GuiaTP FM2012

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Fitopatologa
Molecular
Gua de Trabajos Prcticos 2012

Docentes responsables e invitados:

Adrin Vojnov (F. Pablo Cassar)
Alejandro Mentaberry (FCEN)
Ana Julia Distfano (INTA, FCEN)
Andrea Puebla (INTA)
Carolina Martnez (INTA, FCEN)
Cecilia Rodrguez (INTA)
Cecilia Vzquez Rovere (INTA)
Daniela Tosto (INTA, FCEN)
Eduardo Wright (FAUBA)
Gabriela Conti (INTA)
Guillermo Maroniche (INTA)
Jos M. Estvez (FCEN)
Lorena Ingala (INTA)
Mara Jos Diguez (INTA)
Marisa Lpez Bilbao (INTA)
Natalia Almasia (INTA)
Paula Fernndez (INTA)
Ruth Heinz (INTA, FCEN)
Sebastin Asurmendi (INTA)
Silvia Lpez (FCEN)
Viviana Barrera (INTA)
Fitopatologa Molecular
Agosto 2010
2
Referente a la permanencia y desarrollo del curso:
El uso de guardapolvo es obligatorio en las reas de labora-
torio y prohibido en las reas de comedor y administrativa. Los
alumnos debern traer sus propios guardapolvos.
El uso de guantes descartables (sern provistos) es obliga-
torio al momento de realizar los experimentos pero debern
descartarlos al salir del laboratorio y/o al operar las compu-
tadoras afectadas a los equipos.
No est permitido ingresar con alimentos o bebidas a los
laboratorios ni a la sala de tericos ni a la de computadoras.
Est prohibido fumar en todas las reas del instituto.
Los alumnos debern usar calzado cerrado adecuado.
En las guas de cada trabajo prctico se detallan cuales
reactivos sern manipulados solamente por los docentes y
ayudantes a cargo. Prestar especial atencin a estas notas.
El uso del equipamiento de laboratorio se realizar sola-
mente con supervisin de los docentes y ayudantes a cargo.
Todos los solventes se manipularn solamente bajo campa-
na.
Los tips y tubos epps usados se descartan en botellas de
plstico rotuladas para tal fin.
Todos los elementos personales (por ejemplo: abrigos,
mochilas, carteras, etc.) no deben ser ingresados a los laborato-
rios.
Es fundamental lavarse las manos antes de ingresar y al
salir de los laboratorios.
Si bien es potable, se recomienda no beber agua de las
canillas de los laboratorios. Usar los dispensadores que estn
en los pasillos.
Los alumnos podrn traer sus propias computadoras (no-
tebooks) para los trabajos prcticos que lo requieran.
A fin de una mejor orientacin de los alumnos, se incluyen
en esta gua un esquema de la planta del edificio donde se
desarrollar el curso indicando las aulas y laboratorios para tal
fin.

I nformacin adicional acerca de los laboratorios de TP y aula
de tericos en el I nstituto de Biotecnologa.
Se solicita permanecer en el auditorio o laboratorio destinado a
las clases del presente curso durante los horarios establecidos.
A los efectos de una mejor ubicacin en el Instituto se reco-
mienda consultar el esquema de la planta del Instituto.
Cronograma tentativo
Martes 10 de julio
8.30- 8.45 hs Introduccin general y presentacin de los alum-
nos
9.00 13.00 hs Conceptos bsicos de Fitopatologa (Silvia
Lpez)
13.30 14.30 hs B. molecular de virus (Esteban Hopp)
15.00 17.30 hs PCR Diagnstica/PCR en tiempo real (Caro-
lina Martnez)
Jueves 12
8.30-12.30: Introduccin terica al TP Virologa molecular
(Ana Distfano y Carolina Martinez)
y TP Virologa molecular: PCR diagnstica del CLRDV (Ana
Distfano y Carolina Martinez)
13.30 15 hs TP Virologa molecular: corrida de geles para
diagnstico de CLRDV (Carolina Martinez)
15.30 -17.30 hs Secuenciacin de genomas virales (Ana Dist-
fano)
Sbado 14
10 - 12:30 hs Introduccin a la Agrobiotecnologa y su Aplica-
cin a la Fitopatologa (Alejandro Mentaberry)
13.00- 14.30 Genmica aplicada al estudio de poblaciones de
fitopatgenos: Marcadores Moleculares (Esteban Hopp)
15 - 17:30 hs Mtodos de cultivo de tejidos y transformacin
vegetal (Alejandro Mentaberry)
Martes 17
8.30 11 hs Elementos de Bioinformtica aplicada a la Fitopa-
tologa (Paula Fernandez)
11.30 -13.00 hs Rol de la pared celular como mediador de la
interaccin planta-hongo patgeno (Jose M. Estevez)
13.30 -17.30 TP Bioinformtica: herramientas para anlisis de
secuencias virales. Consultas en Bases de datos (Carolina Mar-
tinez, Ruth Heinz)
Jueves 19 (en INTA)
8.30 10.30 Epidemiologa molecular (Lorena Ingala, Mara
Jos Diguez) (I. de Gentica)
10.30 12.30 Evaluacin de variabilidad gnica de roya de la
hoja del trigo (Lorena Ingala, Mara Jos Diguez) (I. de Gen-
tica)
13.30 15.00: Tcnicas de secuenciacin (Andrea Puebla)
15.00-16.30: Visita al secuenciador y TP de anlisis de secuen-
cias genmicas (Andrea Puebla)
Sbado 21
10 a 12:30 hs: Estrategias biotecnolgicas de resistencia a virus
(Alejandro Mentaberry)
13.30 15.30 Biologa molecular de la interaccin H-P. Silen-
ciamiento, microRNAs (Sebastin Asurmendi)
15.30-17.30 Presentacin de los temas de trabajo de los alum-
nos y Seminarios bibliogrficos dados por los alumnos del
curso que sean de Castelar (tendrn los papers con anticipa-
cin)
Martes 24
9.00 -11.00 Introduccin al anlisis de diversidad (Vernica
La)
11.30 -12.30 hs TP Marcadores y bioinformtica: anlisis
bioinformtico (D. Tosto, Cintia Acua)
13.30 15.00: Introduccin terica al TP
de Streptomyces (Viviana Barrera, C. Martnez)
15.00-17.30: Extraccin de ADN a partir de tubrculos de
papa infectados con Streptomyces (Viviana Barrera, Carolina
Martinez)
Jueves 26
8.30-10.30 hs: Biologa molecular de hongos fitopatgenos
(Natalia Almasia)
10.30 12.30 TP Streptomyces, PCR (Viviana Barrera, Caro
Martinez)
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13.30 -14.30 hs: TP Streptomyces, Siembra geles y corrida
(Viviana Barrera, Caro Martinez)
14.30 -17.30: Discusin resultados TP Streptomyces (V. Barre-
ra, Caro Martinez)
Sbado 28
10 a 12:30 hs: Estrategias biotecnolgicas de resistencia a
hongos (Alejandro Mentaberry)
Seminarios de alumnos
Martes 31 (INTA)
8.30 - 9 30: Introduccin al TP Silenciamiento Gnico (Gabrie-
la Conti)
9.30 12.30: TP Silenciamiento gnico (1ra parte) Agroinfil-
tracin (Gabriela Llauger, Gabriela Conti, Cecilia Rodrguez)
13.30-15.30 Biologa molecular de la interaccin H-P (Gabrie-
la Conti)
Jueves 2 de agosto (Fundacin Pablo Cassa-
r, http://www.fundacioncassara.org.ar/?es/investiga/lic/fitopat
olo/)
Visita al Laboratorio de Fitopatologa Molecular de la Funda-
cin Pablo Cassar
Biologa molecular de bacterias fitopatognicas (Adrin
Vojnov)
Respuestas de crecimiento y desarrollo a la infeccin por pa-
tgenos - Interaccin con hormonas y luz (Gustavo Gudesblat)
Sbado 4
10 a 12:30 hs: estrategias biotecnolgicas de resistencia a bac-
terias (Alejandro Mentaberry)
Seminarios de alumnos
Martes 7
8.30 10.30 Transcriptmica (Ruth Heinz)
10.30 12.30 Mejoramiento gentico para resistencia a enfer-
medades, Mapeo de Asociacin (Esteban Hopp).
13.00 Seminarios
Jueves 9 (INTA)
11 12.30 Metabolmica (Ruth Heinz)
13.30 14.30 TP Silenciamiento gnico (2a parte): anlisis
plantas (Carlos Manacorda, Gabriela Conti, Cecilia Rodrguez)
14.30 -16.30 Visita al IMyZA (Viviana Barrera)
Sbado 11
10 a 12:30 hs estrategias biotecnolgicas de resistencia a insec-
tos (Alejandro Mentaberry)
Seminarios/examen integratorio

Contenido:
1 Silenciamiento
2 Secuenciacin
3 Diagnostico de virus CLRDV
4 Bioinformatica viral
5 Deteccin Streptomyces
6 Marcadores y Diversidad
7 qPCR
TP 1: Silenciamiento gnico como sistema de defensa contra virosis
Gabriela Conti, Cecilia Rodrguez
El objetivo del Trabajo Practico es demostrar el silenciamiento gnico post-transcripcional (PTGS) de un transgn a
nivel local y la supresin del mismo proceso por la actividad de una protena viral (supresor) en hojas de Nicotiana
benthamiana de genotipo silvestre (wt) y en hojas de N. benthamiana de la lnea 16C transgnicas para GFP.
Esquema general del proceso a nivel molecular

Esquema de los vectores utilizados

Preparacin de las bacterias para infiltrar
1) Estriar en una placa de LB agar con los antibiticos
apropiados las bacterias portando los distintos pls-
midos. Incubar durante dos das a 28C.
PolyA Cap
GFP mRNA
GFP
GFP RNAdc
GFP siRNAdc
GFP siRNA
P19
p35S
Transcripcin
Traduccin
pBin61-GFP
pBic- dsGFP
pBin61-HcPro
Con estos plsmidos:
pBin61-GFP
pBic-dsGFP Kan
R
50 ug/ml
pBin61-HcPro
se transforma Agrobacterium thumefaciens
GV3101 Rif
R
100 ug/ml, Gent
R
40 ug/ml

GFP/dsGFP/P19 LB
RB
Ntp II
Ntp II
p35S
pnos
ori V
t35S
tnos
pBin61/pBic
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LB agar + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50
ug/ml
2) Inocular con una colonia aislada 3 ml de LB lquido
en un tubo de cultivo con los antibiticos apropia-
dos.
Incubar con agitacin (200 r.p.m) a 28C ON.
LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml
3) Inocular con los 3 ml del cultivo obtenido 30 ml de
LB lquido e incubar con agitacin (200 r.p.m) ON a
28C.
LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml
Acetosiringona 20 M
4) Centrifugar el cultivo de bacterias durante 10 minu-
tos a 4.000 r.p.m y a 4C. Resuspender las bacterias
en Solucin de MES. Llevar a OD
600
=1. Incubar las
bacterias a temperatura ambiente al menos durante 2
horas (puede ser ON). Para las co-infiltraciones se
realizan mezclas de partes iguales de la agrobacte-
rias portando los distintos plsmidos.
Solucin de MES + acetosiringona 100 M
Nota: Al resuspender las bacterias con la solucin
de MES utilizando el mismo volumen que el de LB
utilizado para crecerlas (en este caso 30 ml) se ob-
tiene una suspensin bacteriana de OD600 1.
5) Agroinfiltrar hojas en la cara abaxial con la suspen-
sin bacteriana utilizando una jeringa.

Material Vegetal
Plantas de N. benthamiana wt y de la lnea 16 C de apro-
ximadamente un mes de edad. Deben ser plantas saluda-
bles en etapa vegetativa de un estado intermedio de desa-
rrollo.
Esquema de agroinfiltracin (Expresin de GFP vista al
UV despus de 4 das post-agroinfitlracin)

Medios, soluciones necesarias y antibiticos necesarios
LB
Extracto de levadura 5 g/L
Bactotriptona 10 g/L
NaCl 10 g/L
Agua csp 1 L
Ajustar a pH 7,5 con NaOH 5 M
LB Agar: Agregar a 1L de LB
Solucin de MES
MES (cido N-morpholinoetanesulfonico) 10 mM
MgCI
2
10 mM
Agua bidestilada
Autoclavar la solucin.
Rifampicina [100 mg/ml]
Disolver 100 mg de rifampicina en 1 ml de Metanol, esterili-
zar la solucin por filtrado (filtro de 0,22 micrones). Consevar
a -20C (la rifampicina es fotosensible por lo que es convenien-
te envolver el eppendorf con papel de aluminio)
Gentamicina [25 mg/ml] y kanamicina [50 mg/ml]
Disolver la cantidad adecuada
de antibitico en agua bidesti-
lada, esterilizar la solucin por
filtracin y conservar a -20C.
Acetosiringona [200 mM]
Disolver 40 mg de acetosiringona en 1 ml de DMSO. Conser-
var a -20C.

