Anda di halaman 1dari 10

Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin, 15 April 5Mei 2014

Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB


PJP : Syaefudin, SSi, MSi
Asisten : Deva Krisna Kadarani
Mustika Weni
Puji Rahmadani



FRAKSINASI SUBSELULER
(PREPARASI HOMOGENAT, ISOLASI FRAKSI INTI, ISOLASI FRAKSI
MITOKONDRIA DAN ISOLASI MIKROSOM)

Kelompok 26

Khairika Helyuputri G84120093
Navia Belladina G84120059
Saepul Rahmat G84120029






















DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT\ PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PENDAHULUAN
Fraksinasi subselular adalah pemecahan sel melalui homogenisasi dan
pemisahan organel-organel dari satu jenis dengan lainnya menggunakan alat
sentrifus. Bentuk sederhana dari sentrifus terdiri dari rotor dengan lubang untuk
memasukkan wadah atau tabung berisi cairan dan sebuah motor untuk memutar
rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Prinsip kerja dari sentrifus adalah
memfraksinasi organel-organel dalam suspensi sesuai dengan densitasnya. Kerja
sentrifus untuk memfraksinasi suspensi didasarkan pada pengaturan pergerakan
dan kecepatan rotor maupun suhu dalam sentrifus.
Langkah awal untuk melakukan fraksinasi subseluler adalah
menhomogenisasi sampel. Homogenisasi sampel dilakukan dengan
menghancurkan sampel secara mereta dengan ditambahkan EDTA. Homogenat
yang dihasilkan dari homogenisasi selanjutnya disentrifugasi menggunakan
sentrifugasi diferensial kecepatan tinggi berpendingin untuk memisahkan
komponen sel hati tikus menjadi fraksi-fraksi tertentu berdasarkan perbedaan
densitasnya. Sentrifugasi pada percobaan ini dilakukan secara bertahap sampai
diperoleh fraksi inti dan fraksi mitokondria.
Sentrifius adalah sebuah alat yang digunakan untuk memisahkan partikel-
partikel yang terdapat pada suatu bahan berdasarkan massa jenisnya (Palha 2002).
Dalam proses pemisahan partikel ini, sentrifius menggunakan prinsip perputaran
tabung dengan memanfaat gaya sentrifugal. Pada saat perputaran ini, bahan yang
di sengtrifugasi tadi akan terbagi menjadi dua lapisan, yaitu supernatan yang
memiliki massa jenis ringan dan pelet yang memiliki massa jenis lebih besar
(Nizar dan Santoso 2007).
Sentrifius terdiri atas sebuah rotor, yaitu tempat untuk meletakkan tabung-
tabung yang akan disentrifugasi. Rotor ini nantinya akan berputar dengan
kecepatan tertentu yang diinginkan dan perputaran inilah yang mengakibatkan
partikel-partikel pada suatu bahan akan terpisah berdasarkan massa jenisnya.
Semakin cepat perputaran yang dilakukan, semakin banyak pula organel sel yang
dapat diendapkan begitu juga sebaliknya (Nizar dan Santoso 2007).Kecepatan
sentrifus diukur dalam rpm yang tidak menggambarkan daya pemisah alat
tersebut.
Percobaan ini bertujuan melatih mahasiswa melakukan preparasi
homogenat sel hati tikus dari hewan uji yang akan digunakan untuk fraksinasi
subselular. Selain itu terampil melakukan fraksinasi pada kecepatan gravitasi
