deseado )( mosto de muestra la de Peso (
Brix
Kg 088 , 0
24 100
) 15 24 )( 750 , 0 (

valot es menor, agregar azcar blanca en una cantidad determinada a travs del siguiente
clculo:

Ejemplo:

Suponer que se toma una muestra de 750 g de mosto con 15 Brix.

Se debe agregar 88 g de azcar para alcanzar 24 Brix.

En caso de no tener Brixmetro, agregar 120 g de azcar blanca por litro del volumen total del
mosto a fermentar. Para la correcin de la acidez del mosto, medir con la cinta de pH y ajustar a
3,3 con cido tartrico. A continuacin realizar el primer sulfitado agregando 0,1 g de
metabisulfito de sodio por litro de mosto y homogenizar con la paleta de madera.

3.2.2 Fermentacin en laboratorio
Depositar 300 mL mL de mosto acondicionado en matraces de 500 mL de
capacidad e inocularlos con 5 mL de una suspensin de levaduras cultivadas en agar Sabouraud
glucosado a 28 C durante 24 horas. Determinar el nmero de clulas viables. La poblacin final
de levaduras deber ser de aproximadamente 2 x 10
7
UFC / mL.
Tapar con algodn e incubar a 28 C durante 24 horas. Cambiar el algodn por
una tapa hermtica de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2
a travs de una cnula que desemboca en un frasco con una solucin de NaCl al 20 % y en
donde se observar el burbujeo del CO2 eliminado durante el proceso. Incubar a 28 C durante
72 horas. el burbujeo del CO
2
eliminado durante el proceso.
La finalizacin del burbujeo determinar el final de la fermentacin, momento
en el cual se medirn los grados de alcohol alcanzados (mtodo de destilacin o con el
vinmetro). En caso de no tener el equipo necesario, tambin se puede determinar la capacidad
productiva de alcohol, indirectamente, pesando diariamente cada uno de los matraces previa
agitacin a fin de eliminar el anhdrido carbnico. La determinacin del peso se debe realizar
hasta que ste muestre un valor constante lo que indica que la fermentacin ha concluido.

3.3 Mantenimiento de cepa enolgica de S. cerevisiaeseleccionada
Sembrar la cepa de S. cerevisiae seleccionada en caldo Sabouraud Glucosado, incubar
a 28 C durante 24 horas y mantener en refrigeracin.
96

4 Anexo

4.1 Agar Sabouraud glucosado (g/L)
Peptona 10,0
Glucosa 20,0
Agar 20,0
Agua csp 1000 mL
pH 5,6

4.2 Agar nutritivo enriquecido (g/L)
Glucosa 5,0
Caldo nutritivo 3,0
Agar 2,0
pH 5,6

4.3 Medio agar acetato (g/L)
Acetato de potasio 0,98
Glucosa 0,1
Agar 2,0
Agua csp 100 mL
pH 6 0.5

4.4 Medio base para fermentacin de carbohidratos
Peptona 0,5
NaCl 0,5
Agua csp 100 mL
pH 7.0
97

Una vez que se ha medido el pH se le agrega el indicador rojo de fenol O,OO2 g por
l00 mL. Posteriormente se le agrega el carbohidrato al 2 % ..

4.5 Caldo Extracto de malta
Pesar 1,5 g de extracto de malta para 100 mL de agua destilada.

4.6 Solucin verde malaquita
Verde de malaquita 0,01 g

4.7 Solucin safranina
Safranina 0,25 mL
Agua 100 mL

4.8 Recuento de clulas viables
El recuento de clulas puede ser realizado en cmaras de contaje o hematocmetros
(diseados para contar los glbulos de sangre) que consisten en una lmina de cristal de
una dimensin aproximada a la de una lmina portaobjetos, pero de mayor grosor. Tienen
ranuras en forma de H, con rieles a cada lado que sostienen un cubreobjeto grueso especial
a una distancia de 0.1 mm por encima de las dos porciones interiores de la H, que forman
dos cmaras entre stas y el cubreobjetos. El cubreobjetos es grueso para impedir que se
hunda en el centro en su parte no sostenida, lo cual reducira el volumen de las cmaras. El
fondo de cada una de las cmaras tiene un rayado Neubauer de 9 mm
2
(3 mm por lado)
dividido en nueve cuadrados principales (C.P.) de 1 mm por lado, en los que se cuenta
arbitrariamente el contenido de cinco: los cuatro de las esquinas y el central (A, B, C, D y
E) para calcular la concentracin de propgulos cuando stos son relativamente grandes.
Como el volumen sobre cada C.P. es 0.1 mm
3
, para calcular la concentracin por cc (10
000 veces mayor), se procede en la forma siguiente:
SUMA de 5 C.P. x 2 000 = nmero / cc

Cuando los propgulos son pequeos se usa el C.P. central que est dividido en 25
cuadrados secundarios (C.S.) de 32 mm por lado de los cuales est dividido en 16
cuadrados menores de 0.05 mm por lado. Entonces la concentracin se calcula as:
NMERO en el C.P. CENTRAL x 10 000 = nmero / cc

See pueden conseguir resultados similares representativos haciendo contadas en una
fraccin del C.P. central, con la consiguiente reduccin de la labor. Se cuentan lo
98

propgulos en un nmero reducido de los C.S. Por ejemplo, si se observan los cuatro C.S.
esquinados y el central, entonces:
SUMA de 5 C.S. x 50 000 = nmero / cc

Si se observan los cuatro C.S. esquinados y cuatro que rodean al central, entonces:
SUMA de 8 C.S. x 31 250 = nmero / cc