Referencias
Vazquez Rovere, C.; Bazzini, A.; Rodrguez, C.; Almasia, N;
Asurmendi, S. Mtodos para generar y analizar diversidad. Usos del
Silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos.
En: Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II - V. Echenique, C.
Rubinstein, E. Hopp y L. Mroginski (eds), Editorial INTA, 2010, en
prensa.
Bazzini A.A, Mongelli V.C, Hopp H.E, Del Vas M, Asurmendi S
(2007) A practical approach to the understanding and teaching of
RNA silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10 (2),
178-190.
TP N 2: Secuenciacin por Electroforesis Capilar de Fragmentos Fluorescentes
pBin61-GFP
+
pBic-dsGFP

pBic- dsGFP
N. benthamiana
wt

pBin61-GFP
+
pBic-dsGFP
+
pBin61-HcPro

pBin61-GFP

pBin61-GFP
+
pBin61-HcPro

pBic- dsGFP
N. benthamiana
16C

pBic-dsGFP
+
pBin61-HcPro

pBin61-GFP

Tejido expresando GFP

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Andrea Puebla
Las estrategias de secuenciacin basadas en el mtodo
de terminacin de la cadena por incorporacin de nu-
cletidos dideoxi (ddNTPs) desarrollado por Sanger
mas de 30 aos atrs han sufrido un proceso de cambio
y superacin continuo desde la deteccin de molculas
radioactivas en geles hasta la actual deteccin fluores-
cente mediante secuenciacin en paralelo en microcapi-
lares o las estrategias de secuenciacin en fase slida
basada en chips (Tabla 1). La incorporacin de siste-
mas de deteccin fluorescerente en la dcada del 80
permiti el inicio de la secuenciacin genmica y la
entrada, en la dcada del 90, en la era genmica, con los
reportes de los primeros genomas completos de E.coli y
C. elegans y el inicio del proyecto Genoma Humano
cuyo borrador fue liberado en 2001 y finalizado ofi-
cialmente en Abril 2003.
El desarrollo de secuenciadores automticos basados en
electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los
sistemas de deteccin fluorescentes y el desarrollo de
herramientas de anlisis de secuencias a gran escala
posibilitaron el desarrollo de estrategias de secuencia-
cin mas eficientes con el consiguiente abaratamiento
de costos unitarios, y el concomitante desarrollo de
nmeros proyectos de genomas de organismos comple-
jos. Hoy, con la difusin de mas de 1000 genomas
completos de diversos organismos
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio
de otros tantos, con mas de 150 billones de pares de
bases depositadas en GenBank, estamos transitando la
era post genmica, iniciada a mediados de la dcada del
2000. Actualmente el nfasis esta puesto no solo en la
secuenciacin de genomas de especies aun no descifra-
dos total o parcialmente sino en la resecuenciacin de
genomas conocidos, para la identificacin de variantes
allicas asociadas a diversidad fenotpica, en distintas
especies de importancia econmica, con importantes
avances para el genoma humano (The International
HapMap Consortium, 2003, 2005; The ENCODE Pro-
ject Consortium, 2004). Esto es posible gracias al desa-
rrollo de diferentes tecnologas e instrumental en conti-
nuo proceso de actualizacin (ver ej. en Tabla 1).
La secuenciacin capilar con equipos como el Applied
Biosystems Incorporated (ABI) 3130 que se utilizar en
esta prctica, permite la lectura simultnea de distintas
muestras (16, para este equipo), con muy buena resolu-
cin y lecturas largas de hasta 800 bp, utilizando distin-
tos fluorforos. Los fluorforos mas comnmente usa-
dos son los basados en el colorante rhodamine (R110,
REG, TAMRA and ROX) que son excitados a una lon-
gitud de onda de 488 nm y emiten fluorescencia a dis-
tintas longitudes de onda (Figura 1a).
ABI desarroll un sistema de terminadores llamados
Big Dye terminators que son utilizados en la secuen-
ciacin automtica (Figura 1b)

Parte A: Ensayo de secuenciacin de ADN con Ter-
minadores fluorescentes y secuenciador
automtico
Objetivo:
Cuantificar ADN por fotometra y fluorometra
(Spectra Max Gemini EM)
Realizar una reaccin de secuenciacin de ADN uti-
lizando diferentes templados (plsmidos, productos
de PCR y BAC/COS).
Purificar por precipitacin las reacciones de secuen-
ciacin.
Preparar las muestras manualmente y con estacin
de trabajo para anlisis en secuenciador automtico.
Realizar la electroforesis capilar de los productos de
secuenciacin en secuenciador automtico (Genetic
Analyzer 3130xl, Applied Biosystems)
Materiales:
ADN (distintos templados).
Iniciadores universales y especficos para cada templado
particular.
Fluorforo para cuantificacin por fluorometra (Hoechst en
buffer TNE)
ADN control de timo de ternera para la curva estndar.
Kit de secuenciacin con terminadores fluorescentes (Big
Dye Terminador v3.1, Applied Biosystems).
EDTA 125 mM, etanol absoluto y etanol 70% para precipita-
cin.
Formamida HiDi.
Polmero comercial para la electroforesis capilar de fragmen-
tos de ADN.
Buffer con EDTA para electroforesis capilar.
Equipamiento:
Espectrofotmetro:
Nanodrop ND-1000 (Thermoscientific).
Espectrofluormetro: Spectra Max Gemini EM.
Termociclador de 96 pocillos: GeneAmp PCR system 9700
(Applied Biosystems)
Sistemas automatizados para manejo de lquidos: Biomek FX
(Beckman Coulter).
Secuenciador automtico de 16 capilares: Genetic Analyzer
3130xl (Applied Biosystems)
Equipamiento general de biologa molecular
Actividades
Figura 1a
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1) Cuantificacin
de ADN

Tipo de templados
y concentracin
requerida:
Templado Concentracin
Productos de PCR
100-200 pb 5 ng/ul
200-500 pb 15 ng/ul
500-1000 pb 30 ng/ul
1000-2000 pb 60 ng/ul
mayor a 2000 pb 75 ng/ul
ADN doble cadena 200 ng/ul
ADN simple cadena 100 ng/ul
BAC/Csmidos 200 ng/ul

2) Reaccin de secuenciacin y purificacin
Preparacin de la Mix de seq
Reaccin X Volmen
BDT v3.1 1 ul
5 x Seq Buffer 1.5 ul
Primer 5 mM (5 pmol)
Templado (conc. vs) 2ul
Agua calidad ultrapura hasta 10ul VF

Elongacin en termociladores
96C 1 min.
25 ciclos
96C 10 seg.
50C 5 seg.
60C 4 min.
Purificacin por precipitacin
Agregar: 2,5 l EDTA 125mM + 30 l Etanol absoluto.
Centrifugar 45 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centr-
fuga de placas. Eliminar solventes por inversin.
Agregar: 120 l Etanol 70%.
Centrifugar 15 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centr-
fuga de placas. Eliminar solventes por inversin.
Secar precipitados a 37C por 30 min.
3) Preparacin de muestras para electroforesis en se-
cuenciador automtico con sistemas automatizados
para manejo de lquidos

TABLA 1 (adaptada de Mitchelson et al 2007. En: New High
throughthput Technologies for DNA sequencing and Ge-
nomics. Ed K. Mitchelson , Elservier, UK)

Curva Std Promedio
[cc] F
15 19
27 106
57 193
116 428
150 542
215 842
305 1197
Cuant HOECHST - SEQ#08y09 - 20/01/2009
y = 0,2591x
R
2
= 0,9954
0
50
100
150
200
250
300
350
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
F
c
c
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Electroforesis capilar en secuenciador automtico con
sistemas automatizados para manejo de lquido
PARTE B: Anlisis de Secuencias de ADN utilizan-
do el programa Sequencing Analysis 5.1
Sequencing Analysis
Objetivo: Analizar los resultados de las corridas elec-
troforticas de secuencias de ADN provenientes de
distintos tipos de templados, editar los resultados obte-
nidos y discutir la calidad de los mismos.
Materiales:
Archivos de las corridas electroforticas de secuencias
de ADN realizadas en el secuenciador autmatico ABI
3130 xl con el programa Data Collection 3.0 (CD).
Computadora con el programa Sequencing Anlisis 5.1
Actividades
PROYECTO 1
1. Adicionar muestras al programa en Sample
Manager.
2. Setear Analysis Protocol para este proyecto:
a. General:
Nombre
Seq File Format: Write Stand-
ard Chromatogram Format
File
b. Basecalling:
a. KB.bcp
b. POP7.BDTv3.m
ob
c. True Profile
d. Ending base: Af-
ter 1000bp
e. Quality Thresh-
old: Do not as-
sign Ns to
Basecalls.
c. Mixed Bases: Desactivado
d. Clear Range: Desactivado

3. Apply to all Samples Done

4. Indicar analisis de Base Calling (BC)

ANALIZAR

5. Revisar:
Raw
EPT
Annotation:
o Sample Name
o Capillary
o Bases detected
o Average Signal Intensity
o Simple Store

Sequence View: Barras de Calidad e Indice de Phred
Electropherogram View: editar bases

GUARDAR
PROYECTO 2 Y 3:
Cambiar seteo:
Base calling: Quality Threshold: Assign Ns to
Basecalls.
Mixed Bases
Clear Range
Reanalizar los datos y discutir diferencias.
1 2 3 4
C15 C15 Muestra1 Muestra9
C27 C27
Muestra2 Muestra10
C57 C57
Muestra3 Muestra11
C116 C116
Muestra4 Muestra12
C150 C150
Muestra5 Muestra13
C215 C215
Muestra6 Muestra14
C305 C305
Muestra7 Muestra15
C0 C0
Muestra8 Muestra16
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TP 3 Virologa Molecular: RT- PCR diagnstica del Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) en
plantas de algodn.
Ana Julia Distfano
Consideraciones generales
Muchas enfermedades de importancia agrcola regional
no son fcilmente diagnosticables por los sntomas pro-
ducidos, sobre todo si son subclnicos o como en el caso
de las enfermedades virales. Por otro lado, la sintomato-
loga puede variar con el fondo gentico del hospedan-
te, las condiciones ambientales y la constitucin genti-
ca del patgeno. La identificacin rpida y precisa de
los patgenos que afectan a los cultivos de inters agro-
nmico es crtica para predecir y controlar las enferme-
dades y para seleccionar plantas tolerantes o resistentes
en los programas de mejoramiento.
Para el caso de infecciones virales, en los ltimos aos
se han desarrollado y optimizado mtodos de diagnsti-
co por RT-PCR de virus pertenecientes a la familia
Luteoviridae (Singh y col., 1995, 1996, 2004)
El algodn es un cultivo regional clave en el NEA. La
enfermedad azul del algodn fue reportada en la Argen-
tina durante la campaa agrcola 1982/83 y actualmente
causa importantes prdidas econmicas en el cultivo,
limitando su productividad si no se implementan medi-
das adecuadas de control. La enfermedad es producida
por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) y el virus
es transmitido exclusivamente por fidos no siendo
posible su transmisin mecnica. El genoma del
CLRDV fue recientemente secuenciado por nuestro
grupo y se desarroll un mtodo efectivo de diagnstico
de la enfermedad permitiendo realizar un diagnstico
temprano del virus en las zonas afectadas.

Objetivo del TP: Discutir protocolos de extraccin de
ARN a partir de muestras de origen vegetal y la subsi-
guiente sntesis de ADN copia.
Realizar el diagnstico molecular del CLRDV mediante
la deteccin de secuencias propias del virus en plantas
de algodn infectadas mediante la tcnica de RT-PCR
(transcripcin reversa y posterior PCR).

Parte I: Discusin con los docentes del protocolo de
extraccin de ARN a partir de plantas del algodn y
sntesis del ADN copia (ADNc), observando los deta-
lles importantes para obtener de manera ptima
estas molculas.
Extraccin de ARN

El primer paso en el diagnstico basado en tcnicas de
deteccin a nivel de ARN es la purificacin de esta
molcula de los otros componentes de la muestra
(ADN, protenas, etc). Los sistemas de purificacin de
ARN a partir de tejidos permiten la obtencin de un
RNA de gran pureza e integridad.
Partimos de dos grupos de plantas de algodn: no infec-
tadas (sanas) y plantas con sntomas de infeccin por el
CLRDV (infectadas). Ver Figura 1.

Figura 1: Plantas sanas de G. hirsutum cv Banda 56
(izquierda) comparadas con plantas de la misma edad
inoculadas con el fido que presentan sntomas tpicos
de enfermedad azul (derecha).

La mayora de los protocolos de extraccin de ARN
involucran en general 4 etapas bsicas:

1) Se aplica algn tipo de maceracin mecnica
para romper las paredes y membranas celulares del
tejido. La maceracin de tejido fresco se hace en pre-
sencia de nitrgeno lquido.
2) El tejido se resuspende en el buffer de extrac-
cin para la lisis del mismo y la solubilizacin de las
membranas lipoproticas y desnaturalizacin de las
protenas, en tanto que el ARN es protegido de la ac-
cin de enzimas degradativas.
3) La suspensin se somete a una extraccin con sol-
ventes orgnicos, como Fenol cido (ph 4,5) y cloro-
formo, y las fases orgnica y acuosa se separan por
centrifugacin. En esta extraccin, lpidos, protenas, la
mayora de los polisacridos y el ADN quedan reteni-
dos en la fase orgnica en tanto que el ARN y algunos
polisacridos quedan en fase acuosa. A la fase acuosa
obtenida en la etapa anterior se le adiciona alcohol (eta-
nol o isopropanol). El ARN en presencia de alcohol
forman un precipitado, que a veces es visible, que pue-
de ser sedimentado por centrifugacin. A este precipi-
tado luego se lo lava con alcohol para eliminar las sales
remanentes.
4) En la ltima etapa, el ARN es resuspendido en agua
MiliQ libre de RNAsas (agua con Dietil Pirocarbonato).

Protocolo de extraccin de ARN utilizando TRIZOL
Minipreparacin de ARN en microtubos de 1,5 ml a
partir de 100 mg de tejido de hojas de plantas de algo-
dn sanas e infectadas con CLRDV.
1) Colocar el tejido en un mortero (previamente en-
friado con nitrgeno lquido), agregar nitrgeno l-
quido y moler el tejido hasta que est pulverizado.
2) Pasar 100 mg de tejido macerado a un tubo de 1,5
ml. Agregar 1 ml de TRIZOL (Invitrogen) y mace-
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rar el tejido utilizando un mbolo plstico durante
20-40 segundos. Se trabaja en campana.
Aclaracin: El TRIZOL es el nombre comercial de
una solucin de Tiocianato de guanidinio- Fenol.
El TRIZOL mantiene la integridad del ARN duran-
te la homogeneizacin del tejido fino, mientras que
al mismo tiempo lisa las clulas y sus componen-
tes.
Precaucin: es una sustancia muy txica
3) Dejar 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar
en microcentrfuga refrigerada a 4C durante 10
minutos a 12.000 rpm para obtener un sobrenadan-
te limpio sin restos de material vegetal.
4) Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5
ml. Agregar cloroformo fro hasta volumen final de
1,4 ml. Vortex 2 min y centrifugar en microcentr-
fuga refrigerada a 4C durante 10 minutos a 12.000
rpm.
La muestra se separar en dos fases y una interfa-
se: la superior o acuosa que contiene el RNA, la in-
terfase que contiene ADN y protenas y la inferior
u orgnica que contiene mayoritariamente prote-
nas
5) Transferir cuidadosamente la fase acuosa superior
a un nuevo tubo de 1,5 ml. Medir el volumen y
adicionar 1 volumen de isopropanol. Dejar durante
la noche a -20 C
6) Centrifugar en microcentrfuga refrigerada a 4C
durante 30 minutos a 14.000 rpm
7) Descartar el mximo posible de sobrenadante sin
perder el pellet (que en general estar difuso y
suelto, encontrndose en el fondo o a lo largo de la
pared del tubo dependiendo del ngulo de rotor uti-
lizado).
8) Lavar el pellet con 250 l de etanol 70% (gene-
ralmente, se observar el pellet ms blanco en este
punto). Centrifugar 10 min a 14.000 rpm a 4C.
9) Repetir el paso 8. Dejar secar el pellet al aire por
unos 20 minutos tomando las precauciones de no
secarlo completamente (se dificulta su posterior re-
suspensin).
10) Resuspender el pellet en 50l de agua libre de
RNAsas (agua DEPC: Dietil Pirocarbonato) pre-
viamente calentada a 70C dado que facilita la re-
suspensin del ARN.
11) Guardar el ARN a -80 C
El RNA es muy lbil y fcilmente degradado por la
accin de RNAsas presentes en la piel y por tem-
peraturas superiores a 4C, lo que constituye el
principal problema de la extraccin del RNA, por
ello se utiliza inhibidores de RNasas (como el
DEPC), guantes para su manipulacin, se utiliza
todo el material libre de RNAsas y se trabaja a
temperaturas inferiores a 4C.
Para verificar la calidad, integridad y cantidad del ARN
obtenido se realiza una electroforesis en gel de agarosa
1%.

