ASPECTOS TERICOS

Tcnica que permite la separacin de molculas por su tamao

molecular.
Cuando un conjunto de molculas en suspensin se someten a
un campo gravitatorio suficientemente elevado puede
conseguirse que tales molculas sedimenten
La velocidad a la que sedimenta una partcula depende:

Naturaleza de la partcula (tamao forma ! densidad"

Naturaleza del medio (viscosidad ! densidad"

#uerza que se aplica a la partcula

CENTRIF!ACIN
Las partculas m"s #randes sedimentan m"s r"pidamente
$a partcula se encuentra sometida a otras fuerzas:
Fuer$a #ravitacional que %ace que la partcula sedimente: m & g'

(
& ) & g
E%ectos de %lotaci&n (rincipio de *rqumides: fuerza ascendente
igual al peso del volumen de fluido desplazado por dic%o cuerpo:
m
&
) & g
(
(
+
m
" ) g ' , r
(
(dr-dt" .
) ' / r
(
0
-0 (partcula esfrica"
1 r
(
1
g (
(
+
m
" -2 ' (dr-dt"
3ir 4a5riel 3to6es (789,": $a %uer$a %riccional 'F( que act:a so5re
una partcula esfrica ! rgida de radio r
(
que est; sedimentando a una
velocidad dr-dt en un medio cu!a viscosidad es viene dada por la
e&presin:
# ' , r
(
(dr-dt" fuerza en sentido contrario al
movimiento
Teniendo en cuenta am5as fuerzas la ecuacin anterior puede
escri5irse:
9
) ( g r 2
dt
dr
m P
2
P

=
)elocidad de sedimentaci&n de una partcula*
<l campo centr%u#o ! viene determinado por la velocidad angular de
giro ! por el radio de giro (distancia de las partculas al eje de
rotacin"
! +
,
- r
3e suele e&presar como m:ltiplo del campo gravitatorio terrestre:
Campo centrfugo relativo (=C#" ! se e&presa en unidades conocidas
como >g?
) / (
60
) ( 2
s rad
rpm
=
r rpm
r
rpm
RCF =

=
2 5
2 2
) ( 10 119 . 1
980
3600
) ( 4
) (
2
g
g
r
RCF

=

g'28@ cm
s+1
An campo centrfugo de 7@@.@@@ g %ace
referencia a un campo 7@@.@@@ veces
superior al gravitatorio terrestre
(ara partculas no esfricas se inclu!e en
el denominador la relacin entre
coeficiente friccional de la molcula ! el de
una esfera con el mismo radio efectivo
(f-f
@
"
) (f/f 9
) ( r r 2
dt
dr
o
m P
2 2
P


=
COEFICIENTE .E SE.I/ENTACIN 'S(* velocidad a la que
sedimentara una partcula en un campo centrfugo unitario
$a unidad es el 3ved5erg ' 7@
+70
s
r
dt dr
S

=
2
/

)elocidad de sedimentaci&n de una partcula sometida a un campo centr%u#o*

$a relacin entre el coeficiente de sedimentacin ! la masa molecular
de una partcula no es lineal sino que depende de las propias
partculas.
/acromol0cula Relaci&n Ran#o de
/r
Protenas S+ 1211,3, - /
1245
61
3
761
5
RNA S+ ,246 8 121,, - /
1239
.NA lineal S+ ,2: 8 1211:9 - /
1235;
61
4
761
:
.NA circular S+ ,25 8 12165<; - /
1233<
61
4
761
5
.NA
superenrollado
S+ 5233 8 1211,3 - /
12<:
61
4
761
5
.NA sencillo S+ 12161< - /
12<3;
61
4
761
:
Cromatina S+ 12166 - /
12<<3
<l valor de 3 para una partcula o 5iomolcula depende de varios factores como:

Caractersticas de la macromolcula

Condiciones e&perimentales en las que se realiz la medida

$as propiedades del medio en el que se produce la sedimentacin de la partcula

COEFICIENTE .E SE.I/ENTACIN 'S(
<standarizacin del medio para comparar el comportamiento
de las partculas: agua a 1@BC (3
1@C
".
Duc%as 5iomolculas no son solu5les o esta5les en el medio
est;ndar
Coeficiente de sedimentacin en el medio ! temperatura m;s
adecuados (3
tm
"
) (
) (
dt
dr
r
1
) (
) (
S S
m t, P w 20,
w 20, P m t,
2
m t, P w 20,
w 20, P m t,
m t, w 20,
+
+

=
+
+
=
INSTR/ENTACIN
TIPOS .E CENTR=F!AS
3e pueden diferenciar en:

la velocidad m;&ima que alcanzan

la presencia o ausencia de vaco

posi5ilidad de controlar la temperatura

el volumen m;&imo de muestra

Centrifugas disponi5les en el mercado:

Centrfugas preparativas de gran capacidad ! 5aja velocidad

Centrfugas preparativas refrigeradas de alta velocidad

Altracentrfugas analticas

Altracentrfugas preparativas

Centrfugas clnicas de escala grande

Dicrocentrfugas de la5oratorio de pequea escala

Altracentrfugas: Ee5en de incorporar un sistema de vacio. <l rotor %a de
girar en una c;mara que opere a una presin reducida para facilitar la
funcin del rotor ! disminuir el calentamiento que se producira por una
rotacin a presin atmosfrica. $a temperatura tam5in de5e estar
controlada
TIPOS .E ROTORES
/aterial

Altracentrifugacin : aleaciones de titanio

Campos centrfugos menores: aleaciones de aluminio fi5ra reforzada

acero
Rotores %lotantes '>asculantes(* *l actuar el campo centrfugo las
carcasas dnde se introducen los tu5os se orientan a favor del campo
pasando a estar colocadas perpendicularmente respecto a la posicin de
reposo.
Rotores an#ulares : #orman un cierto ;ngulo con la vertical
Rotores verticales: $os tu5os se encuentran dispuestos en posicin
vertical.
(ara un cierto tamao de rotor en los verticales el campo centrifugo sera
ma!or. 3eparaciones m;s r;pidas !a que la distancia que recorre la
muestra es el di;metro del tu5o.
3i el material sedimentado so5re la pared del tu5o no esta mu! compacto
puede desprenderse
Rotores ?casi verticales@
<l campo centrfugo que
act:a no es uniforme !a
que la distancia al eje de
giro no es la misma desde
el fondo del tu5o que
desde su parte superior. 3e
considera referido a la
distancia promedio
No permiten cantidades
grandes de muestra (%asta
apro&. 1@@ ml"
=otores flotantes (5asculantes"
Rotores an#ulares
<l campo centrfugo no es
tampoco uniforme
*dmiten un gran volumen de
muestra (seg:n modelo %asta F9
l"
Rotores verticales
<l campo centrfugo es m;s
uniforme
*l igual que los angulares permiten
ma!or volumen de muestra que los
flotantes
Factor A de un rotor
Gndica la capacidad centrifugadora de un rotor. 3e define como:
2
max
min
max
11
max
) (
) ln( 10 53 . 2
rpm
r
r
k

=
3e suele dar para la velocidad m;&ima de un rotor. (ara
cualquier otra velocidad se puede calcular como:
2
max
max
) (
rpm
rpm
k k =
3i se conoce el coeficiente de sedimentacin de una partcula se
puede calcular el tiempo en %oras necesario para precipitarla
S
k
t
max
=
* menor valor de 6 ma!or capacidad
Selecci&n de tu>os de centr%u#as adecuados*
H<vita prdidas o filtraciones de la muestra
H4arantiza compati5ilidad qumica
H(ermite una f;cil recuperacin de muestras
Factor de importancia en la selecci&n del material de un tu>o 'pl"stico(*
HClaridad
H=esistencia qumica
HDecanismo de sellado (de ser necesario"
TIPOS .E CENTRIF!ACIN
<n funcin del volumen de muestra:
*naltica
(reparativa
/O.OS .E CENTRIF!ACIN PREPARATI)A*
CENTRIF!ACIN .IFERENCIAL
3edimentan primero las partculas m;s grandes las m;s
densas o las m;s esfricas (a igualdad de masa !
densidad"
$as diferentes partculas de un %omogenado pueden separarse por
centrifugacin precipit;ndolas mediante etapas sucesivas por incremento
de la fuerza ejercida o del tiempo de centrifugacin.
No es un proceso demasiado resolutivo
) (f/f 9
) ( r r 2
dt
dr
o
m P
2 2
P


=
CENTRIF!ACIN .IFERENCIAL
'lavado(
CENTRIF!ACIN BONAL

3epara las partculas en funcin de su coeficiente de sedimentacin

3e emplean tu5os de centrfuga en los cuales se %a formado un

gradiente

$a muestra se aplica en una 5anda discreta encima del gradiente

)ol:menes de muestra m;s pequeos que en la centrifugacin

diferencial

la muestra (particulas I disolvente" %a de tener una densidad

menor a la del lmite inferior del gradiente

$a densidad de las partculas utilizadas no de5e ser menor a la de

los gradientes

<l tiempo es esencial. 3i las centrifugaciones son mu! largas las

partculas pueden precipitar en el fondo del tu5o

<l proceso muestra una 5uena resolucin

No es aplica5le en estados iniciales cuando el %omogenado

contiene demasiados componentes

<s ideal para separar partculas que posean un tamao definido

CENTRIF!ACIN BONAL
CENTRIF!ACIN ISOP=CNICA

$a separacin se realiza tan solo en 5ase a la densidad de las

partculas.

$a densidad de las partculas utilizadas de5e estar dentro de los

lmites de las densidades de los gradientes.

3e parte de un sistema %omogneo en el que las partculas se

encuentran suspendidas en disoluciones autoformadoras de
gradientes (CsCl Cs
1
3J
/
KLr KG NaLr NaG =5Lr =5Cl
tricloroacetato de =5 o Cs".

