METABOLISMO Y CRECIMIENTO

BACTERIANO
Adalucy Alvarez Aldana. BSc, MSc, PhD(c)
Facultad de Ciencias de la Salud
Programa de Medicina
Departamento de Ciencias Bsicas
MICROBIOLOGA





CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento de una poblacin bacteriana se define
por el aumento de la masa bacteriana o del nmero
de individuos.

Durante la divisin celular una clula se convierte en
dos. Durante el tiempo que esto toma (tiempo de
generacin) se duplica tanto el numero de clulas
como la masa (Biomasa).
TIEMPO DE GENERACIN
Mnimo Promedio Hasta
20 Minutos 0,5 A 6 horas 1 da





CRECIMIENTO BACTERIANO
CRECIMIENTO EXPONENCIAL: Cuando el nmero de
clulas se duplica durante un intervalo de tiempo
constante.

Tiempo de generacin (g) es el tiempo de duplicacin del
nmero de clulas, es igual a t/n (t es la duracin del
crecimiento exponencial). Por lo tanto conociendo el nmero
de bacterias inicial y final en un crecimiento exponencial, es
posible calcular el nmero de generaciones (n) de acuerdo a la
siguiente frmula:


No = nmero de clulas en la poblacin inicial
N = nmero final de clulas en un tiempo t
n = nmero de generaciones en un tiempo t

El aumento de la poblacin resultante es exponencial o
logartmica, por lo que la formula se puede expresar con base
logartmica y despejar n:



CRECIMIENTO BACTERIANO
La tasa de crecimiento durante la fase exponencial, puede
expresarse en trminos de una constante de tasa de
crecimiento por unidad de tiempo, generalmente en una hora:



Si N es la duplicacin de No: La poblacin se duplica: t=g

Reemplazando en la ecuacin:


CRECIMIENTO BACTERIANO
Ejercicio: N= 10
9
, No=10
3
, t = 10 horas, calcular el tiempo de generacin (g).
Utilice las dos frmulas, verifique los resultados en la siguiente diapositiva:












CRECIMIENTO BACTERIANO
log 10
9
= 9
log 10
3
= 3

Ejercicio: N= 10
9
, No=10
3
, t = 10 horas, calcular el tiempo de generacin (g).
Utilice las dos frmulas:












CRECIMIENTO BACTERIANO
log 10
9
= 9
log 10
3
= 3

Fases de la curva de crecimiento:
Acabamos de ver la fase exponencial, pero en un
cultivo por lotes (batch culture) esta fase no es
indefinida. En un cultivo por lotes hay fases en el
crecimiento.
CRECIMIENTO BACTERIANO
Fases de la curva de crecimiento:
1.- Fase de latencia: Es el tiempo necesario para la
adaptacin de las bacterias al nuevo medio de cultivo.
Ajuste metablico.
Duracin: tamao del inculo, estado metablico previo,
medio del que procede el inculo.

CRECIMIENTO BACTERIANO
2.- Fase exponencial o logartmica:
Es el resultado de que cada bacteria se divida para formar
dos, N= 2N0 y as sucesivamente.
La velocidad de crecimiento es constante (las bacterias se
dividen y duplican en nmero a intervalos regulares).
La actividad metablica es mxima hasta que los nutrientes
se agoten, los productos txicos se acumulen y las clulas
mismas se obstaculicen.

CRECIMIENTO BACTERIANO
3.- Fase estacionaria: El crecimiento de la poblacin cesa y
la curva se vuelve horizontal, hay crecimiento
desequilibrado y los componentes se sintetizan a diferentes
tasas, el nmero de bacterias que se reproducen equivale a
las que mueren. No hay aumento ni descenso neto en el
nmero de clulas.

CRECIMIENTO BACTERIANO
4.- Fase de muerte: las bacterias se reproducen ms
lentamente por carencia de nutrientes y productos
txicos, aqu aumenta la tasa de muerte. La fase de
muerte tambin es exponencial pero mucho ms lenta
que la de crecimiento exponencial.