Figura 2: Gel de agarosa 1%. Ca-
lle S: 1l de ARN obtenido de ho-
jas de plantas de algodn sanas.
Calle E: 1l de ARN obtenido a
partir de hojas de plantas de algo-
dn infectadas con CLRDV. Mto-
do de tincin: bromuro de etidio.

Soluciones
Agua DEPC 0.1%
Dietil Pirocarbonato 1 ml
Agua c.s.p 1000 ml
Sntesis de ADNc.
Un ADN complementario (ADNc) puede ser sintetiza-
do in vitro a partir de ARN total utilizando la enzima
transcriptasa reversa (RT), la cual es una ADN polime-
rasa dependiente de ARN, que utiliza primers al azar
(random primers o hexmeros al azar) un oligonu-
cleotido poly (dT) de 12-18 pb. Luego de desnaturalizar
el ARN mediante calor, el primer acta como iniciador
para la sntesis 5`-3` de una molcula complementaria
al ARN, la cual es un ADNc de simple cadena. El
ADNc obtenido corresponde a la totalidad de la pobla-
cin de ARN presente al inicio de la sntesis.
Para la sntesis de ADNc se utilizara el kit comercial
SuperScript III (Invitrogen)
ARN 1 g
dNTPs (10 mM) 1 l
Random primers (150 ng/ l) 1 l
H
2
O Depc X l
Volumen 15 l

Colocar 5 min a 70 C y luego inmediatamente en hielo.
Hacer un spin.
Agregar la siguiente mix:
Buffer 1
st
strand 5x 4 l
DTT 0,1M (Dithiothreitol) 1 l
RNAse out (40U/ l) 1 l
Transcriptasa reversa (200U/ l) 1 l
(Superscript II)
22

Colocar en un termociclador con el siguiente programa:
25 C 2 min
50C 2 hs
70C 15 min
16C ON
PARTE II: Deteccin de secuencias especficas del
CLRDV mediante PCR para su diagnstico molecu-
lar.
Para la PCR diagnstica del CLRDV se amplificarn
dos regiones del genoma viral, una correspondiente al
ORF0 y la otra correspondiente al ORF3. El ORF0 co-
difica para la protena P0 que tiene funcin de supresor
de silenciamiento gnico y es una protena que presenta
S E
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considerable variabilidad entre los distintos aislamien-
tos virales. El ORF3 codifica para la protena P3 que
corresponde a la cpside viral (CP) y es una protena
muy conservada entre los distintos aislamientos virales.
En la figura 3 se indica la posicin de los primers y el
fragmento que se va a amplificar en cada caso.
Figura 3: Esquema de la estructura genmica del
CLRDV. Se indican los primers (flechas grises) utili-
zados para la amplificacin mediante la tcnica de PCR
del ORF 0 (Primers 3 y 4) y ORF3 (primers 1 y 2) del
CLRDV. Se indica el tamao a amplificar en cada caso.

Secuencia de los primers:
Primer 1: CP up 5ATGAATACGGTCGTGGGTAG 3
(posicin: 3630-3649)
Primer 2: CP low 5 CTATTTTGGATTGTGGAATT
3 (posicin: 4236- 4217)

Primer 3: P0 up 5 ATGTTGAATTTGATCATCTG 3
(posicin: 71-90)
Primer 4: P0 low 5 TCAACTGCTTTCTCCTTCAC
3 (posicin: 856-837)

Se realizar un control para confirmar que el ADNc
obtenido es amplificable. Para ello utilizaremos un par
de primers que amplifican un ARN mensajero que codi-
fica para un gen endgeno:la Ubiquitina de algodn. Se
obtendr un producto de 500 pb.

Primer 5: Gh UBI up 5 CTGAATCTTCGCTTT-
CACGTTATC3
Primer 6: Gh UBI low 5 GGGATGCAA-
ATCTTCGTGAAAAC3

Se realizar otro control (control positivo) para confir-
mar que la reaccin de amplificacin por PCR funcio-
n. Para ello utilizaremos un plsmido que tiene clona-
do el ORF 0 (P0) y otro plsmido que tiene clonado el
ORF 3 (CP) con los primers correspondientes.

Protocolo experimental
a) Material
Cada grupo partir del ADNc de las
muestras a analizar y de los plsmidos
control. Algunos grupos amplificarn la
secuencia del ORF0 y otros grupos la
secuencia del ORF3, sobre el ADNc de
planta sana y planta enferma y los res-
pectivos controles. Tambin algunos
grupos amplificarn la secuencia de la Ubiquitina de
algodn sobre el el ADNc de planta sana y planta en-
ferma y sobre un control de ADN de algodn.

b) Protocolo experimental
b.1.) Reaccin de amplificacin
Se llevar a cabo el siguiente procedimiento:
1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con mar-
cador de alcohol, (utilizar dos para cada ADNc: planta
sana y planta enferma, uno para el control negativo de
mix y otro para el plsmido control positivo o el ADN
de algodn, segn corresponda).
Tubo 1: ADNc planta enferma con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 2: ADNc planta sana con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 3: plsmido CP con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 4: mix sin ADNc con Primers 1 y 2 (CP)

Tubo 5: ADNc planta enferma con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 6: ADNc planta sana con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 7: plsmido P0 con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 8: mix sin ADNc con Primers 3 y 4 (P0)

Tubo 9: ADNc planta enferma con Primers 5 y 6 (Gh
UBI)
Tubo 10: ADNc planta sana con Primers 5 y 6 (Gh
UBI)
Tubo 11: ADN algodn con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Tubo 12: mix sin ADNc con Primers 5 y 6 (Gh UBI)

2) Realizar una mezcla de reaccin (Premix) segn la
siguiente tabla:
Reactivos Concentracin final Volmen en l Volmen total
MIXADNc
plsmido o ADN

H
2
O MilliQ ---- 16,45 l
Buffer 10X 1X 2,5 l
MgCl
2
50mM 1,5 mM 0,75 l
dNTPs 10 mM 0,4 M 1 l
Primer up 50 ng/ l 1
Primer low 50 ng/ l 2 ng/ l 1 l
Taq Platinum (10
U/ l)
0,08 U/ l 0,3 l
ADNc plasmido (1
ng/ l)
2 (por tubo)
Volmen final 25 l

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Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar
la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente,
aplicar un spin de centrfuga y luego
3) Agregar 23 l de la Premix a cada tubo.
4) Pipetear el ADN (2 l en el caso del ADNc 1 l en
el caso de los psmidos) en los tubos correspondien-
tes y 2 l de H
2
O en el tubo control negativo o 1
l de H
2
O en el tubo control negativo, segn co-
rresponda. .
5) Luego, agregar una gota de aceite mineral. Tapar
bien. Dejar los tubos en hielo hasta colocarlos en el
termociclador.

PRECAUCI N: Una vez que la Taq polimerasa fue
agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya
que la enzima pierde irreversiblemente actividad a
temperatura ambiente.

El programa de amplificacin es el siguiente:
1 ciclo 94 C, 4 min (desnaturalizacin inicial)
35 ciclos 94 C, 1 min (desnaturalizacin)
55 C, 1 min (hibridacin)
72 C, 1 min (extensin)
1 ciclo 72 C, 10 min (extensin final)
16 C, infinito (conservacin de las
muestras)

6) Una vez terminado el programa, agregar a la muestra
5 l de Buffer de Carga y guardar en freezer a -20 C
hasta el momento de la visualizacin de los resulta-
dos.
b.2) Visualizacin de los productos de amplificacin
Los productos de amplificacin sern resueltos por
electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Para ello, se
proceder de la siguiente manera:

1) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria
de agarosa en el volmen apropiado de buffer
TAE (Tris-Acetato -EDTA) 1X para obtener
una concentracin final de 1%.
2) Colocar la mezcla de agarosa en el horno mi-
croondas y calentar a baja potencia hasta el
primer hervor.
3) Una vez fundida la mezcla, agregar el volmen
necesario de una solucin de bromuro de etidio
para obtener una concentacin final de 0,5
g/ml en el gel.

PRECAUCI N: El bromuro de etidio es extremada-
mente mutagnico, use guantes y sea cuidadoso durante
la manipulacin del gel.

4) Volcar la solucin en la cama electrofortica
(sta debe estar apropiadamente nivelada y te-
ner el peine colocado). Eliminar toda burbuja.
Esperar a que gelifique completamente antes de
usar.
5) Sumergir la cama junto con el peine en la cuba
electrofortica, la cual debe poseer buffer TAE
1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Re-
tirar cuidadosamente el peine y proceder a la
siembra de las muestras (20 l por calle).
6) La corrida electrofortica se llevar a cabo a
voltaje constante (8 V/cm) y los productos de
amplificacin se visualizarn bajo luz UV.

PRECAUCI N: la radiacin UV es particularmente
daina para los ojos. Para minimizar la exposicin,
asegrese de que la fuente de luz UV est adecuada-
mente cubierta con un acrlico. Use anteojos o una
mscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz
UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la
fuente de luz UV. Este tipo de radiacin es tambin
mutagnica y carcinognica.

7) Observe y analice los resultados.

c) Soluciones empleadas
TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM
EDTA
Tris base (PM=121,10) 48,40 g/L
Na
2
EDTA (PM=380,2) 2,92 g/L
NaOAc (PM=82,03) 4,10 g/L
Ajustar el pH en 8,0 con cido actico glacial

Buffer de carga
Xilenxianol 2 mg/ml
Glicerol 40% (v/v)
TP 4: Bases de datos para anlisis de secuencias virales Ana Julia Distfano y Carolina Martnez
Las enfermedades de las plantas causan la prdida de
aproximadamente el 15% de la produccin agrcola
mundial. En particular, las infecciones virales producen
perjuicios econmicos significativos de manera directa,
a travs de una disminucin del rendimiento por efecto
de la enfermedad, e indirecta a travs de un incremento
en los costos debido a la utilizacin de semilla libre de
virus (por ejemplo en plantas de propagacin clonal
como papa, ajo y batata).
En este contexto, el estudio y caracterizacin de los
virus vegetales desde el punto de vista clsico como
molecular reviste de gran importancia para el desarrollo
de nuevas y mejores estrategias de resistencia en los
diferentes hospedantes vegetales.

El Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV)
La enfermedad azul es considerada en la actualidad la
principal enfermedad de origen viral que afecta al culti-
vo de algodn en la zona algodonera de la Argentina
(NEA).
Se determin que la enfermedad es causada por el Cot-
ton leafroll dwarf virus, y recientemente se obtuvo la
secuencia completa del genoma viral (Distefano AJ y
col, Archieves of Virology, 2010). El virus es transmi-
tido nicamente por un insecto vector: Aphis gossypii
Glover. El CLRDV pertenece al gnero Polerovirus de
la familia Luteoviridae. Su genoma es de ARN de sim-
ple cadena positiva, y el tamao total es de 5866 bases.
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Taxonoma y filogenia moleculares
La clasificacin de los virus ha sido y sigue siendo un
punto extremadamente confuso y sometido a constante
revisin. No hay que olvidar que para su identificacin
y nomenclatura no son vlidos los criterios utilizados
con los organismos de estructura celular eucaritica, ni
siquiera los seguidos en el caso de las bacterias. En
virologa no hay unanimidad acerca del concepto de
especie, ya que los criterios a seguir para definirla pue-
den variar de una familia de virus a otra. En general se
valoran: la naturaleza de su genoma (ARN/ADN), ta-
mao y morfologa, la sensibilidad a solventes orgni-
cos, caractersticas antignicas (muy utilizadas para el
establecimiento de tipos dentro de las especies), formas
de transmisin, rango de husped y sintomatologa.
El concepto de especie, es muy importante desde un
punto de vista taxonmico. Sin embargo, solamente en
1991, la ICTV acept la propuesta de Van Regenmor-
tel, de considerarlo como un criterio vlido para la ta-
xonoma y nomenclatura de los virus.
Las relaciones filogenticas entre los virus han sido
posibles de inferir a medida que se ha ido clonando,
secuenciando y caracterizando genes estructurales de
los mismos. Estos anlisis constituyen una poderosa
herramienta para realizar estudios de epidemiologa
molecular. Por otro lado tambin permiten analizar la
evolucin de los virus y eventualmente definir nuevas
especies o grupos taxonmicos.
En los ltimos aos, la implementacin de las tcnicas
de secuenciacin masiva junto con la consecuente pro-
duccin de una gran cantidad de datos y el desarrollo de
la bioinformtica, hicieron posible la generacin de
bases de datos de secuencias de consulta diaria para
toda la comunidad cientfica, permitiendo estudios
comparativos de genomas. Estas herramientas, tambin
son utilizadas para el estudio de los genomas pertene-
cientes a virus vegetales.

Objetivo
Familiarizarse con el uso de herramientas bioinformti-
cas y consulta de bases de datos disponibles a travs de
internet, empleadas frecuentemente en el estudio mole-
cular de genomas virales.

Desarrollo
Se analizarn tres clones obtenidos a partir de la se-
cuenciacin del genoma del CLRDV, estudiando el
nivel de identidad con otras secuencias depositadas en
bases de datos pblicas y ubicando la posicin de los
clones en el genoma del virus.
Adems, se realizar el mismo anlisis para la secuen-
cia traducida (secuencia aminoacdica) de dichos clo-
nes. Se compararn y discutirn los resultados obteni-
dos para cada una de ellas.

Procedimiento
1. Identificar la carpeta virologa molecular en el Escri-
torio de la computadora. Abrirla y localizar el archivo
clones.doc, all se encuentra la secuencia de tres clones
correspondiente al CLRDV. Abrir el archivo con el
Word o el WordPad.

2. Buscar en la base de datos Genbank utilizando el
programa BLAST la identidad de los tres clones. A la
secuencia enviada, la denominaremos secuencia query.
Para ello acceder a travs de la pgina del National
Center for Biotechnology Information
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar Nu-
cleotide blast (blastn).

