Precautions

1. The ReaLyse lysing solution contains Diethylene glycol and Formaldehyde. 
ReaLyse Lysing Solution
10X Concentrate
Catalog No. 25237­ 00
1. INTENDED USE
The ReaLyse solution is an erythrolytic reagent intended for lysing red 
blood   cells   to   enable   a   lyse­no   wash   protocol   in   applications   that   involve 
immunofluorescent staining of human peripheral blood leucocytes.
The ReaLyse solution is recommended for use in lysis and fixation of  specified in the corresponding product inserts may give erroneous results.
cell   preparations   stained   with  ReaMetrix   reagents   such   as   Dry   Tri   T­STAT 
CD3/CD4/CD8 and CD3/CD4/CD45, ReaPan 34845, ReaPan B27, and ReaPan 
S34 which are to be analyzed by flow cytometry.
2. BACKGROUND  T­STAT CD3/CD4/CD8 reagent
Formaldehyde is a potential carcinogen and causes irritation to the eyes and 
skin. Ingestion of Diethylene glycol can be fatal. Wear suitable protective 
clothing. If swallowed, seek medical attention immediately.
2. All blood specimens are considered biohazards. Handle them as if they are 
capable of transmitting infection and dispose off with proper precautions in           
accordance with governmental regulations. Figure 1. SSC vs. CD45 dot plot; CD3 vs. CD4 dot plot obtained with Dry­Tri 
T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent.
3. The  addition  of  the  precise  volume  of  deionized  water  is  critical  to 
obtain correct concentration of the 1X working solution. Use a calibrated 
pipette and operate according to the manufacturer’s instructions.
4. The use of temperatures, incubation and vortexing times other than those 
Dilution Instructions
Dilute   the   10X   concentrate   1:10   with   the   deionized   water   at   room          
Figure 2. SSC vs. CD3 dot plot; CD8 vs. CD4 dot plot obtained with Dry­Tri 
temperature (20° to 25°C) to prepare 1X working lysing solution according to 
Table 1. Mix well. /