sentrifus yang berbeda untuk isolasi inti dan mitokondria dari homogenate yang
telah disiapkan sebelumnya.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan 1 Biokimia
Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut
Pertanian Bogor. Waktu praktikum dimulai tanggal 15 April -24 Mei 2014.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah erlenmeyer, gelas
piala, gunting dan pisau bedah, alat penggerus manual (homogenizer), kain blacu,
tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet mohr, pipet tetes, tabung plastik kecil (vial),
dan sentrifuse Beckman model J2-21. . Bahan-bahan yang digunakan pada
praktikum ini antara lain tikus percobaan dengan bobot 100-200 gram, larutan
sukrosa 0,25 M-EDTA 1 mM dingin, larutan sukrosa 0,25 mM-CaCl
2
3 mM
dingin, dan eter.
Prosedur Percobaan
Preparasi homogenat sel hati tikus. Tikus percobaan dengan bobot 100-
200g disiapkan dan diperlakukan dengan kasih sayang. Lalu tikus dibius dengan
eter berlebih. Setelah tikus terbius, tikus ditelentangkan dan dibedah bagian
perutnya menggunakan pisau dan gunting dengan sayatan memanjang kearah
dada. Organ hati diambil perlahan dan dimasukkan kedalam larutan 0,25 M-
EDTA 1mM (sukrosa-EDTA) yang sebelumnya telah didinginkan. Organ hati
didinginkan dan ditimbang. Organ hati tikus dipotong-potong dan dibilas dengan
larutan sukrosa-EDTA hingga bersih. Lalu sekitar 3-5g hati tikus di homogenasi
dan ditambahkan xxx ml larutan sukrosa-EDTA. Sebagian homogenat disimpan
dalam beberapa tabung kecil dan sisa homogenat lainnya ditambahkan larutan
0,34M-EDTA 1mM lalu dimasukkan dalam tabung sentrifius. Setelah itu
homogenat di sentrifugasi dengan kecepatan 700g selama 10 menit.
Isolasi fraksi inti. Bagian pelet hasil sentrifugasi homogenat hati tikus di
sespensikan menggunakan sukrosa 0,25mM-CaCl
2
3mM. Suspensi disaring
menggunakan kain blacu lalu dicuci menguakan larutan sukrosa-CaCl
2.
Filtrat di
sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10menit. Supernatan yang
dihasilkan dibuang sedangkan pelet yang dihasilkan disuspensi dengan larutan
sukrosa-CaCl
2.
Lalu suspensi dibagi kedalam dua tabung yang berbeda.
Isolasi fraksi mitokondria. Supernatan yang diperoleh dari sentrifugasi
homogenat hati tikus disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit.
Setelah terbentuk supernatan dan pelet, pelet diambil dan ditambahkan 10ml
0,34M-EDTA 1mM lalu dimasukkan kedalam tabung sentrifius dan
dihomogenisasi. Lalu campuran ditambahkan 30ml larutan sukrosa-EDTA
sehingga volumenya mecapai 40ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000
rpm selama 10 menit. Bagian pelet hasil sentrifugasi di resuspensi dengan 10 ml
larutan sukrosa-EDTA dan dibagi kedalam dua tabung yang berbeda lalu
disimpan.
Isolasi fraksi mikrosom. Supernatan hasil isolasi mitokondria di
sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang
diperoleh ditimbang dan dibagi kedalam empat tabung yang berbeda, disimpan
dan diberi label sitoplasma. Pelet yang dihasilkan ditambahkan 30ml larutan