4.8.1 Procedimiento para realizar el recuento de clulas levaduriformes viables
- Realizar una suspensin acuosa del cultivo de S. cerevisiae a ser evaluado.
- Llevar 0,5 mL de la suspensin hacia un tubo y adicionar 0,5 mL de azul
de metileno (proporcin 1/1).
- Homogenizar y hacer recuento en la cmara de Neubauer en los cinco
cuadrados principales o primarios.
- Las clulas viables se observan refringentes, incoloras y las clulas no
viables de color azulado u opacas.
- Realizar los clculos correspondientes y multiplicar por el factor de
dilucin.
Factor de dilucin = Volumen total diluido/Volumen de la muestra.
1/0.5 = 2
- Alvarado, X. y Muro, J. (2007). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin en
la elaboracin de chicha de jora con Saccharomyces cerevisiae nativa.Tesis
Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Chirre, C. y Farroay, D. (2007). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin
en la elaboracin de cerveza Lager en el Centro de Produccin-Investigacin de la
Cervecera Industrial La Otra. Lambayeque.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Zamora, D. ( 2006). Concentracin de inculo y tiempo de fermentacin en la
elaboracin de vino semiseco por Saccharomyces cerevisiae nativa a partir de Vitis
vinfera uva. Tesis Licenciatura. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro
Ruiz Gallo.
- Reao, A .y Sierra, Z. (2008). Estudio tcnico para la elaboracin de cerveza tipo Ale
con adicin de zumo de pia como un sucedneo no amilceo. Tesis Ingeniero en
Industrias Alimentarias. Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
- Torija, J., (2002) Ecologa de levaduras: Seleccin y adaptacin a fermentacin vnica.
Tesis Doctorado. Espaa, Universidad Rovira y Virgili.
99

PRACTICA 15
Sistema HACCP y su aplicacin en la industria alimentaria

1. Introduccin
HACCP es un sistema que identifica, evala y controla los peligros que son significativos
para la seguridad del alimento.
HACCP son las siglas de:
H: Hazard
A: Analysis
C: Critical
C: Control
P: Point

Es una herramienta de seguridad de alimentos desarrollada por la industria alimentaria para
la industria alimentaria. HACCP examina cada paso de una operacin de alimentos,
identificando peligros especficos as como implementando medidas de control eficaces y
procedimientos de verificacin. HACCP no es un sistema de peligros. Est diseado para
minimizar los riesgos y como tal es una herramienta de gestin de inocuidad.

El sistema HACCP:
Es sistemtico.
Deber estar orientado por evidencia cientfica de riesgos para la salud humana.
Identifica peligros especficos y medidas para su control.
Se centraliza en la prevencin (en vez de depender principalmente de los ensayos
del producto final).
Es capaz de adaptarse a cambios (por ejemplo en avances en el diseo de equipos).
Puede aplicarse a lo largo de la cadena alimentaria (de la chacra a la mesa, del
campo al plato, etc.)
Requiere el compromiso total y participacin de la direccin y el personal.
Requiere un enfoque multidisciplinaria.
Es compatible con la implementacin de sistemas de gestin de la calidad.
Es el sistema de eleccin para la gestin de la seguridad de alimentos.

Anlisis de peligros y puntos
crticos de control
100

1.1 Los 12 Pasos de HACCP
Al disear o implementar HACCP, es esencial seguir los 12 pasos siguientes:

1. Formar el equipo de HACCP

2. Describir el producto

3. Identificar el uso revisto

4. Elaborar un Diagrama de Flujo

5. Verificacin In Situ del Diagrama de Flujo
Los Siete (7) Principios de HACCP
6. Hacer una lista de todos los posibles peligros
Realizar un Anlisis de Peligros
Determinar Medidas de Control

Principio 1

7. Determinar PCCs Principio 2

8. Establecer Lmites Crticos para cada PCC Principio 3

9. Establecer un Sistema de Monitoreo para cada PCC Principio 4

10. Establecer acciones correctivas para
Desviaciones que pueden producirse
Principio 5

11. Establecer procedimientos de verificacin Principio 6

12. Establecer mantenimiento de registros y
documentacin

Principio 7
1.2 Por qu el HACCP?
Actualmente existe una creciente demanda global de la implementacin de los
principios de HACCP para mejorar la seguridad de alimentos. Los tradicionales sistemas de
inspeccin al final de la lnea no han permitido un suministro de alimentos continuamente
seguros.
101

Las marcas multinacionales utilizan HACCP para lograr el estndar requerido de
seguridad de alimentos y asegurar que le valor de la marca este totalmente protegido. A nivel
global, se ha presentado un incremento en la demanda por HACCP, debido a que se reducen
los incidentes causados por alimentos contaminados, los cuales tienen implicancias en la salud
humana incrementando los costos al proveedor y a la comunidad. HACCP es un sistema
probado que da la confianza que la seguridad de alimentos es gestionada de manera eficaz.
Permite a los proveedores centrarse en la seguridad y calidad de alimentos y concentrase en la
prevencin como mtodo de control.

1.3 Los Peligros
Al realizar un anlisis de peligros se debe diferenciar las consideraciones de seguridad
y calidad. Los peligros de seguridad de alimentos segn la definicin del CODEX son todos
aquellos agentes biolgicos (peligros biolgicos), qumicos (peligros qumicos) o fsicos
(peligros fsicos) en un alimento o estado de mismo que tienen el potencial para causar un efecto
adverso en la salud. Los peligros de calidad son aquellos factores que tienen el potencial para
causar un efecto adverso en la calidad del producto o proceso y por consiguiente en la
rentabilidad.

SECUENCIA DE PASOS PARA LA APLICACIN DEL HACCP EN PRODUCTOS DE
PANADERA

PASO A: Conformacin del Equipo de HACCP
Este grupo ser responsable de la conduccin del plan HACCP, elaborado e
implementado, para cada producto o grupo de productos elaborados en la
panadera. Una persona infaltable en el equipo es el administrador de la panadera quien lidera
el equipo y estar integrado adems por el resto de trabajadores hasta un mximo de cinco
personas.
Organigrama de la Empresa:

ADMINISTRADOR
102

Descripcin de responsabilidades
a. Administrador
Coordina la ejecucin del Plan con los dems miembros el equipo y lleva los registros
derivados de la aplicacin del sistema.
b. Maestro panadero y ayudantes
Actan como vigilantes y aplican las medidas de seguridad y/o prevencin para mantener
los PCC bajo control en cada uno de los productos elaborados, en consulta con el administrador.
El equipo en su totalidad debe haber recibido capacitacin en HACCP y dispondr de
manuales o guas para el desarrollo de sus actividades.

