TUGAS MIKROBIOLOGI FARMASI

IDENTIFIKASI BAKTERI
OLEH:
NUR AYU SHOLEHKAWATI 17113233A
ELISABET INTAN P. 17113234A
DEVY SEKAR ARUM 1711323A
ARINA !ULFAH P. 1711323"A
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
2#13
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 L$%$& B'($)$*+
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu
bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan
suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar
dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
erdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna
basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan
ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang
positif berwarna ungu !"e#ine, $%%%&.
Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat
penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan
biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan
untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan
mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. 'ndospora adalah
organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang
memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik !Pelc(ar dan )han, $%%*&.
1.2 T,-,$*
Tujuan dilakukannya praktikum mengenai pewarnaan sel !bakteri dan
jamur& dan pewarnaan endospora ini antara lain +
,. Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan !preparat&
$. Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri
-. Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri
.. Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan
memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut
/. Mempelajari proses pewarnaan struktur sel jamur !kapang&
0. Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel jamur !kapang&
*. Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan
memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut
1.3 M$*.$$%
Manfaat yang diperoleh setelah mengikuti praktikum mengenai pewarnaan
sel bakteri dan pewarnaan endospora ini adalah praktikan akan mempunyai
keterampilan dan keahlian dalam hal pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan
endospora yang banyak dilakukan dalam laboratorium-laboratorium mikrobiologi
dengan metode yang disesuaikan dengan alat dan biaya yang ada.
BAB II
TIN/AUAN PUSTAKA
akteri merupakan organisme prokariot. 1mumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran ,.%%% 2 atau lebih !3aluyo, $%%.&. Sel bakteri memiliki
panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran ,%% kali lebih
panjang daripada sel spesies yang lain. akteri merupakan makhluk hidup dengan
ukuran antara %,, sampai %,- 4m. entuk bakteri bermacam 5 macam yaitu elips,
bulat, batang dan spiral. akteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai
dengan suatu (at pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas
dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel
sel indi#idu bakteri dapat berbentuk seperti bola6elips, batang !silindris&, atau
spiral !heliks& !Pelc(ar 7 )han, $%%*&.
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan #akuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan (at warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan
warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna
pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di
antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial !Pelc(ar 7 )han, $%%*&.
8at warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu
ionnya berwarna. 9aram terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan
negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri
karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan
inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat
dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. :ika warna terletak pada
muatan positif dari (at warna, maka disebut (at warna basa. :ika warna terdapat
pada ion negatif, maka disebut (at warna asam. )ontoh (at warna basa adalah
methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada
umumnya adalah )l
-
, SO
.
-
, );
-
)OO
-
, )OO;)OO
<
. 8at warna asam umumnya
mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel
sedangkan (at warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti + fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan (at warna penutup !Sutedjo,
,==,&.
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
>katan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler
maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan
sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana
menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian
larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan
yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri !1msl, $%%?&.
8at pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu di antaranya berwarna. Pada (at warna yang bersifat basa, warna
terdapat pada ion positif !(at pewarna
@
)l
-
& dan pada pewarna asam, warna akan
terdapat pada ion negatif !(at pewarna
-
Aa
@
&. ;ubungan antara bakteri dengan (at
pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat
dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. :adi, jika bakteri itu diwarnai, muatan
negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif (at pewarna
basa, Bristal #iolet, safranin dan metilin blue adalah beberapa (at pewarna basa
yang biasa digunakan. Sebaliknya (at pewarna asam ditolak oleh muatan negatif
bakteri menyeluruh. :adi, mewarnai bakteri dengan (at pewarna asam akan
menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Barena sel
bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna !Colk 7 3heeler,
,==-&.
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun ,??. oleh seorang dokter
kebangsaan Denmark )hristian 9ram !membuat (at pewarna khusus& pewarna
tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi
dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur
pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal #iolet, setelah ,
menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit
dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol =/E selama -% detik, kemudian
dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck !untuk buta warna merah&
selama , menit. 8at pewarna kristal #iolet dan yodium akan membentuk senyawa
yang kompleks. eberapa bakteri akan melepaskan (at pewarna dengan mudah
apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain (at pewarna akan bertahan
walaupun dicuci dengan alkohol =/E. akteri gram positif akan terwarna ungu
!kristal #iolet& dan bakteri gram negatif akan terwarna merah !safranin& !1msl,
$%%?&.