sukrosa-EDTA lalu disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15 menit.
Lalu dibagi kedalam empat tabung yang berbeda.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Praktikum kali dilakukan dengan melakukan fraksinasi subseluler dengan
menggunakan hati tikus sebagai homogenatnya yang dilakukan melalui beberapa
tahapan, yaitu preparasi, isolasi fraksi inti, isolasi fraksi mitokondria serta
fraksinasi mikrosom. Berdasarkan percobaan didapat data sebagai berikut:
Tabel 1 Fraksinasi subseluler
Meja Bobot hati tikus (g) Bobot homogenat (g)
1 7,11 30,64
2 6,79 31,93
3 5,46 31,43
4 8,18 34,62
5 8,32 47,03
6 7,32 47,10
7 8,62 47,23
Contoh Perhitungan :
RCF = 1,19 x 10
-5
x rpm
2
x r
700 = 1,19 x 10
-5
x rpm
2
x
rpm =
Tabel 2 Isolasi fraksi inti
Meja
Bobot tabung
kosong (g)
Bobot tabung
dan isi (g)
Bobot fraksi
inti (g)
1 13,52 21,47 9,95
2 12,24 22,35 10,11
3 14,60 25,18 10,58
4 12,40 23,45 11,05
5 12,00 23,00 11,00
6 14,70 25,07 10,37
7 14,92 26,81 11,89
Contoh Perhitungan :
Bobot fraksi inti meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)
= 35,83 g 16,36 g
= 19,47 g
Tabel 3 Isolasi fraksi mitokondria
Meja Bobot tabung
kosong (gram)
Bobot tabung dan
isi (gram)
Bobot fraksi
mitokondria (gram)
1 16,15 26,35 10,20
2 17,86 28,17 10,31
3 15,75 26,16 10,41
4 15,22 26,42 11,20
5 15,83 25,55 9,72
6 15,72 25,45 9,73
7 15,88 26,64 10,76
Contoh Perhitungan :
Bobot fraksi mitokondria meja 6 =(bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)
= 46,65 g 15,88 g
= 30,77 g
Tabel 4 Isolasi fraksi mikrosom
Meja
Bobot tabung
kosong (g)
Bobot tabung
dan isi (g)
Bobot fraksi
mikrosom (g)
1 16,33 22,00 5,67
2 15,25 18,68 3,43
3 16,56 22,04 5,48
4 16,78 38,60 0,43
5 16,36 38,16 21,80
6 16,21 18,35 2,14
7 15,58 21,62 6,04
Contoh Perhitungan :
Bobot fraksi mikrosom meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)
= 18,35 g 16,21 g
= 2,14 g
Tabel 5 Isolasi fraksi sitosol
Meja
Bobot tabung
kosong (g)
Bobot tabung
dan isi (g)
Bobot fraksi
sitosol (g)
1 61,30 113,21 51,91
2 90,43 133,46 43,03
3 96,88 156,23 59,35
4 95,90 148,29 52,39
5 Tidak dihitung Tidak dihitung Tidak dihitung
6 121,79 176,32 54,53
7 Tidak dihitung Tidak dihitung Tidak dihitung
Contoh Perhitungan :
Bobot fraksi sitosol meja 6 = (bobot tabung dan isi) (bobot tabung kosong)
= 176,32 g 121,79 g
= 54,53 g
Praktikum kali ini melakukan fraksinasi subseluler terhadap hati tikus.
Prinsip dari fraksinasi subseluler yang dilakukan adalah pemisahan organel sel
dari hati tikus dengan berdasarkan massa partikel, ukuran partikel, panjang
partikel serta densitas partikel menggunakan metode sentrifugasi. Setelah
dilakukan sentrifugasi, bagian sel akan terpisah berdasarkan densitasnya. Bila
suatu organel sel memiliki densitas yang lebih tinggi, maka ia akan mengendap
dibawah atau disebut sebagai pelet. Sedangkan bila suatu organel sel memiliki
densitas yang lebih rendah, maka organel sel tersebut akan berada di lapisan atas
atau yang disebut sebagai supernatan.