PASO B: Descripcin del producto y uso esperado
Es necesario elaborar una descripcin y uso esperado para cada producto que elabora la
panadera.
NOMBRE : PAN FRANCS
Composicin: Harina de Trigo, agua, azcar, sal y leudantes.
Por quienes ser consumido; Por la poblacin en general.
Proceso: Se mezclan la harina, agua, azcar, sal y sustancias leudantes, se amasa, se soba, se
fracciona y moldea (boleado); se fermenta, se hornea, reposa y luego se distribuye.
Tipo de empaque: Se expende a granel y en bolsa de polietileno de primer uso.
Vida til: 24 horas.
Condiciones de venta/distribucin: Mantener bajo sombra y protegido del polvo y del sol.
Etiquetado e instrucciones:

PASO C: Elaboracin de Diagrama de Flujo

103

PASO D: Verificacin in situ del Diagramo de Flujo
Acompaar el proceso de elaboracin en la panadera para confirmar si el diagrama de
flujo se ajusta a la realidad.

PASO E: Enumeracin de todos los riesgos posibles
Ejecucin de un anlisis de peligros, de los riesgos para su ocurrencia y determinacin
de las medidas preventivas.
Peligros biolgicos
Presencia de Bacillus cereus y B. licheniformis en la harina: Bacterias que tienen la capacidad
de esporular y cuando la temperatura desciende en el producto, puede desarrollarse y producir
dos tipos de toxinas que producen vmitos y diarrea en el consumidor. Estas bacterias se
encuentran en el suelo, en donde contaminan a los cereales. Para evitar su germinacin y
crecimiento es esencial un control estricto de la temperatura y humedad durante el enfriado y
almacenamiento. Los hongos tambin pueden significar un peligro cuando se trata de especies
generadoras de toxinas, la presencia de estos patgenos ocurre casi siempre por "contaminacin
cruzada", al entrar en contacto el producto terminado con ambientes, superficies o envases
contaminados. El consumo de alimentos con aflatoxinas produce cncer a largo plazo. Las
aflatoxinas contaminan normalmente los granos durante la cosecha y almacenamiento.
Peligros qumicos
La contaminacin qumica puede ocurrir durante el transporte y almacenamiento de la
harina (insecticidas, combustibles o detergentes). Existen casos reportados de intoxicacin por
consumo de pan elaborado con harinas contaminadas con sustancias qumicas liquidas durante
el transporte. Los residuos de plaguicidas en las cosechas por aplicacin en exceso o a
destiempo, durante la produccin y almacenamiento del grano, constituyen peligro qumico
importante para la seguridad del pan. Asimismo, el uso excesivo de aditivos alimentarios, o el
uso de aditivos no permitidos, como el bromato de potasio, aditivo blanqueador y leudante de
las masas que resulta peligroso por haberse comprobado que es riesgoso para la salud.
Peligros fsicos
Entre los peligros identificados en la elaboracin de productos de panadera estn: astillas,
trozos de madera trozos de algodn, excremento de roedores, insectos (cucarachas, moscas,
larvas de polillas). Las medidas preventivas en estos casos estn cubiertas por las Buenas
Prcticas de Higiene (BPH) y el Programa de limpieza, desinfeccin y control de vectores.

Paso F: Determinacin de los PCC
PCC es una fase en la que puede aplicarse un control y que es esencial para evitar o
eliminar un peligro en la inocuidad de los alimentos o para reducirlo a un nivel aceptable.
Teniendo en consideracin la extrema precariedad higinica en que se elaboran la mayora de
104

los productos de panadera existiran muchos puntos crticos a identificar y pocos sern
calificados como PCC, ejemplo: El control de calidad del agua empleada en la dilucin de la
levadura, la temperatura y tiempo del horneado y el control de la humedad del pan envasado.

Paso G: Establecimiento de los Lmites Crticos de cada PCC
Tiene por objeto determinar el momento en que el PCC est fuera de control. Algunos
lmites crticos aplicables en panadera son: Temperatura para horneado a 150 C, nivel
mnimo de cloro residual del agua 0,5 ppm, temperatura de conservacin de levadura 5 C.

Paso H: Establecimiento de un Sistema de Vigilancia
El eje principal del Sistema de Vigilancia ser el equipo HACCP auxiliado por un
grupo, de vigilantes designados entre el personal de panadera. La labor de los vigilantes ser el
monitoreo permanente de las diversas actividades que se cumplen durante la elaboracin, para
detectar cualquier irregularidad, que constituya un riesgo en la seguridad del alimento y ser
informado de inmediato al equipo de HACCP. Se debern conocer los distintos PCC para cada
producto en cada uno de los rubros de venta. El personal deber ser capacitado para esta
funcin y preferentemente existir ms de un vigilante que se alternarn en turnos de labor. El
equipo HACCP elaborar y tendr a la mano los procedimientos de vigilancia.

Paso I: Establecimiento de Medidas Correctoras para las Posibles Desviaciones
El equipo HACCP de la panadera, asesorado por algn funcionario del AAINSA (lo
que ser solicitado al centro de salud de la localidad), deber establecer las medidas que se
adoptarn para lograr recuperar el control y que destino dar a aquellos productos o alimentos
que han sido obtenidos o expuestos a situaciones fuera de control.

Paso J: Establecimiento de procedimientos de verificacin
La verificacin se aplica para la comprobacin de la eficacia del Sistema HACCP, la
observancia permanente de las medidas de prevencin o seguridad para cada producto y el
cumplimiento de las medidas correctoras, principalmente.