CRECIMIENTO BACTERIANO
Las fases ocurren en un SISTEMA CERRADO
(discontinuo/por lotes) de cultivo, en donde no se aade
ms medio de cultivo fresco y el volumen es fijo. Los
sistemas abiertos son tiles para evaluar por ejemplo
condiciones como las sntesis de una enzima o produccin a
escala industrial.
CRECIMIENTO BACTERIANO
MEDIOS DE CULTIVO: Son soluciones nutritivas utilizadas
para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio.
Las clases son medios definidos y medios complejos.
CRECIMIENTO BACTERIANO
MEDIOS DEFINIDOS: Adiccin de
cantidades exactas de compuestos
orgnicos e inorgnicos altamente
purificados. El ms importante es la
fuente de carbono pues las clulas
necesitan grandes cantidades de (C)
para la biosntesis.

CRECIMIENTO BACTERIANO
MEDIOS COMPUESTOS: Para el
cultivo de la mayora de los
microorganismos, no es necesario
el conocimiento de la composicin
exacta del medio. Los medios
compuestos son suficientes.
Los medios compuestos utilizan
sustancias de origen microbiano,
vegetal o animal. Ej: casena
(protena leche), carne (extracto de
carne), soya (extracto de soya),
levaduras (extracto de levadura)
entre otros.


CRECIMIENTO BACTERIANO
MEDIOS COMPUESTOS: Pueden ser
enriquecidos para microorganismos
exigentes en el crecimiento;
selectivos que inhiben el crecimiento
de algunos y permiten el crecimiento
de otros; diferenciales un indicador
permite observar los diferentes
crecimientos, generalmente se basan
en alguna caracterstica bioqumica
de los diferentes microorganismos.


CRECIMIENTO BACTERIANO
CULTIVO EN EL LABORATORIO: Una
vez el medio de cultivo ha sido
preparado y esterilizado puede
utilizarse para inocularlo con un
microorganismo.
En el laboratorio la inoculacin
generalmente es con un nico tipo de
microorganismo, denominado cultivo
puro.

LIQUIDO O SOLIDO


CRECIMIENTO BACTERIANO

La inoculacin requiere tcnicas aspticas, para evitar
contaminacin ambiental, que se puede visualizar por
fuera de la lnea de siembra y con caractersticas
macroscpicas diferentes.

CULTIVO CONTINUO O ABIERTO: los cultivos se mantienen en un
volumen constante durante largos perodos de tiempo, al que se
le adiciona continuamente medio fresco y se retira
continuamente medio usado, generando un crecimiento de las
clulas a una velocidad constante estado de equilibrio.
CRECIMIENTO BACTERIANO
QUIMIOSTATO o
TERMOSTATO
MEDIDAS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO: El crecimiento es
medido por cambios en el nmero de clulas o de algn
componente celular, como protenas, cidos nucleicos o peso
seco. En conclusin, el incremento de una poblacin microbiana
se puede medir estimando el incremento de masa celular o el
aumento en el nmero de clulas .

En ambos casos se pueden emplear mtodos directos o
indirectos.


CRECIMIENTO BACTERIANO
METODOS DE MEDIDA DE LA MASA:
Determinacin del peso seco (directo)

METODOS DE MEDIDA DEL NMERO DE CLULAS:
Mtodos turbidimetricos (indirectos)
Recuento en cmara (conteo de clulas totales vivas y muertas).
Recuento en placa, diluciones seriadas (conteo de clulas
viables).
Recuento en placa sobre filtros de membrana (conteo de clulas
vivas).




CRECIMIENTO BACTERIANO
DETERMINACIN DEL PESO SECO:
Se recogen las clulas del cultivo por centrifugacin de un
volumen determinado, se lavan, se secan y se pesan. 1 mg de
peso seco contiene entre 5X10
9
y 10X10
9
.
Es un mtodo laborioso y poco sensible, es muy utilizado en
hongos.