The   quality   of   immunophenotypic   analysis   of   cell   preparations   is  The   dual­parameter   light   scatter   plots   (SSC   versus   FSC,   Figure   3) 
Table 1: Dilution Instructions for Preparation of 1X ReaLyse Lysing (Working) 
evaluated on the basis of a high signal to noise ratio. The noise quotient of a  illustrates   the   expected   leucocyte   spatial   distribution   of   a   normal   K3EDTA 
solution
cell preparation is predominantly caused by the large percentage of red blood  anticoagulated blood sample lysed with ReaLyse lysing solution using lyse no 
cells (erythrocytes) relative to the fraction of white blood cells (leucocytes) in  Required Volume of 1X Working solution (mL) 5 10 15 20 25 wash   procedure.   Acquisition   and   analysis   are   with   a   BD   FACScan   flow 
Volume of 10X Concentrate (mL) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 cytometer equipped with Cell Quest Pro software.
the same. The removal of erythrocytes by lysis greatly reduces the background 
Volume of Deionized Water (mL) 4.5 9.0 13.5 18.0 22.5
noise, thus allowing for easier analysis of the target cell populations which have 
been stained by fluorophore tagged antibodies.   Storage and Handling
Use   of   ReaLyse   solution  in  the   processing   steps   for   analysis   of   the   Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent 
sample   preparations   to   be   analyzed   using   the   above­mentioned   reagents  after the expiry date on the label. 
(Section 1) is highly recommended. This ensures the sufficient lysis of Red   Do not freeze the ReaLyse Lysing solution. Follow the instructions given 
Blood Cells (RBCs) and fixing of the immuno stained population thus allowing  on the container label to ensure good shelf life. 
for samples to be analyzed in a lyse­no­wash protocol.   The diluted working solution is stable for one month when stored in a glass 
3. PRINCIPLE OF LYSIS  container   at   room   temperature.   Do   not   use   this   reagent   if   discoloration  Figure 3. SSC vs. FSC dot plot
occurs or a precipitate forms.
When whole blood is added to the monoclonal antibody reagent, the  The   following   plots   depict   peripheral   blood   sample   immuno   stained 
 The   ReaLyse   lysing   solution   contains   Formaldehyde   which   is   highly 
fluorochrome­labeled antibodies in the reagent bind specifically to leucocyte  with ReaPan 34845 reagent and treated with ReaLyse lysing solution prior to 
volatile. Do not leave the lid in a loose or open position. The lid should be 
surface   antigens.   The   stained   samples   are   then   treated   with   ReaLyse   lysing  analysis on a FACS Calibur flow cytometer (Figure 4).
tightly sealed after use.
solution which  results  in simultaneous  lysis   of   red   blood   cells   under   gentle 
hypotonic   conditions   and  fixation  of   the   leucocytes   resulting  in  a  leucocyte  Note ­ Follow appropriate instructions as given in the respective product inserts 
suspension substantially free of red blood cells and suitable for flow cytometric  for information on instruments, sample collection and sample processing.
analysis.
5. PERFORMANCE CHARACTERISTICS
4. REAGENT 
Representative   Acquisition   Plots   of   ReaLyse   Lysing   Solution   with 
The ReaLyse lysing solution is formulated as a buffered solution and  ReaMetrix Reagents 
contains Formaldehyde and Diethylene glycol.           
Depicted   below   are   acquisition   plots   of   peripheral   blood   samples   incubated 
It is provided as a 10X concentrate. A working solution of 1X dilution 
with Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent (Figure 1) and Dry­Tri T­STAT 
of this concentrate is to be used for the lysis of cell preparations before analysis 
CD3/CD4/CD8 reagent (Figure 2); processed with ReaLyse lysing solution and 
by flow cytometry. To obtain the working solution, the dilution of the 10X 
analyzed on a FACScan flow cytometer.
concentrate   is   performed   in   deionized   water   at   room   temperature   (20°C   to 
25°C) using reference table­1.
 Figure 6.  Correlation of Absolute Lymphocyte Counts (CD45+) determined   2. Retain   samples   in   VACUTAINER   blood   collection   tubes   at   room 
using the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent lysed with ReaLyse lysis   temperature (20° to 25°C) prior to staining and lysing. Refer to the reagent 
solution   compared   to   Absolute   Lymphocyte   Counts   determined   using   package insert for maximum storage times after collection.
Hematology Analyzer. (n=26) 3. Samples with nucleated red blood cells may show incomplete lysis of red 
blood cells. This may also occur when assaying blood samples from patients 
with certain hematologic disorders in which red cells are difficult to lyse, as 
         in sickle­cell anaemia, thalassemia, spherocytosis, etc.
Figure 4. SSC vs. CD45 dot plot; SSC vs. CD3 dot plot; CD3 vs. CD4 dot plot;  
4. Reagents should be used before the expiration date printed on the reagent 
CD3 vs. CD8 dot plot obtained with ReaPan 34845 reagent bottle.
Performance Data 5. Results obtained with flow cytometry may be erroneous if the instrument is 
misaligned,  compensation  spillovers  are  not  correctly compensated or  the 
The   following   performance   data   for   lysing   solution   were   generated   by 
gate is improperly set.
performing clinical validation on Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent.
6. Reproducible results will be obtained as long as the procedure used is in 
Accuracy
accordance   with   this   package   insert   and   with   good   laboratory   practice 
The absolute counts for CD45+, CD3+ and CD4+CD3+ T­cells were  Figure 7. Correlation of Absolute CD3+ cell Counts determined using the Dry­ guidelines.
determined using Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45  reagent. Aliquots of the  Tri T­STAT CD3/CD4/CD45  reagent stained and lysed with ReaLyse lysing  
same blood samples were stained and lysed with the ReaLyse lysis solution and  solution compared to a commercially available lysing solution. (n=30)
a commercially available lysis solution. The samples were analyzed using a BD  7. REFERENCES
FACScan™ flow cytometer. The plots in the figure 5, 6, 7, 8 indicate that the  1. Mandy   FF,   Nicholson   JK,   McDougal   JS.   Guidelines   for   performing 
results from both the lysis solutions are equivalent. single­platform absolute CD4+ T­cell determinations with CD45 gating 
for persons infected with human immunodeficiency virus. Centre for 
Disease   Control   and   Prevention.   MMWR   Recomm   Rep 2003   Jan 
31;52(RR­2):1­13.