Homogenat hati
tikus
Sentrifugasi 700 g
selama 10 menit.
Pelet Supernatan

























Gambar 1. Bagan alir fraksinasi subseluler

Fraksinasi subseluler yang dilakukan menggunakan dua jenis larutan, yaitu
sukrosa-EDTA serta sukrosa-CaCl
2
. Fungsi dari sukrosa adalah sebagai larutan
isotonik sehingga tekanan osmosis sel terjaga. Campuran EDTA berfungsi sebagai
pengkelat logam yang terdapat pada hati. EDTA juga berfungsi mengendapkan
protein pengotor yang tidak diinginkan. Pada isolasi fraksi inti digunakan larutan
sukrosa-CaCl
2.
Larutan ini berfungsi sebagai buffer yang berperan sebagai
pencegah rusaknya sel terhadap perubahan pH. Semua tahap dalam fraksinasi
subseluler harus dilakukan pada suhu rendah. Hal ini dilakukan untuk
meminimalisir degadrasi enzim-enzim yang ada terhadap komponen sel serta
mempertahankan struktur dan fungsi dari organel sel (Carpette 2005)
Percobaan ini menggunakan tikus, karena hewan ini termasuk mamalia.
Jenis kelamin tikus yang diuji adalah jantan,bkan tikus betina dikarenakan tikus
betina mengalami fase hormonal seperti menstruasi pada perempuan yang
mempengaruhi keadaan organel-organel. Galur tikus yang biasa digunakan untuk
fraksinasi subselular galur Whistar jantan yang merupakan cikal bakal galur tikus
Fraksi inti Buang supernatan
Sitosol
Mikrosom
Buang supernatan
Mitokondria
Supernatan Pelet
Sentrifugasi 8000 rpm
selama 10 menit
Resuspensi sukrosa-
CaCl
2
. Sentrifugasi 3000
rpm selama 10 menit
Sentrifugasi 15000
rpm 15 menit
Resuspensi sukrosa-
EDTA. Sentrifugasi
14.000rpm 10 menit
Sparangue Dawley. Tikus Whistar memiliki ciri-ciri kepala lebar, berdaun telinga
panjang, dan berekor panjang. Tikus jenis ini dikembangkan oleh Wishtar
University sebagai model percobaan mahluk hidup yang umum digunakan di
laboratorium sejak tahun 1906 (Dahab dan Yesham 2005).
Hati tikus digunakan dalam percobaan kali ini. Hati merupakan organ
yang sangat penting dalam kehidupan. Hati terbagi menjadi lobus kanan dan kiri.
Fungsi hati yaitu sekresi, metabolisme, penyimpanan detoksifikasi, produksi
panas, dan penyimpan darah. Hati tikus yang digunakan mengandung organel
seperti mitokondria yang berfungsi sebagai pembangkit tenaga sel karena dapat
memproduksi energi dalam bentuk ATP (Sloane 2003). Mitokondria mempunyai
dua lapis membran yaitu membran luar dan membran dalam. Membran dalam
berlekuk-lekuk yang disebut Krista dan membran luar membatasi bagian dalam
dengan matriks sel. Mitokondria memiliki DNA sendiri yang dikenal dengan
mtDNA (Campbell 2002).
Organ hati digunakan dalam praktikum ini disebabkan karena organ hati
memiliki sel yang baik dan mempunyai metabolisme yang baik (Sloane 2003).
Membran plasma dihancurkan karena membran plasma adalah penyusun utama
membrane sel itu yaitu lipid, protein, juga karbohidrat. Tikus yang digunakan
yaitu tikus jantan karena lebih mudah dianalisa dan kandungan hatinya lebih
banyak dibandingkan dengan tikus betina. Selama percobaan dilakukan dalam
kondisi dingin hal ini dilakukan guna mencegahsel agar tidak rusak serta
memperlambat gerakan termal molekul enzim ( Poedjiadi 2007)
Fungsi mitokondria adalah sebagai pembangkit tenaga sel karena
mitokondria memproduksi energi dalam bentuk ATP. Energi ini diperoleh dari
penguraian nutrient seperti glukosa, asam amino dan asam lemak (Sloane 2003).
Mitokondria juga sebagai tempat respirasi sel berlangsung, Respirasi sel
merupakan proses katabolisme atau perombakan untuk menghasilkan energi bagi
berlangsungnya kehidupan sel (Campbell 2007). Inti sel berfungsi sebagai pusat
pengendali sistem sel termasuk sistem metabolisme sel. Mikrosom
merupakanorganel yang akan menghasilkan ribosom dalam sel, sehingga peran
mikrosom dalam sel cukup penting agar tidak kekurangan ribosom. Sitosol
merupakan cairan yang terdapat dalam sitoplasma yang sangat berperan dalam
proses metabolisme.
Bobot hati hasil penimbangan adalah 8.62 gram. Hati dipotong-potong dan
dibersihkan dengan larutan sukrosa-EDTA dingin, kemudian dihomogenisasi agar
organel utama dalam organ dapat terpisahkan tanpa merusak sel (Campbell 2002).
Didapatkan bobot homogenat 47,23 g. Sentrifugasi dilakukan setelah homogenat
dihasilkan dengan kecepatan yang berbeda-beda untuk homogenasi homogenate
awal, isolasi fraksi inti, isolasi fraksi mitokondria. Homogenisasi homogenate
awal dilakukan pada kecepatan 700g selama 10 menit menghasilkan pelet dan
supernatan. Pelet disuspensi dengan larutan sukrosa-CaCl
2
yang berfungsi sebagai
buffer yang berperan dalam pencegahan rusaknya sel tehadap perubahan pH
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500g untuk mendapatkan fraksi ini.
Supernatan hsil sentifugasi homogenat awal disentrifugasi dengan kecepatan
5000g selama 15 menit. Pelet mitokondria diresuspensi dengan larutan sukrosa-
EDTA dan dibekukan di dalam vial. Superatan yang dihasilkan dapat
disentrfugasi lebih lanjut untuk mendapatkan fraksi mikrosom. Bagan 1
merupakan bagan yang menggambarkan hasil yang akan didapatkan jika
melakukan fraksinasi dengan kecepatan yang berbeda setiap sentrifugasi. Hal ini
dilakukan guena mendapatkan fraksi sesuai dengan yang diinginkan.
SIMPULAN
Prinsip fraksinasi subselular adalah pemisahan organel-organel sel dengan
sentrifugasi pada kecepatan yang berbeda-beda. Homogenat berasal dari organ
hati tikus jantan dengan bobot organ hati 8.62 gram dan bobot homogenat 47,23 g.
sentifugasi dilakukan dengan kecepatan 700 rpm untuk homogenisasi awal, 3000
rpm untuk isolasi fraksi inti, dan 14000 rpm saat isolasi fraksi mitokondria.
Larutan sukrosa-EDTA dan larutan sukrosa-CaCl
2
yang digunakan dijaga dalam
keadaan dingin agar organel-organel di dalam sel tidak rusak.