Paso K: Establecimiento de un sistema de registro y documentacin
En las oficinas de administracin se llevar un registro de la documentacin generada por la
aplicacin del Sistema de HACCP. Toda intervencin de vigilancia, medida correctora,
capacitacin, decisin adoptada, deber constar en un documento que formar parte del registro
mencionado. Tambin se incluirn las copias de las actas de las reuniones peridicas y
extraordinarias del equipo de HACCP y la copia de los planes HACCP de cada producto
considerado y de sus modificaciones, los cuales estarn codificados para un mejor manejo.
105

1.3.1 Peligros biolgicos
Los peligros biolgicos son aquellos que no podemos ver. Son patgenos de
intoxicacin alimentaria que pueden causar severas y a veces mortales enfermedades en
humanos. La enfermedad es causada por el organismo (virus, bacterias, hongos, algas y
parsitos) que invade los tejidos del cuerpo o por la ingestin de toxinas producidas por los
organismos.

A. Bacterias
Existen miles de diferentes tipos de bacterias. Algunas son buenas tales
como las utilizadas para elaborar queso o cerveza, pero incluso las bacterias buenas pueden
volverse peligrosas cuando se encuentran en alimentos donde no deberan estar, o cuando hay
demasiadas. Entre las bacterias ms importantes transmitidas por alimentos que causan
enfermedades en humanos tenemos:

B. Virus
Existen ms de 150 virus los cuales, cuando provienen de alimentos,
tienen la posibilidad de causar intoxicacin alimentaria. Los virus solo pueden en un husped-
un animal, una planta o un ser humano. Los virus se transmiten a los seres humanos a travs de
la va oral-fecal. Esto a menudo puede producirse mediante los alimentos y el agua en los cuales
el virus puede sobrevivir durante largos periodos, pero no crecer. La mayora de los virus
causan enteritis viral invadiendo la mucosa intestinal. Estos virus pueden causar infecciones
cutneas, de ojos y respiratorias, as como meningitis, hepatitis y gastroenteritis
Organismo/fisiologa Campylobacterjejuni Salmonella
Enfermedad
Campylobacteriosis causada por
la ingestin del organismo vivo.
En la dcada de los 70, el
Campylobacter fue reconocido
como una causa significativa de
intoxicacin alimentaria
Diferentes especies causan diversas
enfermedades de las cuales la
salmonelosis constituye el problema
de salud pblica ms importante.
Periodo de incubacin 2 a 7 das. 8 a72 horas.
Sntomas
Diarrea aguda (puede ser
sangrante), dolor abdominal,
nauseas y fiebre.
Dolor abdominal, diarrea acuosa,
nauseas, vmitos, leve fiebre y dolor
de cabeza.
Duracin 1 da a algunas semanas. 2 a 5 das.
Dosis infecciosa 500 a 600 clulas
Vara con la cepa, tipo de alimento,
edad y estado de salud del paciente. Se
ha informado que es tan baja como 10
clulas. Sin embargo, la dosis
infecciosa es generalmente tan alta
como 10
5
clulas.
Mortalidad Rara vez se producen muertes.
No provoca la muerte en adultos
saludables. La mortalidad es
significativa en los grupos susceptibles
106

de la poblacin. La mortalidad total es
0,1 % de los casos informados en el
Reino Unido.
Crecimiento
32 C a 45 C (optimo 42 C).
Aerobio.
8 C a 50 C la temperatura ptima es
35 C a 37 C. Anaerobio facultativo.
Fuentes en la
naturaleza
Se encuentra en el tracto
intestinal de animales salvajes y
domsticos, que no muestran
signos de la enfermedad.
Personas que no presentan
sntomas, tambin pueden ser
portadores.
Se encuentran en el tracto intestinal de
la mayora de animales domsticos y
salvajes. La mayora de los animales
con salmonella no muestran signos de
la enfermedad. Los huevos pueden
contaminarse durante y despus de ser
puestos debido al contacto con heces.
La Salmonella puede sobrevivir en el
suelo por varios meses.
Fuentes alimenticias
Huesos de res o aves pueden ser
contaminados durante el
procesamiento. Las verduras
pueden ser contaminadas por el
abono de animales utilizado en el
cultivo. Pueden estar presentes
en leche pasteurizada
inadecuadamente como resultado
de contaminacin fecal o de
mastitis debida a Campylobacter.
Carne y aves, productos lcteos,
huevos y productos a base de huevos,
verduras y ensaladas, pescado y
mariscos.

Organismo/fisiologa Listeria monocytogenes Escherichia coli
Enfermedad Listeriosis
Colitis hemorrgica y
sndrome urmico hemoltico
Periodo de incubacin
1 a 90 das. El promedio es
30 das.
3 a 4 das.
Sntomas
Diarrea, orina descolorida,
vmitos, dolor de cabeza,
dolor de espaldas, fiebre,
convulsiones( sntomas
semejantes a la gripe)
Diarrea (con sangre), dolor
abdominal, anemia,
insuficiencia renal,
hemorragias internas debido a
la falta de plaquetas pueden
conducir a daos cerebrales.
Pueden involucrar al sistema
nervioso central teniendo
como resultado crisis
convulsivas y coma.
Duracin Variable. 2 a 9 das.
Dosis infecciosa
Se requiere mayor
investigacin. Vara mucho
entre las personas.
Aproximadamente 10
3

clulas.
Baja como lo evidencia la
capacidad para transmitirse
de una persona a otra.
Posiblemente 10 a 100
clulas.
Mortalidad
Alta tasa de mortalidad de
30%. Puede provocar abortos
espontneos
5% a 10%
Crecimiento
1 C a 45 C. Anaerobio
facultativo.
8 C a 46 C.
107

Fuentes en la naturaleza
Extendido en el medio
ambiente encontrndosele en
el suelo, agua salada y dulce,
vegetacin en
descomposicin, aguas
servidas, animales salvajes
domesticados y pjaros.
El tracto intestinal de
rumiantes, especialmente
ganado vacuno y ovejas. E.
coli forma parte de la
microflora natural del
intestino.
Verduras, frutas, productos
lcteos carnes rojas, carnes de
aves, arroz frito. Listeria
puede transmitirse a los seres
humanos a travs de muchas
formas y no tan solo a travs
de alimentos
Carne, productos lcteos,
verduras.