3. Copiar la secuencia de cada archivo y pegarla en la
ventana del BLAST enter query sequence.
En programme selection elegir somewhat similar se-
quence (Blastn).
En Chose Search Set elegir Others (nr etc)
Enviar la bsqueda (clic en blast).

4. Interpretar, analizar y discutir el resultado de las bs-
quedas con los docentes.

5. A partir de los resultados obtenidos mediante
BLAST, acceder a alguna de las secuencias con mayor
identidad. Discutir con el docente la informacin que se
obtiene.
Bajar y guardar alguna secuencia en formato fasta, si-
guiendo las instrucciones del docente.

6. Repetir del paso 2 al 4 pero utilizando la secuencia
traducida de los tres clones que se encuentra en el mis-
mo archivo clones.doc. Para ello acceder a travs de la
pgina del National Center for Biotechnology Informa-
tion http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar
Protein blast (blastp)

Que diferencias se observan respecto a la comparacin
con la secuencia de nucletidos realizada?

7. Realizar una bsqueda similar a la anterior (puntos 2,
3 y 4), empleando el programa FASTA. Para ello acce-
der a travs de la pgina del European Bioinformatics
Institute http://www.ebi.ac.uk/fasta33/. Para un desarro-
llo ms dinmico de la prctica, el resultado de esta
bsqueda se encuentra guardado en la carpeta virologa
molecular con el nombre de fasta n clones 1, 2 ,3.doc.

Que diferencias observa con el programa Blast?

8. Entrar a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ y
discutir con los docentes las herramientas disponibles y
la utilidad de este sitio.

9. Entrar a la pgina
http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=
2011 y discutir con los docentes la utilidad de este sitio

TP 5 DETECCIN DE Streptomyces spp. EN MUESTRAS DE TUBRCULOS DE PAPA
Viviana Barrera y Carolina Martnez
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PARTE I: Extraccin y cuantificacin de
ADN
El gnero Streptomyces comprende bacterias Gram
positivas que forman colonias de hbito filamentoso.
Son habitantes del suelo y, por lo tanto, suelen producir
enfermedades en partes subterrneas de las plantas. Una
de las enfermedades ms conocidas es la sarna comn
de la papa (Potato Common Scab), que produce ps-
tulas en la superficie de los tubrculos que disminuyen
el valor comercial de los mismos.
Entre las especies responsables se han identificado a S.
scabies, S. acidiscabies, S. turgidiscabies, S. europaeis-
cabiei y S. stelliscabiei (Loria et al., 1997). Debido a las
dificultades que se encuentran para aislar e identificar a
estos microorganismos se han desarrollado tcnicas
basadas en PCR para lograr mtodos sencillos y preci-
sos. Tanaka (2000) desarroll primers para amplificar
por PCR regiones de ITS que generan distintos frag-
mentos para S. scabies, S. acidiscabies y S. turgidisca-
bies. Esta tcnica permite detectar la presencia de algu-
na de estas 3 especies tanto en lesiones de tubrculo
como en muestras de suelo.

Extraccin de ADN
El primer paso en el diagnstico basado en tcnicas de
deteccin a nivel de ADN es la purificacin de esta
molcula de los otros componentes de la muestra.
Generalmente, en este tipo de estudios el nmero de
muestras a analizar es muy grande y, por lo tanto, se
requiere de un mtodo de extraccin tcnicamente sen-
cillo, rpido y eficaz.
En la literatura se encuentran descriptos distintos mto-
dos de extraccin de ADN que varan principalmente en
la clase de material del cual se parte (especie determi-
nada, medio de cultivo, etc) y en la calidad del mismo
(tejido fresco; tejido liofilizado; etc.). Pero, los protoco-
los son bsicamente similares con algunas modificacio-
nes tratando de resolver los problemas especficos de la
especie bajo estudio y se caracterizan por utilizar un
detergente catinico (CTAB: cationic hexadecyl trime-
thyl ammonium bromide o SDS: sodium dodecyl sulfa-
te) en el buffer de extraccin.
La mayora de los protocolos de extraccin de ADN
involucran en general cinco etapas bsicas:
5) Se aplica algn tipo de maceracin mecnica para
romper las paredes y membranas celulares del tejido. La
maceracin de tejido fresco se puede hacer en presencia
de nitrgeno lquido o con el auxilio de un molino elc-
trico.
6) El tejido se resuspende en el buffer de extraccin
tendiendo a la solubilizacin de las membranas lipopro-
ticas y desnaturalizacin de las protenas en tanto que
el ADN es protegido de la accin de enzimas degradati-
vas. Para cumplir estas funciones, el buffer de extrac-
cin tiene las siguientes caractersticas: el pH utilizado
est entre 8,0 y 9,0 evitando de esta forma condiciones
ptimas para la accin de enzimas degradativas. Por
ejemplo, la mayora de las enzimas lipolticas y lipoxi-
genasas tienen un pH ptimo entre 5,0 y 6,0 en tanto
que las ADNasas nucleares tienen un pH ptimo en
torno a 7,0. El buffer de extraccin del protocolo a rea-
lizar en el laboratorio, utiliza un sistema Tris-Cl para
mantener el pH. El detergente SDS solubiliza las mem-
branas celulares y desnaturaliza protenas. El NaCl
permite la solubilizacin del detergente y es esencial
ms tarde para la precipitacin del ADN en presencia
de alcohol. Para proteger al ADN de la accin de enzi-
mas nativas o de compuestos secundarios liberados a
consecuencia de la ruptura de las clulas, se agregan
distintos componentes: EDTA (ethylene diamine tetra
acetate) es un quelante de cationes divalentes como
Mg
2+
y Ca
2+
con lo cual inhibe la accin de ADNasas
dependientes de metales; y el agente reductor -
mercaptoetanol protege al ADN contra las actividades
de enzimas tales como peroxidasas y polifenoloxidasas,
desnaturalizndolas e inhibiendo la accin de otras en-
zimas.
La suspensin obtenida se somete a una temperatura
entre 50 y 65C para facilitar la solubilizacin y homo-
geneizacin de la mezcla. Esta temperatura contribuye
tambin a inhibir la accin de enzimas degradativas
tanto por reduccin en su actividad (no es su temperatu-
ra ptima de trabajo) como por desnaturalizacin.
7) La suspensin se somete a una extraccin con sol-
ventes orgnicos, cloroformo-octanol, y las fases org-
nica y acuosa se separan por centrifugacin. En esta
extraccin, lpidos, protenas y la mayora de los polisa-
cridos quedan retenidos en la fase orgnica en tanto
que ADN, ARN y algunos polisacridos quedan en fase
acuosa. Alternativamente, se puede agregar a la suspen-
sin acetato de potasio e incubar en fro y luego proce-
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der a centrifugar. De esta forma, lpidos, protenas y la
mayora de los polisacridos quedan atrapados en una
especie de malla formada por accin de la sal, mientras
que los cidos nuclicos quedan en solucin.
8) A la fase acuosa obtenida en la etapa anterior se le
adiciona alcohol (etanol o isopropanol). Los cidos
nuclicos (ADN y ARN) en presencia de sal y alcohol
forman un precipitado, frecuentemente visible, que
puede ser sedimentado por centrifugacin. A este preci-
pitado luego se lo lava con alcohol para eliminar las
sales remanentes.
9) En esta ltima etapa, el ADN/ARN es resuspendido
en un buffer Tris-EDTA o en agua y puede tratarse con
ARNasa para degradar el ARN obteniendo as el ADN
genmico deseado.

Electroforesis
La tcnica de electroforesis fue desarrollada hace unos
50 aos, ganando fuerte aceptacin a partir de la dcada
del 60. La tcnica se basa en el movimiento de molcu-
las (protenas como isoenzimas- cidos nuclicos) a
travs de una matriz soporte (almidn, agarosa, acrila-
mida) con un buffer (TBE, TAE, etc.). La matriz fun-
ciona como un filtro, separando las molculas de acuer-
do con su tamao y carga elctrica neta que poseen al
ser sometidas a un campo elctrico. En el caso de los
cidos nuclicos, el grupo fosfato es responsable de la
fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, ha-
ciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo
(nodo) durante la electroforesis. Como la carga elctri-
ca neta de los fragmentos es negativa, la separacin
ocurrir slo en base al tamao de los mismos.
Es posible verificar la separacin de fragmentos de
ADN de entre 100 pb a 60 kb utilizando agarosa (una
forma refinada del agar extrado de las algas marinas).
El proceso de separacin de fragmentos de ADN por
electroforesis depende bsicamente del tamao de los
fragmentos, de la concentracin de la agarosa y del
voltaje aplicado. Durante la electroforesis, como la
agarosa acta como si fuese un filtro separando los
fragmentos de diferentes tamaos, se observa que los
fragmentos menores migrarn ms rpidamente en la
direccin del polo positivo, en tanto que los fragmentos
de mayor tamao lo harn ms lentamente. As, frag-
mentos de diferentes tamaos son separados a lo largo
del gel. Al aumentar la concentracin de agarosa se
dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo de
la matriz, permitiendo obtener una mayor separacin de
los fragmentos de menor tamao. Por otro lado, una
reduccin en la concentracin de agarosa, favorece la
separacin de fragmentos mayores. Un incremento del
voltaje, aumenta proporcionalmente la velocidad de
migracin de los fragmentos a lo largo de la matriz. De
esta forma, conociendo estas variables se pueden ade-
cuar las condiciones ideales para proceder a la separa-
cin de fragmentos de ADN de distintos tamaos.

Cuantificacin de ADN
Existen varias tcnicas utilizadas en la cuantificacin
del ADN. Algunas dependen del empleo de equipa-
mientos costosos, como espectrofotmetros, mientras
que otras, menos precisas, son simples y econmicas.
La eleccin de uno u otro mtodo depende bsicamente
de la disponibilidad de equipamiento y de los objetivos
del experimento a realizar con ese ADN.
Una tcnica simple utilizada para la cuantificacin del
ADN es el anlisis comparativo de muestras coloreadas
con bromuro de etidio en geles de agarosa. Para lo cual
se requiere disponer de un ADN patrn de concentra-
cin conocida (como por ejemplo, ADN del fago lamb-
da). La tcnica consiste en la utilizacin de una secuen-
cia ascendente de concentraciones de solucin patrn de
ADN, pipeteadas lado a lado en un gel de agarosa en el
cual tambin se cargan las muestras de concentracin
desconocida. Luego de someter el gel a electroforesis,
ste se colorea con una solucin de bromuro de etidio y
se estima la concentracin de las muestras estudiadas
por observacin comparativa con la banda de ADN
patrn, mediante visualizacin con luz ultravioleta. De
esta forma, se estima la concentracin desconocida del
ADN en cuestin. Asimismo, esta tcnica permite con-
trolar que el ADN aislado sea de alto peso molecular y
no se encuentre degradado. El ADN nativo debe migrar
como una banda ntida y compacta de peso molecular
mayor o igual a 40 kb.

Objetivo del TP: Comparar dos mtodos de extraccin
de ADN (comercial y no comercial) a partir de tejido de
tubrculos de papa afectados con sntomas de infeccin
por Streptomyces sp.

Protocolo experimental 1 No comercial
Minipreparacin de ADN en microtubos de 1,5 ml a
partir de unas decenas de miligramos de tejido. En la
prctica, la extraccin de ADN se realizar a partir de
tejido de tubrculos de papa afectados con sntomas de
infeccin por Streptomyces sp.

1) Prepare de antemano las soluciones de extraccin
listadas al final del protocolo.
Encienda un termobloque o bao termostatizado a
65C.
Prepare dos tubos de 1,5 ml por cada muestra a proce-
sar, debidamente rotulados.
Anote la correspondencia entre los nmeros de los tu-
bos y la identificacin de las muestras.
2) Agregue al buffer de extraccin el -
mercaptoetanol bajo campana (en caso de no haber sido
realizado previamente por el docente).
3) A partir de tejido de tubrculos de papa con lesio-
nes de sarna por Streptomyces, tome entre 50 a 200 mg
del mismo con la ayuda de un bistur. Coloque el tejido
en uno de los tubos de 1,5 ml. Disponga los tubos a -
80C durante 10 min.
4) Macere el tejido utilizando un mbolo plstico du-
rante 20-40 segundos hasta que est pulverizado. Agre-
gue 700 l de buffer de extraccin (con -
mercaptoetanol). Repita la operacin de maceracin.
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5) Resuspenda el tejido en el buffer empleando un
vrtex. Incube a 65C durante 10 minutos, agitando
ocasionalmente para homogeneizar la suspensin.
6) Retire los tubos del bao trmico. Djelos enfriar a
temperatura ambiente. Agregue 200 l de acetato de
potasio 5M. Agite brevemente. Incube en hielo 20 mi-
nutos.
7) Retire los tubos del hielo y centrifugue en micro-
centrfuga refrigerada a 4C durante 20 minutos a
12.000 rpm.
8) Retire los tubos de la centrfuga cuidadosamente.
Tome 500 l del sobrenadante obtenido a un nuevo
tubo, evitando tomar contaminantes del precipitado.
9) Adicione 500 l (1 volumen) de isopropanol. Mez-
cle gentilmente para precipitar los cidos nuclicos.
10) Centrifugue durante 10 minutos a 12.000 rpm a
11) Descarte el mximo posible de sobrenadante sin
perder el pellet (que en general estar difuso y suelto,
encontrndose en el fondo o a lo largo de la pared del
tubo dependiendo del ngulo de rotor utilizado).
12) Lave el pellet con 250 l de etanol 70% (general-
mente, se observar ms blanco en este punto). Centri-
fugue brevemente a 12.000 rpm a temperatura ambien-
te.
13) Repita el paso 12. Deje secar el pellet al aire por
unos 20 minutos o en centrfuga de vaco por 5 minutos.
14) Resuspenda el pellet en 50-100 l (dependiendo
del tamao del pellet) en buffer TE-8 (que puede conte-
ner 10 g/l de ARNasa, incubndose a 37C durante
30 minutos para digestin del ARN).