DAFTAR PUSTAKA
Campbell NA. 2002. Biologi jilid I, Edisi Kelima. Rahayu Lestari, penerjemah.
Erlangga: Jakarta.
Carpette. 2005. An Introduction to Practical Biochemistry. London(UK): McGraw
HillBook Company
Dahab GM, Hesham YD. 2005. Effect of Angiotensin Converting Enzyme
Inhibitors Captopril and Lisinopril on Collagen Synthesis by Cultured rat
liver Cell. Saudi Pharmaceutical Journal 37:39. [terhubung berkala].
http://www.biochemj.org.[9 Mei 2014]
Nizar M, Santoso L. 2007. Pengembangan Metode Centrifuge Pemeriksaan Darah
Tebal Manusia. Jurnal Dunia Kesehatan Masyarakat. Vol: 1 No. 2 hal (21-
28).
Palha F. 2002. The Influence of Centrifugation on Zymomonas mobilis
Agregation. Journal of Biotechnology. Vol: 5 No. 3 hal (112-117).
Poedjiadi A. 2007. Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press
Sloane, Ethel. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC.
Volkov P. 2002. Effect of Design Parameters of the Centrifuge Rotor on
Separation of Suspensions. Russian Journal of Applied Chemistry. Vol: 76.
Hal (1094-1098).


.
.