2. Mandy   FF,   Brando   B.  Enumeration   of   Absolute   Cell   Counts   Using 

Immunophenotypic Techniques. Current Protocols in Cytometry (2000) 
6.8.1­6.8.26.

3. Bossuyt   X,  Marti   GE,  Fleisher   TA:   Comparative   analysis   of   whole 

blood lysis methods for flow cytometry. Cytometry 30:124–133, 1997.
Figure 8. Correlation of Absolute CD4+ CD3+ cell Counts determined using   4. Tamul KR, Schmitz KK, Folds JD: Comparison of the effects of Ficoll­
the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent stained and lysed with ReaLyse   Hypaque   separation   and   whole   blood   lysis   on   results   of   immuno­ 
lysing solution compared to a commercially available lysing solution. (n=30) phenotypic analysis of blood and bone marrow samples from patients 
Figure 5.  Correlation of Absolute Lymphocyte Counts (CD45+) determined   Precision with hematologic malignancies. Clin Diagn Lab Immunol 2:337–342, 
using the Dry­Tri T­STAT CD3/CD4/CD45 reagent lysed with ReaLyse lysis   The blood of 3 healthy donors was stained five times each with Dry­Tri  1995.
solution compared to a commercially available lysis solution. (n=30) T­STAT   CD3/CD4/CD45   reagent.   The   lyse   no­wash   staining   and   lysis  5. Carter PH, Resto­Ruiz S, Washington GC, Ethridge S, Paline A, Vogt 
procedure was used and run on FACScan flow cytometer. The observed CV  R,  Waxdal  M, Fleisher  T,  Noguchi  PD,   Marti  GE:  Flow cytometric 
was <5%. The results obtained are summarized in the following table.  analysis   of   whole   blood   lysis,   three   anticoagulants,   and   five   cell 
preparations. Cytometry 13:66–74, 1992.
6. Vuorte, J., Jansson, S­E., Repo, H., "Evaluation of red blood cell lysing 
solutions   in   the   study   of   neutrophil   oxidative   burst   by   the   DCFH 
assay", 2001, Cytometry, 43, 290­296.
7. Tiirikainen MI. Evaluation of red blood cell lysing solutions for the 
6. LIMITATIONS detection   of   intracellular   antigens   by   flow   cytometry.   Cytometry 
1. ReaLyse lysing solution is specifically formulated for use with ReaMetrix  1995;20:341–348.
reagents. 8. WARRANTY
 The product is warranted only to conform to the quantity and contents 
stated   on   the   label   at   the   time   of   delivery   to   the   customer.   There   are   no 
warranties,   expressed   or   implied,   that   extend  beyond   the   description   on   the 
label of the product. ReaMetrix’ sole liability is limited to replacement of the 
products.   ReaMetrix   is   not   liable   for   property   damage,   personal   injury,   or 
economic loss caused by the product.
Note:   FACScan,   FACSCalibur   are   all   registered   trade   names   of  
Becton­Dickinson; EPICS XL is registered trade name of Beckman­Coulter.

CUSTOMER SUPPORT INFORMATION
ReaMetrix India Pvt. Ltd.
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore­560058, India
Ph: 91­80­28378693/5,
Fax: 91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com
www.reametrix.com

Rev No. 2.0,  15­Apr­09