Protocolo experimental 2: Comercial (PowerSoil
DNA Isolation Kit, MO BIO Laboratorios, Inc)

1) A partir de tejido de tubrculos de papa con lesio-
nes de sarna, tome entre 50 a 200 mg del mismo con la
ayuda de un bistur. Coloque el tejido en el tubo que
posee las PowerBead provisto por el kit.
2) Mezclar suavemente empleando un vortex.
3) Observar la solucin C1. Si la solucin C1 est
precipitada, calentarla a 60C antes de usar.
4) Agregar 60 ul de solucin C1 e invertir el tubo o
usar vortex suavemente.
5) Incubar con agitacin mxima y constante usando
un vortex durante 10 min.
6) Centrifugar a 10.000 g por 30 seg a temperatura
ambiente (no exceder los 10.000 g porque pueden rom-
perse los tubos).
7) Transferir el sobrenadante al tubo colector de 2 ml
provisto por el kit. Se esperan aproximadamente 400 a
500 ul de sobrenadante.
8) Agregar 250 ul de solucin C2 y agitar con vortex
por 5 seg. Incubar a 4C por 5 min.
9) Centrifugar a temperatura ambiente por 1 min a
10.000 g.
10) Transferir aproximadamente 600 ul del sobrenadan-
te, evitando perturbar el pellet y colocar en tubo colec-
tor de 2 ml provisto por el kit.
11) Agregar 200 ul de solucin C3 y agitar brevemente
con vortex. Incubar a 4C por 5 min.
12) Centrifugar a temperatura ambiente por 1 min a
10.000 g.
13) Transferir aproximadamente 750 ul del sobrenadan-
te, evitando perturbar el pellet y colocar en tubo colec-
tor de 2 ml provisto por el kit.
14) Agregar 1200 ul de solucin C4 al sobrenadante y
agitar con vortex por 5 seg.
15) Colocar aproximadamente 675 ul de esta mezcla en
un Spin Filter provisto por el kit y centrifugar a tempe-
ratura ambiente por 1 min a 10.000 g. Descartar el elu-
do y adicionar nuevamente 675 ul de esta mezcla en el
Spin Filter y centrifugar a temperatura ambiente por 1
min a 10.000 g. Descartar el eludo y colocar el resto de
la mezcla en el Spin Filter y centrifugar a temperatura
ambiente por 1 min a 10.000 g.
16) Agregar 500 ul de solucin C5 y centrifugar a tem-
peratura ambiente por 30 seg a 10.000 g.
17) Descartar el eludo.
18) Centrifugar nuevamente a temperatura ambiente por
1 min a 10.000 g.
19) Con cuidado, colocar el Spin Filter en un tubo co-
lector de 2 ml provisto por el kit. Evitar arrastrar el
eludo con el Spin Filter.
20) Agregar 100 ul de solucin C6 en el centro de la
membrana blanca del filtro.
21) Centrifugar a temperatura ambiente por 30 seg a
10.000 g.
22) Descartar el Spin Filter. El ADN eludo obtenido,
est listo para los siguientes protocolos.

Electroforesis
1) Arme un minigel de electroforesis (0,8% agarosa
en TAE 1X): derrita la agarosa en el horno de microon-
das, mezclando un par de veces durante este proceso.
Enfre a 55C aproximadamente. Selle los extremos de
la cama con cinta adhesiva de papel, acomode el peine
y vuelque la agarosa. Elimine toda burbuja. Deje solidi-
ficar (20 minutos, aproximadamente). Retire el peine y
la cinta adhesiva. Coloque la cama que contiene al gel
en una cuba de electroforesis. Coloque suficiente buffer
TAE 1X como para llenar la cuba, cubriendo unos 0,5
cm el gel.
2) Cargue un volumen de cada muestra (a la que se le
habr adicionado buffer de carga, azul de bromofenol)
en los pocillos del gel (wells). La decisin sobre cun-
tos microlitros cargar en el gel depender bsicamente
del tamao de los pellets obtenidos, de la viscosidad de
la solucin de ADN y de la experiencia anterior con el
material. Comnmente, se carga de 1 a 5 l de la solu-
cin de ADN extrado. Lado a lado con las muestras
siembre cantidades conocidas del ADN patrn, procu-
rando tener una franja de concentraciones en las cuales
las muestras extradas se encuentren. Generalmente,
con esta minipreparacin se obtienen concentraciones
de 10 a 200 ng/l. Por lo tanto, es interesante cargar
cantidades crecientes como 10, 50, 100 y 200 ng del
ADN de referencia.
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3) Corra las muestras a voltaje constante (3 V/cm
2
)
hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado
2 cm aproximadamente.
4) Retire la cama de la cuba y tia el gel en una solu-
cin de bromuro de etidio 1 g/ml durante 20 minutos
con agitacin constante.


5) Enjuague el gel en dH
2
O por 10 minutos (se pue-
den evitar los pasos de tincin y enjuague si se agrega
el bromuro de etidio a la agarosa ya derretida, antes de
volcarla en la cama). Coloque el gel sobre un transilu-
minador de luz UV y fotografe.


6) Observando la fotografa, estime la concentracin
de ADN extrado por comparacin con el ADN patrn
de concentracin conocida.
Soluciones utilizadas
Buffer de extraccin: 50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM
NaCl, 10 mM EDTA pH 8,0; 1% SDS, 10 mM -
mercaptoetanol
STOCK 100 ml
1M Tris-Cl pH 8,0 5 ml
5 M NaCl 2 ml
0,5 M EDTA pH 8,0 2 ml
20% SDS 5 ml
ddH
2
O a volumen
14M -mercaptoetanol 71 l (agregar antes de usar)

PRECAUCI N: El SDS es nocivo si es inhalado. Use
una mscara de seguridad cuando pese esta sustancia.
El -mercaptoetanol puede ser fatal si es inhalado o
absorbido a travs de la piel y es nocivo si es ingerido.
En altas concentraciones destruye las membranas mu-
cosas, el tracto respiratorio superior, la piel y los ojos.
Use guantes y anteojos de seguridad y trabaje bajo
campana.

5 M KAcO: 5 M Acetato de Potasio
Disuelva 49,07 g de Acetato de Potasio en 90 ml de
ddH
2
O. Llevar a 100 ml de volumen final con ddH
2
O.

TE-8: 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0

STOCK 100 ml
1M Tris-Cl pH 8,0 1 ml
0,5 M EDTA pH 8,0 0,2 ml
ddH
2
O a volumen

10X TAE Buffer: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7
mM EDTA

STOCK 1 litro
Tris Base (PM=121,10) 48,40 g
NaOAc (PM=82,03) 4,10 g
Na
2
EDTA (PM=380,20) 2,92 g
ddH
2
O a volumen
Ajustar el pH en 8,0 con cido actico glacial.

DETECCIN DE Streptomyces sp. EN MUESTRAS DE TUBRCULOS DE PAPA
PARTE II: Deteccin de secuencias especficas de Streptomyces mediante PCR

Mediante la metodologa de PCR, se amplificarn
fragmentos de las secuencias 16S rDNA, con fragmen-
tos de mas de 200 pb para S. scabies (SC), fragmentos
de ms de 600 pb para S. turgidiscabies (TU) y de ms
de 800 pb para S. acidiscabies (AC). Como control
positivo de la extraccin del ADN se amplificar la
secuencia de la citocromo oxidasa mitocondrial me-
diante el par de primers FM 58/66.

Figura 1: Esquema de la amplificacin mediante la tc-
nica de PCR. Los primers se destacan como rectngulos
negros)
Tabla 1. Secuencias de los primers a utilizar:

BIBLIOGRAFIA
Tanaka, F. (2000). Identification, quantification of potato
scab pathogens and control of the disease by changing
soil environment. Rep. Hokkaido. Pref. Exp. Stn., 96, 1-
66.
Loria, R., R. Bukhalid, B. Fry and R. King. 1997. Plant path-
ogenicity in the genus Streptomyces. Plant Dis. 81: 836-
846.
Objetivo del TP: Detectar mediante la tcnica de PCR
secuencias diagnsticas de diferentes especies de Strep-
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tomyces en DNA extrado de lesiones de sarna en papa.

Protocolo experimental
a) Material
Cada grupo partir del ADN extrado en la prctica
anterior.
b) Protocolo experimental
b.1.) Reaccin de amplificacin
Se llevar a cabo el siguiente procedimiento:
1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con
marcador de alcohol, (utilizar uno para cada
ADN y uno para el control negativo).
2) Pipetear el ADN (2 l) en los tubos correspon-
dientes y 2 l de H
2
O en el tubo control nega-
tivo.
3) Realizar una mezcla de reaccin para cada uno
de los pares de primers a evaluar (Premix) se-
gn la siguiente tabla:

Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar
la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente con
Vortex, aplicar un spin de centrfuga y enfriar en hielo.
4) Agregar 20 l de la Premix a cada tubo que ya
tiene el ADN y luego una gota de aceite mine-
ral. Tapar bien. Dejar los tubos en hielo hasta
colocarlos en el termociclador.
PRECAUCI N: Una vez que la Taq polimerasa fue
agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya
que la enzima pierde irreversiblemente actividad a

El programa de amplificacin es el siguiente:
1 ciclo 95 C, 5 min (desnaturalizacin inicial)
40 ciclos 94 C, 30 sec (desnaturalizacin)
60 C, 30 sec (hibridacin) (FM y TU)
64 C, 30 sec (hibridacin) (SC y AC)
72 C, 2 min (extensin)
1 ciclo 72 C, 10 min (extensin final)
8 C, infinito (conservacin de las
muestras)
5) Una vez terminado el programa, agregar a la
muestra 5 l de Buffer de Carga y guardar en
freezer a -20 C hasta el momento de la visuali-
zacin de los resultados.
b.2) Visualizacin de los productos de amplificacin
Los productos de amplificacin sern resueltos por
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Para ello, se
proceder de la siguiente manera:
6) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria
de agarosa en el volmen apropiado de buffer
TAE (Tris-Acetato -EDTA) 1X para obtener
una concentracin final de 1,5%.
7) Colocar la mezcla de agarosa en el horno mi-
croondas y calentar a baja potencia hasta el
primer hervor.
8) Una vez fundida la mezcla, agregar el volmen
necesario de una solucin de bromuro de etidio
para obtener una concentacin final de 0,5
g/ml en el gel.


9) Volcar la solucin en la cama electrofortica
(sta debe estar apropiadamente nivelada y te-
ner el peine colocado). Eliminar toda burbuja.
Esperar a que gelifique completamente antes de
usar.
10) Sumergir la cama junto con el peine en la cuba
electrofortica, la cual debe poseer buffer TAE
1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Re-
tirar cuidadosamente el peine y proceder a la
siembra de las muestras (20 l por calle).
6) La corrida electrofortica se llevar a cabo a
voltaje constante (8 V/cm) y los productos de
amplificacin se visualizarn bajo luz UV.


7) Observe los patrones de amplificacin obteni-
dos, detecte polimorfismos y analice los resul-
tados.

c) Soluciones empleadas
TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM
EDTA
Reactivos Concentracin final Volmen x1 en l Volmen total
H
2
O MilliQ ---- 27,25 l
Buffer 10X 1X 5 l
MgCl
2
50 mM 4 mM 2 l
dNTPs 10 mM 100 M 4 l
Iniciador 1 10 M 2,5 M 1,25 l
Iniciador 2 10 M 2,5 M 1,25 l
Taq (10 U/ l) 0,05 U/ l 0,25 l
ADN X ng/ l 25-100 ng totales 4 (por tubo)
BSA
Volmen final
5
50
l
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Tris base (PM=121,10) 48,40 g/l
Na
2
EDTA (PM=380,2) 2,92 g/l
NaOAc (PM=82,03) 4,10 g/l
Ajustar el pH en 8,0 con cido actico glacial

Buffer de carga
Azul de Bromofenol 2 mg/ml
Glicerol 40% (v/v)
TP 6: Marcadores Moleculares y Diversidad gentica: Daniela Tosto, Cintia Acua
La deteccin y cuantificacin de la variacin gentica,
generada por las modificaciones ocurridas en la secuen-
cia de nucletidos del ADN, ha progresado gradual-
mente desde las evaluaciones biomtricas, los anlisis
fisiolgicos, los estudios bioqumicos isoenzimticos, el
anlisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de
restriccin (RFLP), hasta el advenimiento de la tcni-
ca de reaccin en cadena de la polimerasa o PCR, que
permiti la incorporacin de diversos mtodos de de-
teccin del polimorfismo gentico, directamente sobre
la molcula de ADN. Esta clase de marcadores podran
definirse como los fenotipos/genotipos moleculares,
generados por el polimorfismo gentico especfico de
una secuencia conocida o desconocida de ADN, que pue-
de o no ser codificante. Por consiguiente, los marcadores
moleculares permiten examinar el polimorfismo en
regiones codificantes, no codificantes y altamente va-
riables de los genomas, tanto nucleares como de orga-
nelas, proporcionando con un alto grado de precisin, el
perfil gentico de cada individuo analizado (DNA
fingerprint o huella digital gentica del ADN).
La aplicacin de estas herramientas en disciplinas
relacionadas a la Fitopatologa permite:
La caracterizacin molecular de colecciones de aisla-
mientos de especies patog- nicas asociadas a cultivos
de inters agrcola.
El conocimiento del nivel de diversidad gentica
presente en poblaciones de patgenos, el anlisis de
la distribucin de dicha diversidad y la estimacin del
grado de similitud gentica existente entre los aisla-
mientos que las componen.
El estudio de la estructura gentica de poblaciones de
patgenos y plagas
El desarrollo de sistemas de diagnstico de patgenos e
identificacin de plagas
Caractersticas de los marcadores moleculares
Las tcnicas moleculares ofrecen numerosas ventajas
respecto a las tcnicas tradicionales basadas en evalua-
ciones fenotpicas:
(1) Son estables y pueden detectarse en todos los teji-
dos, independientemente de la etapa de diferenciacin,
desarrollo o crecimiento del organismo bajo estudio.
(2) No estn afectados por el ambiente
(3) Generalmente carecen de efectos pleiotrpicos y
epistticos.
Un marcador gentico ideal debe cumplir con los si-
guientes requisitos:
(1) Manifestar altos niveles de polimorfismo. Se pre-
fiere, de ser posible, el empleo de marcadores multi-
allicos
(2) Presentar alta heredabilidad, lo que implica que
debe ser altamente reproducible en la progenie
(3) Presentar segregacin mendeliana y comporta-
miento co-dominante, esto es, la factibilidad de iden-
tificar las tres clases allicas (AA, Aa y aa).
(4) Ser abundantes y dispersos por todo el genoma
(5) Ser fenotpicamente neutros y detectables en
cualquier momento del desarrollo del individuo.
Tcnicas Numricas
Las tcnicas numricas que se aplican a la taxonoma
[utilizando cualquier tipo de marcador (morfomtrico,
bioqumico o molecular)], cuantifican la afinidad entre
unidades taxonmicas, basndose en el estado de los
caracteres que se eligen para ejecutar dicha tarea.
Para el anlisis de marcadores moleculares los
caracteres estn representados por los loci, o bien, por
las bandas electroforticas amplificadas. En el caso de
marcadores moleculares dominantes como los AFLP y
los RAPD, se asume que cada banda amplificada co-
rresponde a un alelo dominante, para un locus determi-
nado, y por lo tanto slo pueden ser detectadas dos
condiciones: la presencia de banda (que representa la
presencia del locus en estado de heterocigosis u ho-
mocigosis, sin poder discriminar entre ellos) y la
ausencia de banda (que representa la ausencia del locus
o la presencia de alelos nulos). Por otra parte, cuando se
analizan marcadores codominantes y multiallicos,
como los microsatlites, cada banda amplificada (que
corresponde a un alelo) es considerada como un carc-
ter, y la presencia o ausencia del mismo, ser conside-
rada como el estado de dicho carcter. Las principales
caractersticas de estas metodologas son:
(a) Se efectan considerando un gran nmero de ca(a)
( a ) Se efectan considerando un gran nmero de ca-
racteres, pudiendo ser stos infinitos.
(b) Todos los caracteres utilizados tienen la misma
significacin e importancia.
(c) La similitud total entre dos entidades es la suma de
la similitud en cada uno de los caracteres utilizados.
(d) Las asociaciones de los organismos no reflejan ne-
cesariamente genealoga del grupo.
1. Eleccin de las unidades: los organismos a estudiar,
definidos como OTUs (Unidades Taxonmicas Opera-
tivas) que pueden estar representadas por coleccin de
aislamientos, colecciones de semillas, variedades, culti-
vares, etc). Dado que se evala el ADN del organismo,
no interesa el estado fisiolgico o de desarrollo del
mismo.
2. Eleccin de los caracteres y registro del estado de
cada uno de ellos (ej. presencia o ausencia de bandas
electroforticas de RAPD, AFLP o alelos de microsat-
lites).
Carcter Estado
Banda de determinado ta-
mao molecular
Presencia
Ausencia
Ejemplo para Bandas de AFLP de distintos pesos mole-
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1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 1 0 0 0 1
0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 0 1 0
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
1 0 1 0 0 1 1 1 0 1
0 0 0 0 0 0 0 1 0 1
1 1 0 0 1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