Nota: el grupo mas importante de E. coli que causa intoxicacin alimentaria son las cepas
enterohemorragicas.

Organismo/fisiologa Yersinia enterocolitica Bacilluscereus
Enfermedad
Yersiniosis cuando es
causada por la ingestin de
bacterias vivas. Y.
enterocolitica tambin
produce una enterotoxina
termoestable.
Produce dos tipos diferentes
de gastroenteritis, el tipo
diarreico y hemetico. Es la
toxina producida por esta
bacteria la que causa
enfermedades transmitidas
por alimento.
Periodo de incubacin 24 h a 11 das.
Tipo diarreico: 8 a 16 h. Tipo
hemetico: 1 a 5 h.
Sntomas
Diarrea, nauseas, vmitos,
dolor de cabeza, fiebre. El
fuerte dolor abdominal puede
asemejarse a la apendicitis.
Tipo diarreico: intensa diarrea
acuosa y dolor abdominal,
ocasionalmente nauseas y
vmitos. Tipo hemetico:
nauseas y vmitos,
ocasionalmente diarrea.
Duracin
Generalmente 5 a14 das.
Puede durar varios meses.
Tipo diarreico: 12 a 24 horas.
Tipo hemetico: 6 a 24 horas.
Dosis infecciosa Desconocida.
Se requiere una gran cantidad
de clulas. Tipo diarreico:
5x10
5
por gramo.
Tipo hemetico: 1x10
3
gramo.
Mortalidad
Baja. Lo mas probable es que
los nios mueran a causa de
esta
Se ha registrado muy pocas
muertes.
108

Crecimiento 0 C a 20 C.
6 C a 50 C. la temperatura
se optima para la mayora de
cepas es 30 C a 37 C. la
toxina es susceptible al calor,
quedando inactivas a 50 C
durante 5 minutos.
Fuentes en la naturaleza
Boca y tracto intestinal de
animales salvajes y
domesticos, mariscos y
moluscos.
Se producen en el suelo.
Fuentes alimenticias Carne y leche.
Alimentos crudos de origen
vegetal, especialmente
productos de cereales,
especias y leche.

Organismo/fisiologa Staphylococcus aureus Clostridiumbotulinum
Enfermedad
Esta bacteria produce una
toxina durante el crecimiento.
Es la ingestin de esta toxina,
no el mismo microorganismo
la que causa la enfermedad.
Botulismo. Causado por la ingestin de
una neurotoxina secretada por C.
botulinum durante el crecimiento. El
botulismo en los nios es causado por
la ingestin de las esporas de C.
botulinum y su produccin de toxina
en los intestinos. Esto se produce antes
del establecimiento completo de la
microflora natural.
Periodo de
incubacin
30 minutos a 6 horas. 2 horas a 8 das.
Sntomas
Nauseas, vmitos, diarrea,
dolor abdominal. Rara vez se
produce fiebre.
Puede producirse nauseas y vmitos;
sin embargo, los sntomas son
principalmente neurolgicos. Visin
borrosa o doble, problemas al tragar,
boca seca, dificultades al hablar,
parlisis de miembros y respiratorio
Duracin 1 a 3 dias. 1 a 10 das, ocasionalmente mas.
Dosis infecciosa
Aproximadamente 1 ng por
gramo de alimento (10
-9
/g)
Una de las sustancias ms toxicas
conocidas por el hombre. La dosis letal
calculada para los seres humanos es de
1 ng/Kg. del peso corporal

Mortalidad
Se han informado muertes en
nios y ancianos.
60 % es la tasa de mortalidad ms alta.
La tasa de mortalidad ha sido mas baja
en los ltimos brotes debido a una
deteccin temprana y a la
administracin de una antitoxina.
109

Crecimiento
6 C a 46 C. Temperatura
optima 30 C a 37 C.
Anaerobio facultativo que
crece mejor en presencia de
oxigeno.
3 C a 50 C. Anaerobio. La toxina es
sensible al calor. Una temperatura
interna de 78 C durante 1 minuto es
una directiva general para la coccin
de alimentos de fcil preparacin.
Fuentes en la
naturaleza
Se estima que le 30% a 50%
de la poblacin porta S.
aureus en la nariz y la
garganta. Tambin esta
presente en forma natural en
la piel. Los animales y aves
tambin portan S. aureus en
diferentes partes de su
cuerpo.
Suelo, agua dulce y sedimentos
marinos, res o aves muertas en
descomposicin, mariscos, intestinos
de animales de carne y pescado.
Carne y aves crudas,
productos lcteos y
ensaladas.
Carne, verduras, mariscos, conservas.

.
Los virus no son eliminados mediante el tratamiento de aguas servidas y,
de este modo, son descargados de las plantas de tratamiento de tratamiento de aguas servidas al
ambiente circundante. Una vez en el ambiente, son protegidos al asociarse con materiales
fecales que sobreviven en el agua, lodo, suelo, mariscos y en la vegetacin que ha sido regada
con el efluente reciclado. Afortunadamente, la mayora de virus son eliminados fcilmente con
calor. En los brotes producidos por los alimentos, los virus han provenido de manipuladores de
alimentos o agua contaminada por aguas servidas. Por lo tanto, es importante que solo se utilice
agua potable en la industria alimentaria y que el personal mantenga altos niveles de higiene.
Los mariscos constituyen una fuente comn de enfermedades virales
transmitidas por alimentos, puesto que a menudo son afectados por la descarga de aguas
servidas y acumulan virus. Los virus presentan una baja dosis infecciosa, sobreviven bien en el
ambiente y se correlacionan mal con los organismos indicadores. A pesar de esto, son difciles
de detectar de manera rutinaria. Recientemente, se han desarrollado tcnicas de amplificacin
de cidos nucleicos con el fin de detectar los virus entricos; sin embargo, tienden a ser
utilizados en investigaciones de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos antes que en
pruebas proactivas de rutina.