METODO TURBIDIMETRICO




CRECIMIENTO BACTERIANO
Es un mtodo muy fcil de usar y
se basa en la propiedad de las
clulas de dispersar la luz, es por
esto que una suspensin de
clulas al ojo se ve turbia. A
mayor nmero de clulas, mayor
luz es dispersada y aumenta la
turbidez de la suspensin.

TURBIDEZ: Para medir la turbidez se utiliza un
espectrofotmetro, un instrumento que pasa luz a travs de una
suspensin y detecta la luz que no es dispersada. El
espectrofotmetro emplea un prisma para generar haces de luz
de diferentes longitudes de onda. La longitudes de onda para
medir bacterias son 480nm (AZUL), 540nm (verde), 600 (naranja)
y 660 (rojo). La unidad de turbidez es llamada densidad ptica
(D.O)
CRECIMIENTO BACTERIANO
METODO TURBIDIMETRICO
Inconvenientes con esta medida: M.O puede no crecer en medio
lquido, si crecen pueden formar grumos originando medidas
incorrectas .

La turbidez se puede medir por comparacin con escalas
prefabricadas: Escala de Mac Farland




CRECIMIENTO BACTERIANO
CRECIMIENTO BACTERIANO
Escala de McFarland: serie de patrones de turbidez
formado por BaCl
2
al 1% adicionado con cantidades
crecientes de H
2
SO
4
al 1%.


RECUENTO EN CAMARA: La cmara de recuento es como un
portaobjeto pero con modificaciones, como ser excavado y
marcado con unas rejillas de pequeos cuadros de rea
conocida. Permiten contar el nmero de clulas por unidad de
volumen de suspensin bacteriana. La cmara se cubre con un
portaobjeto y por capilaridad se introduce la muestra. El
nombre de la cmara es Petroff-Hausser.
CRECIMIENTO BACTERIANO

RECUENTO EN CAMARA: El conteo microscpico es fcil y
rpido. Con algunas limitaciones: No se diferencian las vivas de
las muertas, los detritos pueden dar falsos recuentos, algunas
bacterias son difciles de ver y requieren microscopio de
contraste de fases.
CRECIMIENTO BACTERIANO

RECUENTO EN PLACA: Es un mtodo de recuento de clulas
viables (clula viable es aquella capaz de dividirse y originar
descendencia). Por lo tanto se cuentan las clulas de una
muestra, capaces de formar colonias cuando se inoculan en un
medio de cultivo solido adecuado.

Hay dos modalidades de siembra :
1. En superficie (siembra por extensin): Un volumen definido
de la muestra se coloca sobre la superficie de la placa que
contiene el medio y se extiende con un asa de extensin.
CRECIMIENTO BACTERIANO
CRECIMIENTO BACTERIANO

2. En profundidad (siembra por vertido en placa): La muestra se
mezcla con el medio de cultivo esteril y se vierte en la placa
estril. Permite inocular volmenes mayores de muestra.
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
SIEMBRA EN SUPERFICIE
En la mayora de los casos antes de realizar la siembra las
muestras deben diluirse (diluciones seriadas).
CRECIMIENTO BACTERIANO

RECUENTO EN PLACA: Una vez inoculadas las placas se incuban a
la temperatura adecuada y se cuentan las colonias.

Una clula origina una colonia, que se le denomina UFC, en lugar
de clulas. El resultado se expresa como UFC/mL.


CRECIMIENTO BACTERIANO
CRECIMIENTO BACTERIANO
RECUENTO EN PLACA: Cuando se requiere concentrar
bacterias en muestras muy diluidas se utiliza el Recuento
en filtro de membrana, que consiste en utilizar filtros de
nitrocelulosa, con poros de dimetro de 0.45um. El filtro
retiene los microorganismos y a continuacin se coloca
sobre una placa de cultivo y tras incubar aparecen UFC
sobre el filtro.
Citometro de flujo: Es un mtodo moderno de medicin del
crecimiento bacteriano, de uso no comn. Es ms utilizado
para clulas sanguneas.








CRECIMIENTO BACTERIANO
Holm C, Jespersen L. A flow-cytometric gram-staining technique for milk-associated bacteria. Appl Environ Microbiol. 2003, 69(5):2857-63.