culares, expresados en pares de bases (pb)
200 pb, 182pb, 165 bp, 140pb, 120 bp, 100 bp, 94 bp,
75pb
En el caso de marcadores multilocus como los AFLP y
los RAPD, cada locus determina un carcter. Cuando se
trata de microsatlites, este tratamiento no puede reali-
zarse. Se considera en cambio a cada alelo como un
carcter con sus ventajas y desventajas, como se expli-
ca a continuacin.
Cuando los datos son del tipo cualitativo, con varios
estados (por ejemplo alelos de microsatlites) y no po-
seen una secuencia lgica o estn desordenados, los
mismos no pueden ser representados adecuadamente a
travs de nmeros, pues se carece de fundamentos para
establecer un orden determinado. En estos casos, se
transforma a cada estado (ej. alelo de determinado ta-
mao) en presencia o ausencia. La desventaja de esta
codificacin es que al transformarse en varios caracte-
res independientes, aumenta su valor taxonmico en
detrimento de los no codificados de esta forma.
Ej: locus A
Alelo 1=120 pb, Alelo 2= 130 pb, Alelo 3= 140 pb
Codificacin transformando los datos en doble estado
(1 y 0)
Alelo 1: presencia o ausencia
En este caso, el locus A,
posee 3 caracteres. En
otros casos, como AFLP,
cada banda es un carcter.
Ejemplo de interpretacin
de bandas:

3. Construccin de la Matriz Bsica de Datos (MBD)
(organismos vs estados de los caracteres [1 y 0 segn se
trate de presencia o ausencia de una determinada banda
electrofortica (AFLP)]. Pueden existir datos perdidos,
codificados en el ejemplo con el valor 5.
OTU\pb 200 182 165 140 120 100 94 75
var1 1 1 0 0 0 0 0 5
var2 1 0 0 0 1 0 1 1
var3 0 1 0 5 0 1 1 0
var4 0 0 1 1 0 1 1 0
var5 5 0 0 5 1 1 0 0
4. Obtencin de un ndice de similitud o asociacin
entre todos los pares de organismos (OTUs)
Para expresar de manera cuantitativa el parecido entre
distintas OTUs existen varios coeficientes de similitud
(Jaccard, Dice, Simple Matching, entre otros), que per-
miten calcular las
similitudes o las
diferencias a travs
de operaciones ma-
temticas. Estos
coeficientes pueden
ser clasificados en
cuatro grupos: coe-
ficientes de distancia, coeficientes de correlacin, coe-
ficientes de asociacin y coeficientes de similitud pro-
babilstica. El tipo de estadstico aplicable a un grupo
de datos, para el anlisis de las relaciones genticas
entre OTUs, depende del tipo de datos evaluados. Es-
pecficamente, los coeficientes de asociacin miden las
coincidencias y diferencias en los estados de los carac-
teres entre dos OTUs. Esta medicin exige caracteres de
tipo doble estado. Al comparar dos OTUs para un ca-
rcter doble estado pueden presentarse cuatro posibili-
dades: que las dos OTUs presenten el carcter compa-
rado (caso a), que slo una u otra lo presenten (casos b
y c), o bien que el carcter est ausente en ambas (cado
d).
Los coeficientes de asociacin ms frecuentemente
utilizados como medidas de similitud en anlisis gen-
ticos son:
SM Simple matching: (a+d)/(a+b+c+d).
DICE: 2a/(2a+b+c) (Dice (1945), Nei and Li, 1979)
JACCARD: a /(a+b+c), Jaccard (1908)
Estos coeficientes pueden variar entre un valor mni-
mo de 0 (cuando el par de individuos no tienen
bandas en comn) y un valor mximo de 1
(cuando todas las bandas presentes en un indivi-
duo estn presentes en el otro). Dependiendo de
cul de estos coeficientes se utilice se acentan
distintos aspectos de la similitud.
5. Construccin de una matriz de similitud entre
OTUs.
Esta matriz es triangular, de OTU x OTU (orde-
nadas de igual forma en cada eje). En cada celda
se indica el valor de similitud obtenido para
ese par de OTUs y por lo tanto se obtienen
valores iguales 1 en la diagonal, por tratarse de la simi-
litud con la misma OTU.
Es triangular, pues la similitud entre la OTU1 y la
OTU2 por ejemplo, es igual que entre la OTU2 y la
OTU1, y por lo tanto la matriz superior resulta la ima-
gen especular de la matriz inferior.
Matriz de similitud (MS) obtenida para la MBD cons-
truida en el paso (3), donde se aplic el coeficiente de
Jaccard, con presencia de datos perdidos:

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Var 1 Var 2 Var 3 Var 4 Var 5
Var 1 1
Var 2 0.25 1
Var 3 0.25 0.16 1
Var 4 0 0.14 0.5 1
Var 5 0 0.25 0.25 0.25 1
ndice de similitud de Jaccard (Sim J) entre var1 y
var2=1/4
Sim J entre var 2 y var 3=1/6
6. Conformacin de grupos.
Dado que la matriz de similitud es insuficiente para
expresar las relaciones entre la totalidad de las OTUs
(pues slo expone similitudes entre pares de OTUs), se
desarrollaron gran variedad de tcnicas de anlisis de
matrices de similitud, con el objeto de sintetizar la
informacin de dichas relaciones. La ms utilizada es el
anlisis de agrupamiento; esta tcnica forma grupos de
OTUs que se asocian por su grado de similitud y en
general se utilizan tcnicas secuenciales:
6.1) Se busca en la matriz de similitud, el mayor valor
(sin considerar los valores de la diagonal). Se identifi-
can las OTUs involucradas y stas constituirn el pri-
mer grupo
6.2) Se busca en la matriz, el prximo valor de mayor
similitud y se une al grupo anterior
6.3) Se repite este proceso hasta que se unen todos los
grupos
6.4) El agrupamiento de individuos puede observarse a
travs de una representacin grfica, mediante la cons-
truccin de diagramas arborescentes denominados fe-
nogramas.
Fenograma obtenido con la MS del paso (5)

La incorporacin de una OTU a un grupo existente
puede realizarse de tres formas distintas.
Ejemplo: Matriz de similitud:
OTUA OTUB OTUC
OTUA 1
OTUB 0.7 1
OTUC 0.4 0.3 1
A
B C

1 0.7 0.4 0
Ligamiento simple: la nueva OTU se une al grupo con el
valor de similitud mximo al de las OTUs del grupo existente

Ligamiento completo: la nueva OTU se une al grupo con el
valor de similitud mnimo al de las OTUs del grupo existente
A
B C

1 0.7 0.4 0.3 0
Ligamiento promedio (Unweighted Pair Group Method
Arithmetic Average o UPGMA): la nueva OTU se une al
grupo con el valor de similitud promedio entre la misma y
cada uno de los de las OTUs del grupo existente
A

B C

1 0.7 0.4 0.35 0.3 0

7. Medida de la distorsin del fenograma
El mtodo de ligamiento que se emplea para agrupar los
individuos puede generar distorsiones en el fenograma
respecto de los datos de similitud originales. La cuanti-
ficacin de dicha distorsin se realiza mediante el
clculo de un coeficiente de correlacin denominado
cofentico, que consiste en correlacionar la Matriz de
similitud original con una Matriz cofentica, que surge
de las similitudes observadas entre los pares de indivi-
duos comparados, en este caso, a partir de los datos del
fenograma.
Esquema del Anlisis de Agrupamiento con marca-
dores moleculares AFLP

21
Agosto 2010

GUIA PARA USAR EL NTSYS 1.7/1.8/2.0
El desarrollo de esta prctica tiene como objetivos:
La interpretacin de datos provenientes de marcadores
moleculares.
El uso de tcnicas bioinformticas (NTSys) para estable-
cer relaciones fenticas.
La visualizacin de la aplicacin prctica de ambas he-
rramientas para la evaluacin comparativa de la diversidad
gentica
Construccin de la Matriz Bsica de Datos
Construir la MBD [matriz de variables (bandas) x OTUs]
con los siguientes requisitos: (1) Construccin de la MBD
utilizando Solo texto de cualquier procesador de textos
(2) Si la MBD se construye en Excel, guardar con exten-
sin csv y controlar luegoque los datos estn separados
por comas y no por puntos y comas.
Si se tienen muchos datos, tratar de que sea lo ms angos-
ta posible, si es necesario debe transponerse la matriz.
(3) Puede tambin construirse la MBD en Excel e impor-
tarla desde el editor de matrices del NTSYS versin pc
Cdigos de entrada de los datos
Primer rengln:
1
er

n: 1 si es matriz cuadrada o rectangular (no triangu-
lar)
2
do

n: nmero de filas de la matriz. Si se aclaran los
nombres se coloca L.
3
er
n: nmero de columnas
4
to

n: 1 si existen datos perdidos
5
to
n: nmero asignado para el dato perdido
Segundo rengln:
Identificacin de las OTUs. La nomenclatura de cada
OTU no debe contener signos y no debe superar los 8 ca-
racteres. Se recomienda que los renglones que contengan
los nombres no superen el ancho de la pantalla.
Renglones sucesivos
Se incorporan los datos binarios de cada fila y columna
Ejemplo: Matriz bsica de 5 variedades (filas) por 8 varia-
bles (columnas). Existen datos perdidos que se codifican
con 5. Los 1 indican presencia de banda y los 0 indican
ausencia de banda.
1 5L 8 1 5
var1 var2 var3 var4 var5
1 1 0 0 0 0 0 5
1 0 0 0 1 0 1 1
0 1 0 5 0 1 1 0
0 0 1 1 0 1 1 0
5 0 0 5 1 1 0 0
Una vez confeccionada la matriz en block de notas o bien
programas de texto sin formato o Excel (csv), se recomien-
da comprobar que la matriz no tenga errores mediante el
comando Output del men GENERAL.
Empleo del editor de matrices del NTSYS
1) Construccin de la MBD en Excel siguiendo los mismos
pasos descriptos para su construccin en modo solo tex-
to, exceptuando la identificacin de las OTUs, rengln
que debe dejarse vaco. Tambin debe dejarse vaca la 1
columna, por debajo del 1 nmero en el primer rengln

Cdigo para Matriz rectan-
gular

1 5 8 5
N de columnas (en el ejemplo representan a las variables (ban-
das)

Cdigo utilizado

N de filas (en el ejemplo represen-
tan a las OTUs (variedades)
1 1 0 0 0 0 0 5
1 0 0 0 1 0 1 1
0 1 0 5 0 1 1 0
0 0 1 1 0 1 1 0
5 0 0 5 1 1 0 0
para dato perdido

2) En el programa NTSYS, en la opcin File, debe seleccionarse la opcin Edit data file y abrir el archivo de Excel que
contiene la MBD. En la pantalla de edicin vaca, seleccionar File y luego las siguientes opciones:
Import Excel using OLE. y abrir nuevamente el mismo archivo de Excel que contiene la MBD

De manera automtica se edita la matriz, pudindose con la
opcin Row Labs identificar las diferentes OTUs. Puede observarse que el editor indica el tipo de matriz, nmero de filas y
columnas y el valor asignado a los datos faltantes.
22
Agosto 2010

La matriz obtenida puede guardarse en File, opcin Save file as con la extensin .NTS. Se sugiere guardar la versin
importada desde el Excel sin modificaciones.