Virus transmitidos por alimentos que causan enfermedades
Los virus han estado implicados en los brotes de enfermedades transmitidas por
alimentos o agua. De hecho, las cifras de EEUU. Y el reino unido muestran que los virus son
responsables. Del 5 al 10% de las enfermedades transmitidas por alimentos. La Hepatites A y
Rotavirus conforman la causa mas comn de enfermedades virales transmitidas por alimentos.
Hepatitis A
110

Enfermedad Hepatitis A
Periodo de incubacin.
Promedio de 28 a 30 das. Puede prolongarse
hasta 42 das.
Sntomas.
Los sntomas comienzan en forma abrupta con
malestar, nauseas, ictericia, anorexia y
vmitos.
Duracin. 2 das a varias semanas.
Mortalidad.
Baja, excepto en mujeres embarazadas en las
cuales la tasa de mortalidad es de 17%.
Transmisin.
Se transmite por la va oral fecal. El meto de
transmisin mas comn es el contacto directo
entre una persona y otra. Tambin puede
transmitirse mediante agua y alimentos
contaminados.
Fuentes alimenticias.
Regularmente, los mariscos han estado
involucrados en brotes de Hepatitis A
Rotavirus
Enfermedad Rotavirus.
Periodo de incubacin. Corto plazo.
Sntomas.
Diarrea, vomitos, fiebre. Pueden daar las
clulas en el intestino delgado produciendo
una mala absorcin.
Duracin. 4 a 6 dias.
Mortalidad. Alta en pases subdesarrollados.
Transmisin.
El meto mas comn de transmisison es el
contacto directo entre una persona y otra.
Tambin puede transmitirse a traves de agua y
alimentos contaminados.
Fuentes alimenticias.
Puede sobrevivir a 4 C durante semanas.
Queda inactiva a 56 C durante 30 minutos.

C. Hongos
Los hongos a menudo son denominados mohos; los hongos pueden ser
beneficiosos en la produccin de alimentos. Por ejemplo se utilizan hongos para elaborar queso,
tales como Blue Vein y Camebert. Algunos hongos tambin se utilizan para elaborar
antibiticos tales como la penicilina. Varias especies de hongos son capaces de producir
metabolitosque son toxicos para los seres humanos y animales domesticos. Estos metabolitos
son llamaodosmicotoxinas.
Las micotoxinas han sido responsables de algunos casos importantes de
enfermedades transmitidas por alimentos a lo largo de la historia. Las micotoxinas pueden ser
consumidas directamente al comer grano contaminado (por ejemplo, cornezuelo en cultivos de
cereales), o indirectamente al comer productos elaborados a partir de animales que han
consumido micotoxinas. Durante el ultimo milenio el cornezuelo ha matado a cientos de miles
de personas. El comportamiento de aquellas personas que eran perseguidas porque se pensaba
que eran brujas en salem, estados unidos durante el siglo XVIII, ha sido atribuido al consumo de
cornezuelo. La aleuquia toxica alimentaria, causada por el hongo fusarium del grano, provoco la
111

muerte de mas de 1000,000 rusos entre 1942 y194. En 1960, las aflatoxinas , causadas por el
hongo aspergillus de las nueces, cereales y cultivos de semillas oleoginosas, se convirtieron en
el centro de atencin cuando mataron a 100,000 turcos en el reino unido.

Hongos Transmitidos por Alimentos que Causan Enfermedades Aspergillus
El gnero Aspergillus contiene al menos 100 especies. Estn ampliamente distribuidas
en el medio ambiente, principalmente en suelos y vegetacin en descomposicin, tambin en
nueces y cereales. Las especies ms importantes de Aspegillus son A. flavus y A. parasticas. Es
el qumico (aflatoxina) producido por Aspergillus el que causa la enfermedad:

Enfermedad: Aflatoxicosis
Sntomas
Causa daos hepticos agudos, cirrosis. Suprime el sistema
inmunitario y causa cncer al hgado.
Lmite legal en los
alimentos
Remitirse a regulaciones locales sobre alimentos para lmites
legales de Alflatoxina B1 & B6.
Mortalidad: 10 C a 43 C. temperatura ptima 32 C a 33Ca
w
0.99
Fuentes en la
naturaleza:
Nueces, man, semillas oleaginosas y cereales.

Fusarium
Las especies de Fusarium atacan los cultivos de cereales (especialmente trigo), legumbres, caf
y pastos. Las especies de Fusarium producen una amplia variedad de micooxinas, de las cuales
la ms importante son los tricotecenos.
Enfermedad: Aleuquia txica alimentaria
Sntomas
Vmitos, diarrea, anorexia e inflamacin del tracto gastrointestinal. Los
efectos menos inmediatos son la muerte del tejido de piel, sangrando de
msculos y la degeneracin e clulas nerviosas.
Lmite legal en
los alimentos
Remitirse a regulaciones locales sobre alimentos.
Crecimiento: La muerte puede producirse por la aplicacin tpica, no slo la ingestin.
Fuentes en
la naturaleza:
Amplia variedad de cultivos.

D. Parsitos
Protozoos que Causan Enfermedades Transmitidas por Alimento.
Aproximadamente 20 especies de protozoos patgenos pueden sertransmitidos a seres
humanos a travs del agua o alimentoscontaminados. La infeccin mediante protozoos
es ms comn enpases tropicales que en los templados. Dos de los tipos ms importantes de
protozoos son Giardialamblia y Crytosporidium.
Giardialamblia
112

Enfermedad: Gardiasis
Aparicin de
enfermedad:
1 a 3 semanas despus de la ingestin.
Sntomas
Diarrea crnica, flatulencia, dolor abdominal y a veces anorexia,
nusea y vmitos.
Duracin 1 a 30 semanas.
Dosis infecciosa: Se considera que es baja.
Mortalidad: Muy baja.
Crecimiento:
Produce quistes resistentes que pueden sobrevivir por
largos perodos en agua y suelo.
Fuentes en la
naturaleza:
El tracto intestinal de seres humano s infectados. Generalmente, las
personas pueden ser infectadas con Giardialambliay no
presentar sntomas.
Fuentes alimenticias: Cualquier alimento contaminado con desechos fecales.
Cryptosporidiumsp
Enfermedad: Cryptosporidiosis
Sntomas:
Intensa diarrea acuosa, leve dolor abdominal, nusea,
deshidratacin y prdida de peso.
Duracin 10 a 15 das.
Dosis infecciosa: Se considera que es baja.
Mortalidad: Muy baja.
Crecimiento:
Produce quistes resistentes que pueden sobrevivir por
largos perodos en agua y suelo.
Fuentes en la
naturaleza:
Heces de ganado vacuno, ovejas, cerdos, perros, gatos y seres
humanos infectados.
Fuentes alimenticias: Cualquier alimento contaminado con desechos fecales.