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah
pewarnaan 9ram dan 8iehlAelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui
morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan 9ram dapat
mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan 9ram dimulai dengan
pemberian kristal #iolet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua
bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. akteri 9ram positif
membentuk kompleks Bristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan
safranin, bakteri 9ram positif akan berwarna ungu. )ontoh bakteri 9ram positif
adalah Streptococcus, acillus, Stapilococcus, )lostridia, )orynebacterium
dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri 9ram negatif
akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna
merah pada bakteri 9ram negatif. )ontoh bakteri 9ram negati#e adalah Aeisseria,
Blebesiella, Cellonella, Shigella, Salmonella, ;emophillus, dll !)appuccino 7
Sherman, ,=?-&.
Proses pewarnaan gram ini memerlukan . jenis reagen. akteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan
bakteri. Feagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna
ini akan mewarnai dengan jelas. Feagen kedua disebut bahan pencuci warna
!decolorizing agent&. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna
dasar, maka warna akan tercuci. Feagen terakhir adalah warna pembanding, bila
warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil
akhir tetap warna dasar. "arutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan
iodium, alkohol dan safranin !Tracy, $%%/&.
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada
dinding sel bakteri 9ram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian
alcohol, maka poripori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. ;al ini
menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri 9ram positif
akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. ;al ini akan mengecilkan
poripori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. akteri 9ram positif
memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak -% lapisan
sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri
9ram negatif hanya memiliki ,$ lapisan peptidoglikan sehingga memiliki
permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan 9ram terdiri atas 9ram G
!#iolet& !Bristal #iolet, Galkohol, Gmmonium oksalat, GHuades&, 9ram
!cokelat& !>odium, Balium iodide, GHuades&, 9ram )
!Gseton, Glcohol&, 9ram D !merah& !Safranin, Glcohol, GHuades&. Pewarnaan 8A
digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan
asam, conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis, Micobacterium leprae,
Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium a#ium intraseluler6
Mycobacterium a#ium compleI yang tumbuh pada .,) yang menyerang sistem
imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada
-,) dan menginfeksi kulit, Aocardia, "egionella mycdatci, Fhodococcus,
Tsukamurella, 9ordonia 6 9ordona, )ryptosporidium, >sospora, )yclospora,
Sarcocytis, dll. )ontoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan 8A
tetapi cocok pada Binyoun adalah Aycordia, Fhodococcus, Tsukamurella, dan
9ordonia. ;asil pewarnaan 8A akan mengidentifikasikan + ,. akteri tahan asam
akteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah
pemberian asam alkohol. ;asilnya berwarna merah. $. akteri tidak tahan asam
;asilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh
asamalkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Sifat tahan
asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas
peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid !/%Enya tersusun atas asam mikolat&.
Gsam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas -.=%
karbon. Pewarnaan 8A terdiri dari 8AG !merah& !asic fusion, Glcohol, Jenol,
GHuades&, 8A !tidak berwarna& !;)l, 'til alcohol&, dan 8A) !biru& !Methylen
blue, GHuades& !Madigan, $%%-&.
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai
berikut+ pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial !pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam&, pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu +
pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk
melihat komponen lain dan bakteri !pewarnaan Aeisser !granula #olutin&,
pewarnaan yodium !granula glikogen& dan pewarnaan negatif !9o(ali, $%%=&
9ambar $., Pewarnaan Sederhana !9o(ali, $%%=&
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan !tembus pandang&. Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak
mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia,
maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina !;adiotomo, ,==%&
9ambar $.$ Pewarnaan Aegatif !;adiotomo, ,==%&
9ambar $.- Pewarnaan 9ram !:ason, $%%=&.
'ndospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa
jenis bakteri. Struktur endospora sangat ber#ariasi pada setiap spesies. 'ndospora
merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim
misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam. Barena kandungan air endospora
sangat rendah bila dibandingkan dengan sel #egetatifnya, maka endospra
berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.
'ndospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa, sehingga harus
menggunakan pewarnaan spesifik. akteri yang menghasilkan spora pada
umumnya tahan terhadap pewarnaan, sedangkan bakteri yang tidak memiliki
spora dan hanya memiliki sel #egetatif tidak tahan terhadap pewarnaan !Partic,
$%%?&.