PASOS A SEGUIR PARA TODAS LAS VERSIONES DEL PROGRAMA:
1) Control de la Matriz Bsica de Datos (MBD), o cualquier otra matriz generada por el programa

En Men Principal: General, opcin Output
Input file: ingresar el archivo
(extensiones .txt o .nts)
Field width: dejar el valor predeterminado
Decimal places: dejar el valor predeterminado o
modificar segn inters
Page width: cambiar el valor predeterminado a un
valor de
1000
Opcin Compute para hacer correr la matriz

Output: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatis-
tics Inc.
Date & time: 27/07/2004 11:09:15 a.m.
---------------------------------------- Input parameters
Read input from file: A:\Var.nts
Format: width=9 decimals=0
Page width: 80
Field width: 9
Decimal places: 0
Page width: 80
Matrix type =1(rectangular), size =5 by 8, missing value
code =5
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
-------------------------------------------------------------
1 | 1 1 0 0 0 0 0 5
2 | 1 0 0 0 1 0 1 1
3 | 0 1 0 5 0 1 1 0
4 | 0 0 1 1 0 1 1 0
5 | 5 0 0 5 1 1 0 0
Errores que no permiten visualizar la matriz
Cdigos errneos para la entrada de datos (error en el n-
mero de filas y/o columnas.
El nmero de caracteres por label supera los 8 caracteres
permitidos.
Los cdigos de presencia/ausencia son distintos de 1/ 0,
respectivamente.
El cdigo utilizado para definir al dato perdido no es coin-
cidente con los valores adjudicados en el cuerpo de la MBD
y/o el primer rengln de la matriz (ver cdigo de entrada de
datos, pg.8)
Excesivo nmero de columnas, en cuyo caso se sugiere
transponer la matriz

2) Construccin de la Matriz de Similitud (MS)
En Men Principal: Similarity
23
Agosto 2010

opcin SimQual (Similarity
measures Qualitative)
Input file: ingresar el archivo
(extensiones .txt o .nts)
By rows?: la construccin de la MS entre filas o colum-
nas depende de cuales sean las OTUs y cuales las va-
riables, en el ejemplo las OTUs estn dispuestas en las
filas.
Coefficient: eleccin del coeficiente de similitud a aplicar,
en el ejemplo J (Jaccard)
Output file: nombre del archivo donde se va a crear la MS
Positive code: predeterminado
Negative code: predeterminado
Opcin Compute para obtener la matriz

3) Aplicacin del Mtodo de agrupamiento
En Men Principal: Clustering opcin SAHN
(Sequential Agglomerative Hierarical nested cluster
Analysis)
Input file: ingresar el archivo de la MS
Output tree file: nombre del archivo que va a guar-
dar el fenograma
Clustering method: eleccin del mtodo de agrupa-
miento de las OTUs, en el ejemplo UPGMA
In case of ties: La opcin WARN elige slo uno de
los posibles rboles y lo muestra, la opcin FIND
permite ver ms de un fenograma en caso de empate.
Opcin Compute para ejecutar el agru-
pamiento
Permite observar el fenograma obtenido
segn la opcin WARN

24
Agosto 2010

4) Visualizacin del Fenograma
En Men Principal: Graphics opcin Tree plot
Input file: ingresar el archivo del fenograma
Opcin Compute para el dibujo del fenograma

Luego de la obtencin del fenograma, dentro
de Options la opcin Plot options permite el
agregado del Ttulo y subttulo, modificaciones
en el tamao y tipo de letras, definir el gro-
sor de los brazos del fenograma y definir las es-
calas, entre otras posibles.

El fenograma puede copiarse mediante la opcin Edit, luego
copy bitmap y pegarse en programas de texto (ej. Word) y
diseo grfico (ej. Power Point)

5) Obtencin de la Matriz Cofentica
En Men Principal: Clustering opcin Coph
Input tree file: ingresar el archivo del fenograma
Output coph. file: nombre del archivo que va a guardar
la Matriz Cofentica
Opcin Compute para la obtencin de la Matriz

6) Clculo del Coeficiente de correlacin Cofentico (CCC)
En Men Principal: Graphics opcin
MxComp
Input file 1: ingresar el archivo de la Matriz de
Similitud
Input file 2: ingresar el archivo de la Matriz
Cofentica
Normalize Mantel stat?: permite normalizar la
prueba de Mantel
Number of permutations: define el nmero de permuta- ciones que sern empleados en la prueba de Mantel
Opcin Compute para la obtencin del CCC y
prueba de Mantel

MxComp: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatistics Inc. Date & time: 28/07/2004 04:26:28 p.m.
---------------------------------------- Input parameters
Read X input from file: A:\Var Sim.nts Read Y input from file: A:\Var Cof.nts Mantel statistic will be normalized.
1000 random permutations will be performed.
Comments:
SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J
by Rows, += 1.00000, -= 0.00000
Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) Comments:
SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J
by Rows, += 1.00000, -= 0.00000
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SAHN: input=A:\Var Sim.nts, method=UPGMA, tie=WARN COPH: tree=A:\Var Fen.nts
Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) N = 8
Mean X = 0.2574 SSx = 0.0805
Mean Y = 0.2237 SSy = 0.1099
Tests for association:
Matrix correlation: r = 0.91409 (= normalized Mantel statistic Z)
Approximate Mantel t-test: t = 2.7043
Prob. random Z < obs. Z: p = 0.9966
Out of 1000 random permutations:
994 were < Z, 6 were = Z, and 0 > Z
(The observed comparison is not included in these counts.) The one-tail probability is:
p[random Z >= observed Z] = 0.0080
Representacin grfica de la correlacin co-
fentica entre la Matriz de Similitud y la Ma-
triz Cofentica

Bibliografa
Crisci, J.V. y Lpez Armengol, M.F.1983. Intro-
duccin a la teora y prctica de la taxonoma
numrica. Secretara General de la Organizacin de
los Estados Americanos. Programa Regional de
Desarrollo Cientfico y Tecnolgico, Washington
D.C.(Serie de Biologa, n26). 132 pp.
Dice, L. R. 1945. Measures of the amount of ecolog-
ic association between species.
Ecology, 26: 297-302.
Jaccard, P. 1908. Nouvelles rescherches sur la distri-
bution florale. Bull. Soc. Vaud.
Sci. Nat., 44:223-270.
Johnson, S.C. 1967. Hierarchical clustering schemes.
Psychopmetrica. 32: 241-254. Rohlf, F.J. 1998.
NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariate
analysis System, Version 2.0. Exeter Software, Se-
tauket., N.Y.

TP 7: Cuantificacin por PCR en tiempo real de secuencias diagnsticas
Paula Fernndez
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reaccin en Cadena de la polimerasa es una reaccin de
biologa molecular extremadamente sensible y altamente
especfica. Esta metodologa permite la deteccin, cuantifi-
cacin e identificacin especfica de secuencias blanco de
inters presentes en el genoma o muestra a analizar. En la
actualidad es un mtodo sumamente utilizado en diferentes
reas.
El fundamento de la PCR consiste en la multiplicacin in
vitro de un fragmento de ADN, mediante un proceso deno-
minado amplificacin, con el fin de aumentar su concentra-
cin hasta obtener una cantidad de copias de ADN que per-
mita ser detectado. Este proceso de amplificacin es funda-
mental porque las secuencias de ADN a detectar se encuen-
tran en muy baja proporcin con respecto al ADN total de la
muestra analizada.
Para la reaccin de PCR se requieren, adems del ADN en
estudio, los 4 nucletidos (unidades constitutivas del ADN),
una enzima denominada Taq ADN polimerasa, que es la
encargada de sintetizar las millones de copias de un mismo
fragmento de ADN y por ltimo un par de cebadores (pri-
mers en ingls) que son pequeas secuencias de ADN de
simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se
encargan de indicarle a la enzima donde iniciar la sntesis de
nuevas copias de ADN.
La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad
de los cebadores para reconocer por complementaridad de
bases una secuencia particular de ADN y para ello es necesa-
rio conocer, al menos parcialmente, la secuencia del ADN
que se quiere detectar para disear los primers adecuados.
La reaccin ocurre en un equipo denominado termociclador
que regula los tiempos y temperaturas ptimos para que ocu-
rra la reaccin. La reaccin tiene tres etapas: desnaturaliza-
cin, hibridacin y elongacin.
Etapa de desnaturalizacin, donde se produce la separa-
cin de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como
cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94C o 95C.
Etapa de hibridacin (annealing en ingls) donde ocurre
el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias
complementarias. Esta etapa se realiza a una temperatura que
resulta la ptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura
vara de acuerdo al diseo de los primers y se encuentra den-
tro de un rango que va desde los 50 C hasta los 70 C. En
esta etapa slo se produce la hibridacin si el ADN de la
muestra que se estudia contiene las secuencias buscadas. Si
ellas no estn presentes, no habr unin y por lo tanto, no
habr amplificacin.
Etapa de elongacin, donde ocurre la sntesis de dos
nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la
accin de la enzima Taq polimerasa. Esto se desarrolla a una
temperatura de alrededor de 72 C, que es la temperatura
ptima de accin de la enzima.

Estas tres etapas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se
repiten de 30 a 50 veces.

26
Agosto 2010

Esquema de la amplificacin por PCR.
www.porquebiotecnologia.com.ar

Cintica de la Reaccin
La cintica de la reaccin de PCR tiene tres momentos o
fases:
La fase inicial, donde se encuentran pocas molculas de
secuencias blanco (target) y alta concentracin de los reacti-
vos de PCR.
La fase exponencial, donde la eficiencia de la sntesis de
las nuevas cadenas es mxima debido a que hay abundancia
de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la
relacin entre producto de PCR formado y el nmero inicial
de molculas de ADN presentes en la muestra es directamen-
te proporcional.
La fase de plateau, donde los reactivos de PCR se agotan y
existe un exceso de producto amplificado. All la eficiencia
de sntesis decae.

Grfico de la Cintica de reaccin de la PCR.

Dentro de la metodologa de PCR hay dos modalidades que
son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo final y
PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un termociclador.
La diferencia que presentan estas dos modalidades es la for-
ma y fase en la cual se produce la deteccin del producto de
amplificacin y por lo tanto, en el tipo de resultados obteni-
dos.

PCR en tiempo final
En la PCR en tiempo final una vez concluida la reaccin, los
fragmentos amplificados son separados mediante electrofo-
resis en gel de agarosa y visualizados bajo luz ultravioleta
por medio de un colorante fluorescente (bromuro de etidio).
Se busca la presencia o ausencia de bandas de un determina-
do peso molecular que se corresponden con el tamao del
fragmento amplificado.
La lectura del producto de amplificacin ocurre en la fase de
plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultado obtenido
es cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de inte-
rs) o semicuantitativos (en rangos de concentracin). Para la
obtencin de resultados de tipo cuantitativo por PCR con-
vencional es necesario realizar el anlisis individual de dis-
tintos conjuntos de muestras y tener en cuenta consideracio-
nes estadsticas para el armado y cantidad de conjuntos a
analizar.

Fotografa de los resultados por PCR en punto final. Gel
de agarosa. www.porquebiotecnologia.com.ar

PCR en tiempo Real
La tcnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa a la
PCR en tiempo final que permite la obtencin de resultados
cuantitativos. La denominacin de tiempo real se debe a
que el ADN amplificado puede ser detectado durante todo el
proceso de amplificacin y no al final del mismo, como su-
cede con la PCR convencional.
La PCR en tiempo real combina el uso de un termociclador,
un sistema de deteccin de fluorescencia y una computadora.
El termociclador tiene acoplado un sistema para la deteccin
de fluorescencia. A medida que transcurre la reaccin el
equipo toma seales de la fluorescencia generada y las anali-
za (en "tiempo real"). La seal de fluorescencia recolectada
es analizada por la computadora. La seal generada es direc-
tamente proporcional a la cantidad de producto de PCR am-
plificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la
fase exponencial de la reaccin, se obtiene as una cuantifi-
cacin ms adecuada y precisa del producto amplificado.
Esta metodologa, siempre que sea adecuadamente diseada
y puesta a punto, permite obtener una mayor sensibilidad y
especificidad. Dado que la amplificacin y la deteccin ocu-
rren al mismo tiempo, el anlisis es ms rpido que en la
PCR en punto final. Adems, como no es necesario, manipu-
lar los productos de PCR se reduce la posibilidad de conta-
minacin con estos productos.
Entre las desventajas que presenta frente a la PCR en tiempo
final se pueden sealar su mayor costo, tanto en el equipo
como en los reactivos utilizados, as como la complejidad del
diseo de los primers y sondas, que en muchos casos resultan
ms exigentes.

PCR
en tiempo real
27
Agosto 2010

Esquema de una corrida de PCR. Lectura de Fluores-
cencia en funcin del ciclo de PCR para diferentes con-
centraciones de target.
Para la medicin de la fluorescencia dos son las modalidades
ms utilizadas: las sondas fluorescentes y los agentes interca-
lantes de ADN.
Las sondas son secuencias de oligonucletidos que reaccio-
nan por complementariedad de bases con un pequeo frag-
mento de la secuencia a amplificar. Estas sondas estn mar-
cadas con molculas que emiten fluorescencia cuando se
produce la amplificacin especfica. Las sondas se colocan
en la reaccin de PCR junto con los otros reactivos y sola-
mente se detecta fluorescencia, si la secuencia de inters est
presente en la muestra y hay amplificacin.
Entre las ventajas de estas sondas podemos mencionar la alta
especificidad de la reaccin, debido a que slo se genera
fluorescencia si la reaccin especfica de la PCR ha ocurrido
y la posibilidad de detectar y cuantificar mltiples targets en
una nica reaccin de PCR mediante el uso de varias sondas
distintas en la misma reaccin.
Entre las desventajas que presentan podemos sealar el dise-
o de las sondas que deben resultar especficas y no interferir
con los primers; la necesidad de sintetizar una sonda distinta
para cada target que se quiere detectar; y por ltimo el mayor
costo de la PCR debido a la incorporacin de estas molculas
marcadas.
Existen distintos modelos de sondas. Las ms utilizadas son
las sondas que se hidrolizan (sondas Taqman). Adems se
pueden mencionar las sondas conformacionales (Molecular
beacons, Scorpions, donde lo marcado y diseados espe-
cialmente son los primers) y las sondas de hibridacin.
El otro formato ampliamente utilizado son los agentes inter-
calantes de ADN. El mas empleado es el SYBR Green. El
SYBR Green es una molcula que presenta la caracterstica
de no emitir fluorescencia cuando se encuentra en solucin.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR Green se in-
tercala entre las cadenas de ADN emitiendo as una seal
fluorescente. Este fluorocromo se agregar a la reaccin de
PCR junto con los otros reactivos. Si en la reaccin de PCR
hay amplificacin, el SYBR Green se une al ADN de doble
cadena recin sintetizado en cada ciclo y va generando un
aumento en la seal de fluorescencia que es proporcional a la
cantidad de producto generado durante la amplificacin.
Hay que tener en cuenta que esta reactivo no es especfico de
una secuencia determinada y por lo tanto se intercala con el
ADN doble cadena que puede corresponder tanto a produc-
tos de amplificacin especficos como inespecficos. Para
evitar la generacin de seal inespecfica, que llevar a resul-
tados equivocados, es muy importante la optimizacin de la
reaccin de PCR de manera tal de evitar la formacin de
productos inespecficos de PCR.
Entre las ventajas que presenta con respecto a las sondas se
pueden mencionar que dado que no necesita la sntesis de
sondas marcadas es un mtodo ms econmico. Por otro
lado, puede ser utilizado para la deteccin y cuantificacin
de diferentes secuencias sin necesidad de sintetizar sondas
diseadas especficamente para ello.
Entre las desventajas, en comparacin con las sondas fluo-
rescentes, podemos mencionar su menor especificidad y el
hecho de que no es posible la cuantificacin de diferentes
targets en una nica PCR.
Si bien generalmente se menciona en la bibliografa sobre el
tema que la especificidad es menor a la que se obtiene utili-
zando sondas fluorescentes, es posible lograr alta especifici-
dad. Para ello algunas de las estrategias a utilizar son:
La optimizacin de la reaccin de PCR para la amplifica-
cin de un nico producto, asegurndose la ausencia de pro-
ductos inespecficos.
El anlisis de los productos de amplificacin a travs de
la lectura de la temperatura de fusin (melting point). Esta
temperatura (Tm) es aquella en la cual la mitad de las cade-
nas de ADN estn como doble cadena y la otra mitad estn
desnaturalizadas. Es propia y especfica de cada producto de
amplificacin, dado que dependen del tamao del producto
amplificado y de la composicin de las bases del mismo.
Para llevar a cabo este anlisis, al final de la PCR se progra-
ma el equipo para realizar un paso ms. Este consiste en
aumentar la temperatura muy despacio desde una temperatu-
ra baja (60C) a una temperatura alta (95C). Durante todo el
proceso se monitorea constantemente la fluorescencia gene-
rada y esta seal es recolectada por el equipo. A bajas tempe-
raturas todos los productos de PCR estn en la conformacin
de doble cadena, por lo tanto el SYBR Green se une a ellos y
la emisin de fluorescencia es mxima. A altas temperaturas,
los productos se encuentran desnaturalizados resultando en
un rpido descenso en la seal de fluorescencia.
Al llegar a la temperatura de fusin, se produce un brusco
descenso en la seal de fluorescencia. Este descenso es de-
tectado por el equipo y graficado. As, se obtiene un grafico
de fluorescencia en funcin de la temperatura, donde se ob-
serva un pico (en la primera derivada de este grfico) que
corresponde a la temperatura de fusin del producto.
Si la reaccin ha sido puesta a punto de manera adecuada,
solo se espera ver la presencia de un pico que corresponde al
producto de inters.
Con el mtodo de SYBR Green y analizando las curvas de
melting, es posible diferenciar los aporte a la seal de fluo-
rescencia generada por los distintos productos (sean estos
especficos o inespecficos). Generalmente los productos
inespecficos formados presentan temperaturas de fusin
(Tm), menores a la del producto especfico.