E. Algas
Tres tipos de algas: dinoflageladas, algas verdes azuladas y algas pardas
doradas pueden envenenar nuestro suministro de alimentos. En las condiciones ambientales
adecuadas, pocas clulas de algas pueden multiplicarse, y convertirse en florecimientos
abundantes que cambian el color del agua de ro o mar (por ejemplo: mareas rojas causadas por
algunas especies de Goyaulax o Gymnodinium). Estos florecimientos de algas constituyen un
fenmeno natural que se ha producido a lo largo de la historia. Sin embargo, desde, la dcada de
los 60, estos florecimientos han aumentado con respecto a su frecuencia, intensidad y
distribucin geogrfica.

Algas que causan Enfermedades Transmitidas por Alimentos
Algunas especies de algas producen toxinas. Cuando los seres humanos comen mariscos
que se han alimentado de dichas algas, pueden sufrir enfermedades y hasta morir.
Lamentablemente, los mariscos venenosos no se ven ni saben diferente a los normales y la
coccin no destruye las toxinas.
Venenos Paralticos de Mariscos (VPM)
Venenos Diarreicos de Mariscos (VDM)
113

Venenos Amnsicos de Mariscos (VAM)
Venenos Neuroxicos de Mariscos(VNM)
Toxinas cianobacteriales
Ciguatera

Venenos Paralticos de Mariscos
Las toxinas paralticas de los mariscos afectan al sistema nervioso, provocando
hormigueo y entumecimiento de las extremidades, evolucionando a una descoordinacin
muscular, problemas respiratorios y parlisis muscular. En casos extremos, se produce muerte
por asfixia.

Venenos Diarreicos de Mariscos
Este veneno provoca fuertes vmitos, nusea y diarrea. Los afectados generalmente se
recuperan en el lapso de tres das y no se han registrado muertes. Los mariscos que se alimentan
de estas algas, pueden resultar txicos aunque el nmero de algas sea bajo.

SECUENCIA DE PASOS PARA LA APLICACIN DEL HACCP EN PRODUCCTOS
DE PANADERA.

PASO A: Conformacin del Equipo de HACCP
Este grupo ser responsable de la conduccin del plan HACCP, elaborado e
implementado, para cada producto o grupo de productos elaborados en la
panadera.
Una persona infaltable en el equipo es el administrador de la panadera quien lidera el equipo y
estar integrado adems por el resto de trabajadores hasta un mximo de cinco personas.
Propuesta del Organigrama de la Empresa

Descripcin de responsabilidades
c. Administrador
114

Coordina la ejecucin del Plan con los dems miembros el equipo y lleva, los registros
derivados de la aplicacin del sistema.
d. Maestro panadero y ayudantes
Actan como vigilantes y aplican las medidas de seguridad y/o prevencin para mantener
los PCC bajo control en cada uno de los productos elaborados, en consulta con el administrador.
El equipo en su totalidad debe haber recibido capacitacin en HACCP y dispondr de
manuales o guas para el desarrollo de sus actividades.

PASO B: Descripcin del Producto y uso Esperado
Va a ser necesario elaborar una descripcin y uso esperado para cada producto, de los que
elabora la panadera.

EJEMPLO DE DESCRIPCIN DEL PRODUCTO Y USO ESPERADO
NOMBRE : PAN FRANCS
Composicin: Harina de Trigo, agua, azcar, sal y leudantes.
Por quienes ser consumido; Por la poblacin en general.
Proceso: Se mezclan la harina, agua, azcar, sal y sustancias leudantes, se amasa, se soba, se
fracciona y moldea (boleado); se fermenta, se hornea, reposa y luego se distribuye.
Tipo de Empaque: Se expende a granel y en bolsa de polietileno de primer uso.
Vida til: 24 horas.
Condiciones de venta/distribucin: Mantener bajo sombra y protegido del polvo y del sol.
Etiquetado e instrucciones:

PASO C: Elaboracin de Diagrama de Flujo
115

PASO D: Verificacin in situ del Diagramo de Flujo
Acompaar el proceso de elaboracin en la panadera para confirmar si el
Diagrama de flujo se ajusta a la realidad.

PASO E: Enumeracin de todos los Riesgos Posibles.
Ejecucin de un anlisis de peligros, de los riesgos para su ocurrencia y determinacin de las
medidas preventivas.
Respecto a la elaboracin de productos de panadera los principales peligros que podernos
sealar son los siguientes:
Peligros Biolgicos
La presencia del Bacillos cereus y B. licheniforme en la harina, microbios que tienen la
capacidad de esporularse, es decir rodearse de una cpsula protectora, capaz de resistir la
temperatura del horneado del pan, pudiendo ms tarde reproducirse cuando la temperatura
desciende en el producto, este microbio en condiciones favorables puede desarrollarse y
producir dos tipos de toxinas que pueden provocar vmitos y diarrea en el consumidor. Estas
bacterias se encuentran en el suelo, en donde contaminan a los cereales; sus esporas son termo
resistente. Para evitar su germinacin y crecimiento es esencial un control estricto de la
temperatura y humedad durante el enfriado y almacenamiento.
Los hongos y levaduras tambin pueden significar un peligro cuando se trata de especies
generadoras de toxinas (aflatoxinas), la presencia de estos patgenos ocurre casi siempre por
"contaminacin cruzada", al entrar en contacto el producto terminado con ambientes, superficies
o envases contaminados.
116

El consumo de alimentos con aflatoxinas produce cncer a largo plazo. Las aflatoxinas
contaminan normalmente los granos (trigo, maz, etc.) durante la cosecha y almacenamiento,
especialmente en condiciones de humedad.