*l aplicar la fuerza centrfuga se genera el gradiente ! las

partculas se mueven en funcin de sus diferencias de densidad con
el medio que las rodea %asta alcanzar un punto en el cual (
(
+
m
" '@.
Ana vez que se alcanza este cuasi equili5rio el tiempo de la
centrifugacin !a no influ!e en la migracin de partculas

<l proceso muestra mu! 5uena resolucin

$imitacin: efecto de las sales en la via5ilidad de las partculas o

so5re la estructura nativa de las 5iomolculas
CENTRIF!ACIN ISOP=CNICA
Preparaci&n de #radientes
4radientes
discontinuos
continuos
lineal
cncavo
conve&o
!radientes discontinuos: se deposita en un tu5o de
centrfuga cuidadosamente ! de forma secuencial disoluciones
de densidades decrecientes
!radientes continuos: se emplea un equipamiento sencillo
mediante un gradientador o un formador de gradientes
e&ponencial
!radientador: Eos recipientes comunicados entre si (vasos comunicantes"
3ecciones iguales
lineal
L F *
cncavo
L M *
conve&o
APLICACIONES
APLICACIONES
.eterminaci&n del coe%iciente de sedimentaci&n de protenas
Dediante centrifugacin zonal en gradientes de densidad en
condiciones en las que la velocidad de sedimentacin es constante a lo
largo del gradiente ! proporcional al coeficiente de sedimentacin
4radientes isocinticos: el ma!or campo centrfugo que act:a so5re
una molcula seg:n se va alejando del eje de giro queda compensado
por la ma!or resistencia que ofrece el medio al avance
APLICACIONES
Centri%u#aci&n isopcnica de muestras de .NA
<l EN* circular superenrollado
une menos <tLr.
Cuanto ma!or es la cantidad de
<tLr unido la densidad es menor
(la estructura resultante es
menos compacta"
APLICACIONES
LTRACENTRIF!ACIN ANAL=TICA
Determinacin de parmetros moleclares
!"#ar el #rado de pre"a
Precisa de sistemas de observacin$ se o%ser&a lo 'e ocrre en la
mestra drante la aplicacin del campo
eci!iente de m"estra$ c(llas de centri)#acin$ cilindros en los 'e *a+
na per)oracin c+a seccin trans&ersal tiene )orma de sector circlar, dos
laminas de car"o adosadas a las %ases del cilindro de)inen la ca&idad de la
mestra. -a )orma del este alo.amiento e&ita 'e *a+a sedimentacin en las
paredes
T%e instrument spins t%e
protein sample under vacuum
at a controlled speed and
temperature C%ile at set times
recording t%e concentration
distri5ution. Eepending on t%e
rotor t%e speed ma! 5e as %ig%
as ,@@@@ rpm (C%ic% is
equivalent to 19@@@@ & g". #or
t%e measurements special cells
are used to Cit%stand t%e %ig%
gravitational field and C%ic%
alloC t%e passage of lig%t
t%roug% t%e sample
A$T=*C<NT=G#A4*CGNN
*N*$OTGC*
Gnicialmente: clula ocupada por la disolucin de soluto
*l producirse la sedimentacin: surge una discontinuidad en el medio
lquido %a5r; una zona en la que slo %a!a disolvente ! otra en la que
%a!a disolucin. *simismo %a5r; soluto que %a!a sedimentado en el
fondo del tu5o.
<l sistema ptico de a5sorcin muestra un aumento de a5sor5ancia al
pasar de la zona en la que slo %a! disolvente a aquella en la que %a!
disolucin
Tomando medidas a diferentes tiempos de
centrifugacin se puede determinar la
velocidad de desplazamiento del soluto
<l coeficiente de sedimentacin viene definido por:
2 2
1 ln
dt
r d
r
dt
dr
S = =
En la representaci&n de lnr vs t la pendiente de la recta es el valor de S
E-perimentos de sedimentaci&n de equili>rio: la velocidad de
centrifugacin es menor a la requerida para los e&perimentos de
velocidad de sedimentacin. * medida que el soluto comienza a
sedimentar %acia el fondo de la clula ! la concentracin en el fondo
aumenta la difusin se opone al proceso de sedimentacin: Eespus
de un cierto tiempo se alcanza el equili5rio. 3e mide la distri5ucin de
concentraciones de soluto en la clula en el equili5rio. Permite
conocer la masa molecular del soluto anali$ado
Fi#2 <2 3imulated sedimentation equili5rium
data for 1 species c7 (/@ 6E" and c1 (8@ 6E" at
an angular velocit! of 79@@@ rpm. T%e
distru5ution of total solute concentration in t%e
cell is also s%oCn (c0".
Se cumple que*
ln c'r(Cc'r
1
( + / '67(
,
'r
,
7r
1
(C,RT
c(r": concentracin a la distancia r
c(r
@
": concentracin de protena en la interfase
: volumen especfico parcial
A$T=*C<NT=G#A4*CGNN *N*$OTGC*