Cuantificacin Absoluta
Determina la cantidad absoluta de muestra (expresado como
nmero de copias o concentracin) Se determina utilizando
estndares externos. Estos estndares poseen secuencias que
Ciclo de PCR
Fluo-
res-
cen-
cia
28
Agosto 2010

son iguales o muy similares a la secuencia target y los sitios
de unin al primer son tambin idnticos. Esto asegura efi-
ciencias de amplificacin equivalentes de las molculas es-
tndar y target. La curva estndar es generada utilizando
diluciones seriadas de los estndares. Comparando los C
T

(ciclo umbral, ciclo en el cual se detecta por primera vez
fluorescencia) de cantidades desconocidas de templado con
los de la curva estndar permite el clculo de la cantidad
inicial de templado usado en la real-time PCR.

Cuantificacin Relativa
Determina la relacin entre la cantidad de muestra blanco y
la molcula de referencia, usualmente un gen de referencia.
Este valor normalizado puede ser utilizado para comparar
expresin diferencial de genes en muestras diferentes. El
caso de aplicacin ms comn de este mtodo es el anlisis
de la expresin gnica o la determinacin de la abundancia
de RNA. El nivel de expresin de las molculas de referen-
cia, como un gen de referencia de expresin estable, no debe
variar bajo ninguna condicin experimental, o an en dife-
rentes estadios del mismo tejido (por ejemplo enfermedad vs.
Muestras normales). Por lo tanto el nivel es utilizado como
un valor de referencia para la cuantificacin.

Consideraciones generales tiles en PCR
Diseo de primers
Longitud 18-30 nucleotidos
Contenido
de GC
40-60%
T
m

T
m
= 2C x (n de [ A+T] + 4C x ( n de[
C+G] )
La temperatura ptima de annealing debe
ser unos grados por debajo de la T
m
(alrede-
dor de 5C)
Secuencia
Longitud ideal del producto entre 100-
150 pb.
Evitar la complementariedad de 2 o ms
bases en los extremo 3 de los pares de
primers para reducir la formacin de dme-
ros.
Evitar seguidillas de 3 o ms Guaninas en
el extremo 3.
Evitar que el extremo 3 termine con
Timina ya que tienen una alta tolerancia a
los missmatch.
Evitar la complementariedad de secuen-
cias dentro de la secuencia del primer y
entre los pares de primer.

Nmero de ciclos
Por lo general los programas constan de 35 a 45 ciclos, pero
se pueden llevar a cabo hasta 55 ciclos. Sin embargo, llevar a
cabo tantos ciclos aumentar el background de productos
inespecficos y resultara en un inadecuado anlisis de las
curvas de melting, ya que estas se llevan a cabo una vez
completada la corrida.

Controles del proceso
Dada la alta sensibilidad de la tcnica de PCR, es necesario
siempre descartar la ausencia de contaminacin. Para ello se
utilizan controles negativos para el control de contaminacin
de reactivos o de la matriz a analizar, as como para chequear
la ausencia de falsos positivos productos de reacciones ines-
pecficas. Para ello, se utilizarn como controles de la reac-
cin de PCR:

Control negativo de PCR. Este control contiene todos los
componentes de la reaccin excepto el templado (ADN).
Este control debe dar negativo (ausencia de amplificacin
especfica). Se lo utiliza para descartar la contaminacin en
los reactivos de PCR utilizados.
Control negativo de matriz. Este control es una muestra
que no presenta la secuencia target. Esta muestra sigue el
mismo proceso que las muestras a detectar. Su resultado
debe indicar ausencia de amplificacin especfica. Se la utili-
za para descartar la presencia de contaminacin desde la
extraccin de ADN hasta la PCR.

Adems de los controles negativos se incluyen siempre con-
troles positivos. Ellos permiten la evaluacin al final del
proceso de la eficiencia, la especificidad y la sensibilidad de
la reaccin. Asimismo, permiten detectar la presencia de
sustancias inhibidoras que afectan la reaccin de PCR. Se
utilizan muestras que contienen la matriz y la secuencia de
ADN a determinar. Ellas son includas desde el comienzo de
la reaccin y acompaan todo el proceso.
Generacin de curvas estndar
Para generar una curva estndar para PCR en tiempo real, se
necesitan al menos 5 concentraciones conocidas y la canti-
dad de la muestra desconocida debe caer dentro de ese ran-
go. Los estndares deben poseer el mismo sitio de unin al
primer, la misma secuencia entre los sitios de unin al pri-
mer, y las mismas secuencias ro arriba y ro abajo de la se-
cuencia a amplificar que la muestra a ser cuantificada.

Objetivos del TP demostrativo:
Entender el procedimiento, tcnica y exigencia en el diseo
de una reaccin o experimento basado en la tecnologa de
qPCR.
Conocer la metodologa de anlisis de una qPCR cuantitativa
y cualitativa.
Interpretar curvas y analizar resultados de experimentos de
qPCR.
Conocer la complejidad, costo y rigurosidad de la tcnica
para poder decidir su aplicacin en el futuro.

Ejemplo: Grafico de la corrida de PCR (Equipo LightCycler de Roche)
- Metodologa: SYBR Green
- Anlisis: Deteccin del Promotor 35S en muestras de maz. Cuantificacin absoluta

Agosto 2010
29

Algunas Reglas Bsicas de Higiene y Seguridad en
Laboratorios
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medi-
das preventivas destinadas a proteger la salud de los que all se
desempean frente a los riesgos propios derivados de la actividad,
para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de
trabajo, como hacia el exterior.
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de prcticas de
sentido comn realizadas en forma rutinaria.
El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la infor-
macin que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el
laboratorio. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcni-
ca, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede susti-
tuir el orden y el cuidado con que se trabaja.
1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en
el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia,
mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionar
alarmas, etc.
2. No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se debern guardar alimentos en el laboratorio, ni en las hela-
deras que contengan drogas.
4. Se deber utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de
laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de
algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de
accesorios colgantes).
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona
es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos
los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier
manipulacin de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se debern utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con
sustancias qumica o material biolgico. Toda persona cuyos guantes
se encuentren contaminados no deber tocar objetos, ni superficies,
tales como: telfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuader-
nos, etc.
8. No se permitir pipetear con la boca.
9. No se permitir correr en los laboratorios.
10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicadu-
ras o impactos se utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas
faciales u otros dispositivos de proteccin. Cuando se manipulen
productos qumicos que emitan vapores o puedan provocar proyeccio-
nes, se evitar el uso de lentes de contacto.
11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos,
mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin.
12. Todo material corrosivo, txico, inflamable, oxidante, radiactivo,
explosivo o nocivo deber estar adecuadamente etiquetado.
13. No se permitirn instalaciones elctricas precarias o provisorias.
Se dar aviso inmediato a la Secretara Tcnica en caso de filtraciones
o goteras que puedan afectar las instalaciones o equipos y puedan
provocar incendios por cortocircuitos (Interno 355).
14. Se requerir el uso de mascarillas descartables cuando exista
riesgo de produccin de aerosoles (mezcla de partculas en medio
lquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias txicas
o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos despus de agita-
cin, etc.
15. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas,
aquellas que pueden ser riesgosas por inhalacin deben llevarse a
cabo bajo campana.
16. Se deber verificar la ausencia de vapores inflamables antes de
encender una fuente de ignicin. No se operar con materiales infla-
mables o solventes sobre llamas directa o cerca de las mismas. Para
calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o planchas
calefactoras blindadas. Se prestar especial atencin al punto de
inflamacin y de autoignicin del producto.
17. El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comu-
nes. Ser conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel
y dentro de bolsas plsticas. El que sea necesario reparar se entregar
limpio al taller.
18. Ser necesario que todo recipiente que hubiera contenido material
inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido,
enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces.
19. Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosi-
vos o material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o
recientes comunes para residuos. En cada caso se debern seguir los
procedimientos establecidos para la gestin de residuos. Consultar al
Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).
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20. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales
inflamables (ms de 5 litros.) deber tenerse a mano un extintor apro-
piado para el material en cuestin.
21. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tam-
bor a un recipiente ms pequeo, realice una conexin con una cadena
del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente de manera
de igualar potenciales y eliminar la posible carga esttica.
22. Al almacenar sustancias qumicas considere que hay cierto nme-
ro de ellas que son incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar
lugar a reacciones peligrosas. Ante dudas consultar al Servicio de
Higiene y Seguridad (Interno 275).
23. No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas,
hgalo en estantes bajo mesadas y en caso de cidos o lcalis concen-
trados (mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro de lo posible en
bandejas de material adecuado.
24. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse
en posicin vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la
pared en sitios de poca circulacin, protegidos de la humedad y fuen-
tes de calor, de ser posible en el exterior.
25. Los laboratorios contarn con un botiqun de primeros auxilios
con los elementos indispensables para atender casos de emergencia.
26. Se informar al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten
dejar equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio.
27. Se anotar en un lugar visible desde el exterior los telfonos de los
responsables de cada laboratorio para que puedan ser consultados en
caso de alguna anomala verificada por el personal de Seguridad y
Control en su recorrida fuera de los horarios habituales de trabajo.
Procedimientos ante emergencias
Emergencias mdicas
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o
ingestin accidental de algn producto qumico, txico o peligroso, se
deber proceder :
1. A los accidentados se les proveern los primeros auxilios.
2. Simultneamente se tomar contacto con el Servicio Mdico
(Interno 482), o al Servicio Mdico de Deportes (784-4351 / 3948)
3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quie-
nes solicitarn asistencia de la Secretara Tcnica (interno 380) para
que enven personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad y Control
o Servicios Generales segn correspondan.
4. El Jefe de Departamento notificar el accidente al Servicio de
Higiene y Seguridad para su evaluacin e informe, donde se determi-
narn las causas y se elaborarn las propuestas para modificar dichas
causas y evitar futuras repeticiones.
Centros para requerir ayuda mdica: S.A.M.E. Telfono 107
Hospital Pirovano Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
Snchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Nios. Dr. P. de Elizalde Av. Montes de Oca 40 Tel.
4307-7491 Toxicologa 4300-2115
QUEMADURAS :
Hospital de Quemados P. Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGA
Hospital Santa Luca San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze Av. Juan B. Justo 4151 Tel 4581-0645/ 2792
Incendio
1. Mantenga la calma. Lo mas importante es ponerse a salvo y dar
aviso a los dems.
2. Si hay alarma, accinela. Si no grite para alertar al resto.
3. Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control
(Interno 311) informando el lugar y las caractersticas del siniestro.
4. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego
es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en
marcha el plan de evacuacin.
5. Si debe evacuar el sector apague los equipos elctricos y cierre las
llaves de gas y ventanas.
6. Evace la zona por la ruta asignada.
7. No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de
puertas. No utilice ascensores. Descienda siempre que sea posible.
8. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
9. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los
equipos especializados se encarguen.
Telfonos tiles
BOMBEROS Telfono 100
DIV.CENTRAL ALARMA: 3812222/3832222/3042222
CUARTEL V DE BELGRANO:
Obligado 2254 Capital Tel. 783-2222
BOMBEROS DE VICENTE LPEZ
Av. Maip 1669 Vicente Lpez. Tel. 795-2222
BOMBEROS DE SAN ISIDRO:
Santa Fe 650 Martnez. Tel. 747-2222
Derrame de productos qumicos
1. Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
2. Notificar a las personas que se encuentren en las reas cercanas
acerca del derrame. Coloque la cinta de demarcacin para advertir el
peligro.
3. Evacuar a toda persona no esencial del rea del derrame.
4. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de
ignicin, y las fuentes de calor.
5. Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario
utilizar una mscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de
derrame.
6. Ventilar la zona.
7. Utilizar los elementos de proteccin personal tales como equipo
de ropa resistente a cidos, bases y solventes orgnicos y guantes.
8. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para
ello extender los cordones en el contorno del derrame.
9. Luego absorber con los paos sobre el derrame.
10. Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la
bolsa roja y cirrela.
11. Comunquese con el Servicio de Higiene y Seguridad para dispo-
ner la bolsa con los residuos.
12. Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la
campana hasta que lo retire para su disposicin.
13. Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
14. Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan
haber sido salpicados por el derrame.
15. Lave los guantes, la mscara y ropa.
--------------------------------------------------------
CUPN PARA ENTREGAR AL DOCENTE
Fecha:
El/La alumno/a ...............................................
de la materia Fitopatologa Molecular ha ledo minu-
ciosamente la gua de Normas de Seguridad que
acompaa esta gua.
--------------------------------------------------------

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