EFECTO DE LA TEMPERATURA
Es uno de los principales factores que afectan el
crecimiento y la supervivencia de los M.O.

Cada M.O tiene sus rangos de temperatura:
TEMPERATURA MNIMA: Por debajo de la cual no hay
crecimiento, por que hay gelificacin de la membrana
provocando un transporte de nutrientes mas lento
hacia el interior de la clula.
TEMPERATURA MAXIMA: Por encima de la cual no hay
crecimiento por desnaturalizacin proteica y colapso de la
membrana (lisis celular).







CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTO DE LA TEMPERATURA
TEMPERATURA OPTIMA: En esta se da el crecimiento
optimo ya que las reacciones enzimticas alcanzan su
mxima velocidad. Esta prxima a la mxima.






CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTOS DEL pH Y ADAPTACIONES
El pH es otro de los factores determinantes para el
crecimiento y la supervivencia de los M.O. La tolerancia de
las bacterias a los cambios de pH es limitada, pues cambios
bruscos les producen la muerte.
Los cambios bruscos causan: Inestabilidad de la membrana
plasmtica, alteracin en el intercambio de hidrogeniones,
alteracin en la concentracin interna de los mismos (las
bacterias mueren si su pH interno es menor a 5,5), cambios
en la ionizacin de las molculas e inhibicin de la actividad
enzimtica y de las protenas de transporte.





CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTOS DEL pH Y ADAPTACIONES
MECANISMOS DE ADAPTACIN:
Sistemas antiporte: Potasio/protones (K
+
H
+
), Sodio
/protones (Na
+
H
+
).

ATPasa translocadoras de protones: En respuesta a medios
cidos, que expulsan los protones al medio extracelular (E.
coli cuando su pH interno es menor a 5,5).

Protenas chaperonas: Corrigen las protenas
desnaturalizadas.




CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTOS DE LA DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PRESIN
OSMOTICA Y ADAPTABILIDAD
Algunos M.O se adaptan:
OSMOFILOS: Crecen a elevada concentracin de azucares,
Ej: sacarofilos.

CRECIMIENTO BACTERIANO
XEROFILOS: Crecen en
ambientes muy secos.
HALOFILOS: Crecen a
elevadas concentraciones
de sales.



EFECTOS DEL OXIGENO Y ADAPTACIN
El oxigeno es un potente oxidante y es el mejor aceptor de
electrones, pero puede ser letal para las bacterias, pues
para su proceso de reduccin hasta llegar a agua se forman
especies toxicas, que oxidan los compuestos orgnicos
incluyendo las macromolculas.

Poseen enzimas capaces de destruir estos productos
txicos, denominadas ENZIMAS DETOXIFICANTES.




CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTOS DE LA PRESIN HIDROSTATICA Y ADAPTACIONES
La presin hidrosttica afecta la fisiologa y la bioqumica de
las bacterias que viven a grandes profundidades, afectando
su crecimiento que es mas lento al aumentar la presin.

La presin hidrosttica elevada disminuye la capacidad de
unin enzima-sustrato, interfiere con la sntesis de
protenas y afecta el transporte a nivel de membrana.

Se adaptan con plegamientos especiales de las enzimas,
mayor proporcin de cidos grasos insaturados en
membrana y cambios en las protenas de transporte y
estructurales de la membrana.




CRECIMIENTO BACTERIANO
EFECTOS DE LAS RADIACIONES

Radiaciones ionizantes: Rayos X, gamma y cosmicos. Efecto
letal por la ionizacin del agua. La ionizacin del agua
produce radicales hidroxilo que reaccionan con el ADN,
entre otras molculas provocando rupturas en ambas
cadenas.
Radiaciones UV: Efecto letal o mutagnico. Genera
fotoproductos (molculas modificadas) tales como dmeros
de pirimidinas .
Luz Visible: Fotooxidaciones en protenas y cidos nucleicos
debido a la absorcin de energa por molculas como
citocromos o porfirinas.




CRECIMIENTO BACTERIANO