Peligros Qumicos
La contaminacin qumica puede ocurrir durante el transporte y almacenamiento de la
harina con sustancias qumicas como insecticidas, combustibles o detergentes. Existen casos
reportados de intoxicacin porconsumo de pan elaborado con harinas contaminadas con
sustancias qumicas liquidas durante el transporte.
Los residuos de plaguicidas en las cosechas por aplicacin en exceso o a destiempo para evitar
el ataque de las plagas, durante la produccin y almacenamiento del grano, resulta otro peligro
qumico importante para la seguridad del pan.
Otro peligro qumico resulta ser el uso excesivo de aditivos alimentarios, o el uso de aditivos no
permitidos, en el caso de la elaboracin del pan se viene observando el uso del Bromato de
Potasio como aditivo blanqueador y leudante de las masas que resulta peligroso por haberse
comprobado que es riesgoso para la salud del consumidor.

Peligros Fsicos
Entre los peligros fsicos identificados en la elaboracin de productos de panadera estn:
astillas, trozos de madera, en lugares donde an se viene utilizando este material (bateas,
andamios, etc.); trozos de algodn (pabilo) procedentes de los envases (costal i I los);
excremento de roedores, insectos (cucarachas, moscas, larvas de polillas, etc.). Las medidas
preventivas en estos casos estn cubiertas por las Buenas Prcticas de Higiene (BPH) y el
Programa de Limpieza, Desinfeccin y Control de Vectores.
Paso F: Determinacin de los PCC
PCC es una fase en la que puede aplicarse un control y que es esencial para evitar o eliminar un
peligro para la inocuidad de los alimentos o para reducirlo a un nivel aceptable. Teniendo en
consideracin la extrema precariedad higinica en que se desenvuelve la mayor parte de la
elaboracin de los productos de panadera habran muchos puntos crticos a identificar y pocos
sern calificados como PCC.
A continuacin se mencionan algunos PCC comunes a muchas panaderas:
El control de calidad del agua empleada en la dilucin de la levadura.
La temperatura y tiempo del horneado.
El control de la humedad del pan envasado.

Paso G: Establecimiento de los Lmites Crticos de cada PCC
117

Tienen por objeto determinar el momento en que el PCC est fuera de control. Algunos lmites
crticos que son aplicables a nivel de productos de panadera:
Temperatura para horneado a 150 C.
Nivel mnimo de cloro residual del agua 0.5 ppm.
Temperatura de conservacin de levadura 5 C.

Paso H: Establecimiento de un Sistema de Vigilancia
El eje principal del Sistema de Vigilancia ser el equipo HACCP auxiliado por un grupo, de
vigilantes designados entre el personal de panadera. La labor de los vigilantes ser el monitoreo
permanente de las diversas actividades que se cumplen durante la elaboracin, a fin de detectar
cualquier irregularidad, que ponga en riesgo la seguridad del alimento, que ser informado de
inmediato al equipo de HACCP. Se debern conocer los distintos PCC para cada producto en
cada uno de los rubros de venta, este personal deber ser capacitado para esta funcin y
preferentemente debera haber ms de un vigilante que se alternarn en horas o turnos de labor.
El equipo HACCP elaborar y tendr a la mano los procedimientos de vigilancia.

Paso I: Establecimiento de Medidas Correctoras para las Posibles Desviaciones
El equipo HACCP de la panadera, asesorado por algn funcionario del AAINSA (lo que ser
solicitado al centro de salud de la localidad), deber establecer las medidas que se adoptarn
para lograr recuperar el control y que destino dar a aquellos productos o alimentos que han sido
obtenidos o expuestos a situaciones fuera de control.

Paso J: Establecimiento de Procedimientos de Verificacin
La verificacin se aplica para la comprobacin de la eficacia del Sistema HACCP y a la
observancia permanente de las medidas de prevencin o seguridad para cada producto y el
cumplimiento de las medidas correctoras, principalmente.

Paso K: Establecimiento de un Sistema de Registro y Documentacin.
En las oficinas de administracin de la panadera se llevar por un registro de toda la
documentacin generada por la aplicacin del Sistema de HACCP; todo acto; intervencin de
vigilancia, medida correctora, capacitacin, decisin adoptada, etc; deber constar en un
documento que formar parte del Registro mencionado. Tambin se incluir en el Registro las
copias de las actas de las reuniones peridicas y extraordinarias del equipo de HACCP y por
supuesto la copia de los planes HACCP de cada producto considerado y de sus modificaciones,
los cuales estarn codificados para un mejor manejo.

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS DE
MICROBIOLOGA GENERAL

Dra. Carmen Rosa Carreo Farfn
Lic. Csar Wilber Guzmn Moreno
Dr. Gilmar Vladimir Mendoza Carreo

Lambayeque Per
2010

UNIVERSIDAD
NACIONAL PEDRO RUIZ
GALLO

CONTENIDO

1. Bioseguridad
2. Material y equipo de laboratorio
3. Observacin de bacterias
4. Medios de cultivo
5. Siembra y aislamiento de bacterias
6. Identificacin de bacterias
7. Microorganismos Indicadores
8. Reconocimiento de Hongos: mohos y levaduras
9. Aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus
10. Reconocimiento de algunas bacterias patgenas transmitidas por alimentos
11. Aislamiento, identificacin y mantenimiento de Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides productor de dextrano
12. Aislamiento, identificacin y mantenimiento de bacterias acticas:
Acetobacter y Gluconobacter
13. Aislamiento, identificacin y mantenimiento de Aspergillus niger
productor de cido ctrico
14. Aislamiento, identificacin y mantenimiento de una cepa enolgica de
Saccharomyces cerevisiae
15. Sistema HACCP y su aplicacin en la industria alimentaria

Manual de Prácticas Microbiologia General 2010 - I

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