PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA VEGETAL

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

1.

OBJETIVO.

Preparar los medios necesarios para induccin de callo a partir de raz de zanahoria, introduccin
en cultivo in vitro de tallo de crisantemo, micropropagacin de olivo y medio de enraizamiento de olivo
que se necesitarn para las prcticas de la asignatura.
2.

MATERIAL
Agitador magntico
Imanes para agitar
Probetas
Pipetas automticas de 1 y 10 ml
Soluciones madre
Agar
Sacarosa
Granatario
Balanza de precisin
pHmetro

3.

METODOLOGA
3.1. Introduccin in vitro de tallo de crisantemo
Para esta prctica se utilizarn 3 medios: A, B y C que difieren entre s slo en lo que respecta a las
hormonas. El medio base es el que se describe en los prrafos 1 y 2 a, b, c y de del apartado 3.1. y se
preparan como all se describe. Se preparar un volumen de 500 ml de cada uno de los medios A, B,
yC

Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 200 ml de agua

destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solucin, los siguientes volmenes de soluciones
madre:
1) Compuestos inorgnicos
a) Macronutrientes
50 ml de solucin madre
50 ml de solucin madre
50 ml de solucin madre
50 ml de solucin madre
50 ml de solucin madre
b) Micronutrientes
50 ml de solucin madre

de NH4NO3 del medio MS 10 X

(16.5 g/l)
de KNO3 del medio MS 10 X
(19.0 g/l)
de CaCl2.2H2O del medio MS 10 X (4.4 g/l)
de MgSO4.7H2O del medio MS 10 X (3.7 g/l)
de KH2PO4 del medio MS 10 X (1.7 g/l)
de FeSO4.7H2O y Na2EDTA.2H2O del medio MS 10 X (0.278 g/l del
primero y 0.372 g/l del segundo

5 ml de solucin madre de MnSO4.H2O 100X de 1.69 g/l

5 ml de solucin madre de ZnSO4.7H2O 100X de 0.86 g/l
5 ml de solucin madre de H3BO3 100X de 0.62 g/l

5 ml de solucin madre de KI 100X de 0.083 g/l

5 ml de solucin madre de Na2MoO4.2H2O 100X de 0.025 g/l
0.5 ml de solucin madre de CuSO4.5H2O 100X de 0.025 g/l
5 ml de solucin madre de CoCl2.6H2O 100X de
0.0025 g/l
2) Compuestos orgnicos
a) Vitaminas, aminocidos y hexitoles: 25 ml finales
de solucin madre de tiamina HCl de 0.002 g/l
de solucin madre de cido nicotnico de 0.01 g/l
de solucin madre de Piridoxina HCl
de 0.01 g/l
de solucin madre de Glicina
de 0.04 g/l
de mioinositol de 2 g/l
Carbohidrato
15 g de sacarosa
A continuacin veremos las hormonas que cada uno de estos medios contiene:
MEDIO A: medio base + kinetina (K) 2 mg/l y cido indolactico (IAA) 4 mg/l
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml: 0.5 ml de solucin de K de 0.002 g/ml
0.5 ml de solucin de IAA de 0.004 g/ ml
MEDIO B: medio base + bencilaminopurina (BAP) 1,5 mg/l y 0,5 mg/l IAA.
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml de medio 0.5 ml de solucin de BAP de 0.0015 g/ml
0.0625 ml de solucin de IAA de 0.004 g/ml
MEDIO C: medio base +Acido giberlico (GA3 ) 3 mg/l
Se prepara medio base y se le adiciona para 500 ml de medio: 0.5 ml de solucin de GA 3 de 0.003 g/ml
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solucin hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se aaden 3.75 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razn de
15 ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 C.
3.2. Medio para micropropagacin de olivo. Se preparar un volumen de 500 ml.
Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 150 ml de agua
destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solucin, los siguientes volmenes de soluciones
madre:
a)
50 ml de solucin A
50 ml de solucin B
50 ml de solucin C
50 ml de solucin madre D
10 ml de solucin madre E
5 ml de la solucin F1
5 ml de F2
50 ml de H
b) Hexitoles
0.5 g de mio-inositol
c) Fuente de carbono
15 g de sacarosa

d) Hormonas: Se preparan como se describe en cada uno de los apartados A, B y C del guin de
prcticas para micropropagacin de olivo
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solucin hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se aaden 3.5 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razn de 15
ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 C.
3.3. Medio para enraizamiento de olivo. Se preparar un volumen de 500 ml.
Se toma un vaso de precipitados de 500 ml, se adicionan aproximadamente 200 ml de agua
destilada y se van adicionando, a la vez que se agita la solucin, los siguientes volmenes de soluciones
madre:
a)
25 ml de solucin A
25 ml de solucin B
25 ml de solucin C
25 ml de solucin madre D
5 ml de solucin madre E
2.5 ml de la solucin F1
2.5 ml de F2
25 ml de H
b) Hexitoles
0.5 g de mio-inositol
c) Fuente de carbono
15 g de sacarosa
d) Hormonas: Se preparan como se describe en cada uno de los apartados A, B y C del guin de
prcticas para enraizamiento
Una vez disueltos todos los componentes, se completa la solucin hasta unos 450 ml, se ajusta el
pH a 5.8, se aaden 3.5 g de agar, se disuelve en microondas, se reparte en tubos de cultivo a razn de 15
ml/tubo y se autoclava 20 min a 121 C.
1.

Bibliografa
lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de

prcticas de

Biotecnologa Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)

Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort.
Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497.
Revilla, M.A.; Pacheco, J.; Casares, A. y Rodrguez, R. In vitro reinvigoration of mature olive trees
(Olea europaea L.) through micrografting. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 32:257-261 1996.