'ndosopora tidak mudah diwarnai dengan (at pewarna pada umumnya,
tetapi sekali diwarnai, (at warna tersebut akan sulit hilang. ;al inilah yang
menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode
Schaeffer-Julton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora
diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. "arutan ini
merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora.
Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup
dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora
dan warna merah muda pada sel #egetatifnya !Jardia(, ,==$&.
Bondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari
degenerasi sel #egetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang
diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek
merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan,
dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara
mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali
untuk aktif secara metabolik dan sel #egetatif berkurang resisten melalui
germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi
hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan
!Suriawiria, $%%/&.
'ndospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis
bakteri. Barena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan
sel #egetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila
dilihat di bawah mikroskop. 'ndospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna
biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan
adalah malachite green.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai
organisme. Bebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil !suka akan basa&. 8at-(at warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin !komponen
kromofornya bersifat positif&. Pewarnaan sederhana ini memungkinkan
dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi !coccus, #ibrio,
basillus, dsb& dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai
!;adiotomo, ,==%&.
akteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah
diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat
senyawa pewarna. 1ntuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut !misalnya safranin&
sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama.
Gkhirnya warna bakteri spora adalah hijau. akteri yang tidak berspora cenderung
tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel #egetatif. Saat diwarnai oleh
malachite, sel #egetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah
dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan
safranin, sel #egetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil
pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin !Gssani, ,==.&.
BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 W$)%, 0$* T'12$%
Praktikum mengenai KPewarnaan Sel !akteri dan :amur& dan Pewarnaan
'ndosporaL dilaksanakan pada hari Bamis ,/ Gpril $%,% pada pukul ,-.%% 5
,0.-/ 3>, bertempat di "aboratorium Mikrobiologi, :urusan iologi, Jakultas
Matematika dan >lmu Pengetahuan Glam, 1ni#ersitas rawijaya, Malang.
3.2 3$&$ K'&-$
3.2.1 P'14,$%$* A2,5$*
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E,
kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali
pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang
telah terdapat aHuades steril sebanyak satu kali yang pengambilannya dengan
jarum ose. Bemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Preparat apusan siap
diwarnai dan diamati.
3.2.2 T')*6) P'7$&*$$* G&$1
Gpusan dicat dan digenangi dengan cat gram G selama , menit, cat
dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.
Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram selama , menit, cat dibuang
lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah
kering, apusan ditetesi dengan cat gram ) selama -% detik, cat dibuang lalu
preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering,
apusan digenangi dengan cat gram D selama , menit, sisa cat dibuang lalu
preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Bemudian
preparat siap diamati dibawah mikroskop
3.2.3 K8*.6&1$56 H$56( 3$% G&$1 D'*+$* KOH
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E,
kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan
diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan BO; sebanyak satu jarum
ose. Bemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose diangkat
beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak.
3.2.4 P'7$&*$$* E*08528&$
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E,
kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali
pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang
telah terdapat aHuades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.
Bemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Selanjutnya gelas obyek
dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring
dan ditetesi dengan malakit hijau selama ,% menit. Setelah itu dinginkan preparat
sebentar, selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Bemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama , menit, di cuci
dengan air mengalir. Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di
bawah mikroskop, endospora akan tampak berwarna hijau dan sel #egetatif akan
tampak berwarna merah.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 A*$(65$ P&85'0,&
4.1.1 P'14,$%$* A2,5$*
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E
agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn
apusan, kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak
satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis, agar tidak terdapat
mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan diletakkan di
atas kaca obyek yang telah terdapat aHuades steril sebanyak satu kali pengambilan
dengan jarum ose. Bemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri
yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak !Madigan, $%%-&.
4.1.2 T')*6) P'7$&*$$* G&$1
Gpusan dicat dan digenangi dengan cat gram G selama , menit, cat
dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan,
agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna yang lain yang akan
digunakan !1msl, $%%?&. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram
selama , menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan
selanjutnya dikeringkan. )at gram akan menguatkan ikatan antara pewarna
dengan dinding sel bakteri. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram )
selama -% detik, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan
selanjutnya dikeringkan. )at gram ) akan melarutkan warna sebelumnya, apabila
preparat bakteri merupakan gram negati#e, maka preparat akan berwarna bening.
Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram D selama , menit, sisa cat
dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.
Bemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. akteri gram negati#e akan
berwarna kemerahan, sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu.
4.1.3 K8*.6&1$56 H$56( 3$% G&$1 D'*+$* KOH 39
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E
agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan,
kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan
diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan BO; sebanyak satu jarum
ose, konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau
positif. Bemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose
diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau
tidak. :ika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram
negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram
positif !1msl, $%%?&.
4.1.4 P'7$&*$$* E*08528&$
9elas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol *%E
agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan,
kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali
pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang
telah terdapat aHuades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.
Bemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan digunakan
mati namun organ dan struktur tidak rusak. Selanjutnya apusan bakteri dengan
pewarna malakit hijau, masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan,
gelas obyek dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih
hingga timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi
dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau dan
agar endospora tidak mati !menjaga agar tetap lembab !tidak kekeringan&& selama
,% menit, agar endospora dapat berkembang !memudahkan pengamatan&. Setelah
itu dinginkan preparat sebentar, selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir
dan dikeringanginkan. Bemudian genangi preparat dengan pewarna safranin
selama , menit, di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna
dengan baik. Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah
mikroskop, endospora akan tampak berwarna hijau dan sel #egetatif akan tampak
berwarna merah !Scienceprofonline, $%%?&.
4.3 D$%$ H$56( P'*+$1$%$*
Tabel ,. Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora
N8 I58($% )'( B'*%,) G&$1 P'&4'5$&$* U-6 KOH 39 E*08528&$
B.subtilis
, P ,.- , asil - ,%%%I Gda Gda
$ asil - ,%%%I Gda Gda
$ AP ,., - asil @ ,%%%I Tidak ada Gda
. asil @ ,%%%I Tidak ada Gda
- AP -.$. / asil - ,%%%I Gda Gda
0 asil - ,%%%I Gda Gda
. P ?., * asil - ,%%%I Gda Gda
? asil - ,%%%I Gda Gda
Tabel $. Data hasil pewarnaan kapang
N8 I58($% K'(8128) S28&$ S28&$*
+6,1
H6.$ S28&$*
+68.8&
, BAP 0., , entuk + ulat Gda Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Gda
1jung + Tumpul
:enis + Satu
$ entuk + ulat Gda Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Gda
1jung + Tumpul
:enis + Satu
$ BP /.- - entuk + ulat Tidak
ada
Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Tidak
ada
1jung + Tumpul
:enis + Satu
. entuk + ulat Tidak
ada
Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Tidak
ada
N8 I58($% K'(8128) S28&$ S28&$*
+6,1
H6.$ S28&$*
+68.8&
1jung + Tumpul
:enis + Satu
- BP .., / entuk + "onjong Tidak
ada
ersekat, cabang,
rapat
Tidak
ada
1jung + "ancip
:enis + Dua + esar
dan Becil
0 entuk + "onjong Tidak
ada
ersekat, cabang,
rapat
Tidak
ada
1jung + "ancip
:enis + Dua + esar
dan Becil
. BP /.,. * entuk + ulat Gda Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Gda
1jung + Tumpul
:enis + Satu
? entuk + ulat Gda Tidak bersekat,
cabang, tidak
rapat
Gda
1jung + Tumpul
:enis + Satu
4.3 A*$(65$ H$56(
Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate P ,.-, AP -.$ dan
P ?., merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada
mikroskop dengan perbesaran ,%%%I. Preparat AP ,., merupakan bakteri gram
positif, namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan kurang telitinya
praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Pewarnaan endospora menggunakan
bakteri Bacillus subtilis, dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai
dengan warna hijau.
Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa
terdapat #ariasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat
dan lonjong, ujung tumpul dan lancip, terdiri atas satu macam atau dua macam
spora. Gda yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak mempunyai
sporangium. ;ifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat, ada pula hifa
yang bersekat dengan cabang rapat. Gda yang memiliki sporangiofor dan ada pula
yang tidak memiliki sporangiofor.
akteri dan kapang, baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar
pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan
yang telah dilakukan. ;al ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi
yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar maupun yang tidak
tercemar.
