Anda di halaman 1dari 8

MAKALAH ANALISIS MIKROBIOLOGI

KLT Bioautografi







Kelompok : 8
Anggota : 1. Regsa Claudia U. Somba
2. Wardahtul Nurjannah
3. Syakila Bidin
4. Farid
5. Rosnawati
6. I Nyoman Arya Wibawa

Kelas : B


PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TADULAKO
PALU
2014

BAB 1
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus
dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian
memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air
sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama
protoplasmanya serta untuk masuknya nutrient ke dalam sel. Kebanyakan
analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu,
isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum
identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang digunakan,
namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan.
Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan
peralatan yang relative sederhana. Dalam mendeteksi campuran bakteri
yang berupa bercak pada KLT ada 2 metodeyang dipakai untuk
mendeteksi bercak atau komponen yang aktif sebagai anti bakteri. Kedua
metode tersebut adalah:
1 . Deteksimikrobiologi ( bioautografi )
2. Deteksi senyawa kimia dengan reaksi warna spesifik.
Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi
bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis atau kromatografi
kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antibiotic, anti fungi
dan anti viral. Bioautografi juga dapat juga digunakan untuk mendeteksi
senyawa antibitik yang belum diketahui yang manadengan pereaksi warna
spesifik digunakan sebagai pembanding bioautografi sehingga kedua
metode tersebut saling melengkapi. Biautografi digunakan bertujuan untuk
mendeteksi bercak atau komponen zat aktif sebagai antibakteri. Ada 3
metode bioautografi yaitu:
1. Bioautografi langsung/direct adalah Mikroorganisme tumbuh
secara langsung di atas lempeng KLT.
2. Bioautografi kontak/contact adalah Senyawa dipindahkan dari
lempeng KLT ke medium.
3. Bioautografi pencelupan/overlay

















BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Bioautografi
Bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk menemukan
suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara melokalisir
aktivitas antimikroba tersebut pada suatu kromatogram. Metode ini
memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada bioautogafi
ini didasarkan atas efek biologi berupa antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan
lain-lain dari substansi yang diteliti. Ciri khas dari prosedur bioautografi
adalah didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya
dipindahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan
dengan merata bakteri uji yang peka. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu akan terlihat zona hambatan disekeliling spot dari KLT yang telah
ditempelkan pada media nagar. Zona hambatan ditampakkan oleh aktivitas
senyawa aktif yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa terhadap
pertumbuhan mikroorganisme uji. Biautografi dapat dipertimbangkan karena
paling efisien untuk mendetekski komponen antimikroba, sebab dapat
melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa aktif tersebut terdapat dalam
bentuk senyawa kompleks dan dapat pula diisolasi langsung dari komponen
yang aktif.
Metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram
hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas yang mempunyai
aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik dan antiviral disebut
bioautografi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu kromatografi yang
berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silika atau
alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fasa bergerak
(fase mobil) atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran
organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik.
Kebanyakan analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan
senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih
dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang
digunakan, namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan.
Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan peralatan
yang relatif sederhana.
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan
adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr
(diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam
kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam.
Silika gel yang paling banyak dipakai
B. Macam-macam Metode KLT Bioautografi
1. Bioautografi Langsung
Bioautografi langsung, yaitu dimana mikroorganismenya tumbuh
secara langsung di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Prinsip
kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam
medium cair disemprotkan pada permukaan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada lempeng
kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengeringan Kromatogram dilakukan secara hati-hati dengan menggunakan
hair dryer untuk menghiangkan sisa eluen. Senyawa alam lempeng
kromatogram dideteksi dengan menggunakan sinar UV pada panjang
gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah diketahui letak dan jumlah
senyawa aktif yang terpisah atau terisolasi, dengan timbulnya noda (spot)
pada lempeng KLT, selanjutnya disemprotkan suspense bakteri uji
sebanyak 5-6 ml di atas permukaan lempeng KLT tadi secara merata.
Besarnya lempeng KLT yang sering digunakan adalah 20x20 cm dan untuk
meratakan suspensi bakteri yang telah disemprotkan dapat menggunakan
alat putar atau roller yang dilapisi dengan kertas kromatogram (Whatman,
Clipton). Lempeng KLT diinkubasi semalam (1x24 jam) dalam box plastik
dan dilapisi dengan kertas, kemudian disemprot dengan 5 ml larutan TTC
(20 mg/ml) atau INT (5 mg/ml), INTB (5 mg/ml) serta MTT (2,5 mg/ml)
dan selanjutnya diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 37C

2. Bioautografi Kontak
Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan
dari lempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri uji
yang peka secara merata dan melakukan kontak langsung. Metode ini
didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan
Kromatogafi Lapis Tipis (KLT) atau kromatografi kertas. Lempeng
kromatografi tersebut ditempatkan di atas permukaan Nutrien Agar yang
telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap
senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15-30 menit, lempeng
kromatografi tersebut dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa
antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam
media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi
pada waktu dan suhu yang tepat sampai noda yang menghambat
pertumbuhan mikroorganisme uji tampak pada permukaan membentuk
zona yang jernih. Untuk memperjelas digunakan indicator aktivitas
dehidrogenase.
3. Bioautografi pencelupan
Bioautografi pencelupan, dimana medium agar telah
diinokulasikan dengan suspensi bakteri dituang di atas lempeng
Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada prakteknya metode ini dilakukan
sebagai berikut yaitu bahwa lempeng kromatografi yang telah dielusi
diletakkan dalam cawan petri, sehingga permukaan tertutup oleh medium
agar yang berfungsi sebagai base layer. Setelah base layernya memadat,
tuangkan medium yang telah disuspensikan mikroba uji yang berfungsi
sebagai seed layer. Kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang
sesuai.
C. Keuntungan dan Kerugian Metode KLT Bioautografi
Metode bioautografi dalam mendeteksi komponen yang aktif sebagai
antibakteri memiliki beberapa keuntungan dan kerugian :
Keuntungan :
1. Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai
aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik, dan antiviral.
2. Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui
mekanismenya.
3. Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan.
4. Cepat dalam pengerjaannya


Kerugian:
1. Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai aktivitas
membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.
2. Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari luar atau
karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung khasiat bakteri
antibakteri.
3. Mempunyai faktor kesalahan yang besar.
Metode kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan yaitu
diperoleh waktu yang lebih cepat dan hasil pemisahan yang baik. Waktu rata-
rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang silica sekitar 10 cm
adalah sekitar 20-30 menit (tergantung sifat dari fase gerak). Dalam
kromatografi lapisan tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam
jumlah yang sedikit dan noda-noda yang dipisahkan dilokalisir pada plat seperti
pada lembarab kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa-senyawa
yang terpisah secara individu yaitu dengan cara mengeruknya dan
mengumpulkan tiap-tiap lapisan di mana lapisan itu diserap. Identifikasi dari
senyawa-senyawa yang diserap pada lapisn tipis lebih baik digunakan atau
dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna, tetapi lazimnya
untuk identifikasi menggunakan harga Rf yang didefinisikan sebagai berikut:
Harga Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak yang ditempuh pelarut
Harga Rf dari senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga Rf
standard. Perlu diperhatikan bahwa harga Rf yang diperoleh hanya berlaku
untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyarap yang digunakan, meskipun
demikian daftar dari harga Rf untuk berbagai pelarut dan penyerap dapat
diperoleh.

D. Skema Kerja Metode KLT Bioautograf