Pada pewarnaan 9ram yang dilakukan digunakan gram G, gram , gram
), dan gram D. 9ram G merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal #iolet $
gram, etil alkohol =/E $% ml, ammonium oksalat %,? gram, aHuades ?%ml. Bristal
#iolet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia )
,?
;
,/
A
-
O
-
, bukan merupakan
bahan kimia berbahaya, dan biasa digunakan dalam teknik pewarnaan microscopy
)ertistain !Merck, $%%*&. 9ram merupakan merupakan cat yang terdiri dari
campuran yodium , gram, kalium yodida $ gram, akuades -%%ml. 9ram
merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas
pengikatan (at warna oleh bakteri sehingga pengikatan (at warna oleh bakteri
lebih kuat, memperjelas warna dari (at warna tersebut, mempersulit pelarutan (at
warna. Pada pewarnaan gram , penambahan larutan mordan menyebabkan
terbentuknya persenyawaan kompleks kristal #iolet-yodium. Tanpa penambahan
larutan mordan, (at warna kristal #iolet akan larut saat penambahan larutan
pemucat. 9ram ) merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton /%ml dan etil
alkohol =/E/%ml. 9ram ) merupakan larutan pemucat . larutan pemucat
berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negati#e yang
akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut
persenyawaan kristal #iolet-yodium. 9ram D merupakan cat yang terdiri dari
campuran safranin %, $/ gram , etil alkohol =/E ,%ml, dan akuades =%ml.
Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri
positif karena persenyawaan kompleks kristal #iolet-yodium tetap terikat pada
dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan
warna bakteri berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh
kristal #iolet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin
dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau (at pewarna kedua berfungsi sebagai
pembeda terhadap (at warna kristal #iolet !"ay, ,==.&.
Tabel -. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri 9ram positif dan
bakteri 9ram negatif !Jil(aha(ny, $%%?&
N8. P'&4'0$$* B$)%'&6 G&$1 P856%6.
:;<
B$)%'&6 G&$1 N'+$&6. :=<
1 Dinding sel "apian peptidoglikan
tebal
"apian peptidoglikan lebih
tipis
2 Badar lipid ,-.E !"ebih rendah& ,,-$$E !"ebih tinggi&
3 Fesistensi terhadap alkali
!,E BO;&
"ebih pekat "arut
4 Bepekaan terhadap Modium "ebih peka Burang peka

Toksin yang dibentuk 'ksotoksin 'ndotoksin

> Fesistensi terhadap tellurit "ebih tahan "ebih peka
7 Sifat tahan asam Gda yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam
? Bepekaan terhadap
penisilin
"ebih peka Burang peka
" Bepekaan terhadap
streptomisin
Tidak peka Peka
1# Penghambatan warna "ebih dihambat Burang dihambat
11 Betahanan terhadap fisik "ebih tahan Burang tahan
12 Bebutuhan nutrient Bompleks Felatif
'ndospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres
karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di
lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Bomponen endospora mempunyai
resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari cross-
linked keratin. >dentifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi, dan
ukuran endospora. eberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada
sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya.
"etak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk
identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral
atau tengah merupakan lokasi dari sel #egetatif yang letaknya tepat di tengah.
Tipe terminal memiliki pengertian letak sel #egetatif diantara ujung dan pinggir
dari sel #egetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah
dan pinggir dari sel #egetatif. 'ndospora dapat berukuran lebih besar ataupun
kecil dari sel #egetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin.
Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur
pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. 'ndospora
merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi.
)ontohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal
!Scienceprofonline, $%%?&.
Bomposisi dari "actophenol )otton lue yaitu kristal, cotton blue %,%*/ g
berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang, asam laktat $% ml yang
berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam struktur kapang,
gliserol .% ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga sel terhadap
kekeringan, kristal fenol @ air panas *%
o
) untuk membunuh jamur, dan air suling
.% ml !3aluyo, $%%*&.
Belebihan dan kekurangan pengecatan gram !Airwati, $%%,&+
Belebihannya adalah+ pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk
memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab
infeksi !kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik&. ;al ini dikarenakan
bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap
berbagai jenis antibiotika. Badang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat
gram mempunyai makna dignostik. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan
gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus !nana&, uretral, maka
memberikan presumpti#e diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro.
Bekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme
dalam jumlah banyak yakni lebih dari ,%. ml per ml. Sampel yang cair dengan
jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan
prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut.
Pellet !endapan hasil sentrifuge& kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa
secara mikroskopis.
BAB V
PENUTUP
.1 K'5612,($*
Teknik pembuatan sediaan apusan !preparat& dapat dilakukan dengan
mensuspesikan biakan bakteri dengan aHuades, kemudian difiksasi. Pewarnaan
terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan 9ram dan 8iehl
Aelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan
karakteristik bakteri. Pewarnaan 9ram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi.
Prosedur pewarnaan 9ram dimulai dengan pemberian kristal #iolet, setelah itu
ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu
ditambah alkohol. akteri 9ram positif membentuk kompleks Bristal iodine yang
berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri 9ram positif akan berwarna
ungu. 'ndospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres
karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di
lingkungan sampai kondisi menjadi baik. "etak endospora yang berbeda diantara
spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi, tipe utama diantaranya ialah
terminal, subterminal dan sentral.
DAFTAR PUSTAKA
Gssani, S. ,==.. Mikrobiologi Bedokteran. Jakultas Bedokteran 1ni#ersitas
>ndonesia, :akarta.
)appuccino, :. 9. 7 Aatalie. S. ,=?-. Microbiology G "aboratory Manual.
Gddison-3esley Publishing )ompany, Aew Mork.
Jardia(, S. ,==$. Mikrobiologi Pangan >. 9ramedia. :akarta
Jil(aha(ny., $%%?, , http+6wordpress.com6Penganta-tentang-bakteri.htm. Diakses
pada tanggal $0 Gpril $%,%
9o(ali. Gmir. $%%=. Pewarnaan gram.
http+66www.go(ali.blogspot.com6gram6pewarnaan-gram-prinsip.html .
Diakses pada tanggal $0 Gpril $%,%
;adiotomo, Fatna Siri., ,==%. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. :akarta + Pt
9ramedia.
:ason. $%%=. The 9ram Stainning. http+66astro.temple.edu6Njasoncg6>D6
microreporting.htm. Diakses pada tanggal $0 Gpril $%,%
"ay, .3. ,==.. Gnalisis Mikroba di "aboratorium. PT Faja 9rafindo Persada.
:akarta.
"e#ine, M. $%%%. Gn >ntroduction to "aboratory TechniHue in acteriology.
McMillan )ompany, Aew Mork.
Madigan, M.T. $%%-. rock iology of Microorganism. Pearson 'ducation, inc.
1nited State of Gmerica.
Merck . $%%*. )resyl Ciolet Gcetate. http+66www.merck-chemicals.co.id6cresyl-
#iolet-
acetate6MDGO);'M,%/$-/6pO(yOb.s,"8b%GGG'38u'fChTlPsidQ$2f
;8ap1l2;;d==-
#TSj/p)nF'Gl0=;lgS;hO$)nF'Gk3H29g:)C99. diakses pada
tanggal $0 Gpril $%,%
Airwati, ;era. $%%,. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk
praktikum mikrobiologi Jakultas kedokteran 1ni#ersitas 9adjah Mada.
1ni#ersitas 9adjah Mada press. Mogyakarta.
Partic, "i. $%%?. Pewarnaan endospora. http+66www.dunia-
mikro.blogspot.com6$%%?6%?6pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal
$0 Gpril $%,%
Pelc(ar, M. :., )han, '.).S. $%%*. 'lements of Microbiology. Mc 9raw ;ill ook
)ompany. Aew Mork.
Suriawiria, 1. $%%/. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. :akarta.
Sutedjo, M. ,==,. Mikrobiologi Tanah. Fineka )ipta. :akarta.
Tracy. $%%/. 9ram Staining. www.tracy.k,$.ca.us6thsad#bio6pdfs6gram
E$%stain.pdf. Diakses pada tanggal 26 April 2010
1msl. $%%?. Staining acteria.
www.umsl.edu6Nmicrobes6pdf6stainingbacteria.pdf. Diakses pada tanggal
26 April 2010
Colk 7 3heeler. ,==-. Mikrobiologi Dasar. Penerbit 'rlangga. :akarta