BIOLOGIA MOLECULAR No organismo normal o ciclo de proliferao celular rigorosamente controlado para que as clulas constituam comunidades organizadas.
As clulas cancergenas no se submetem a esse esquema de cooperao, so clulas com o DNA danificado e que, por isso, escapam dos mecanismos de controle do ciclo celular.
O cncer surge de uma nica clula que sofreu mutao, multiplicou-se por mitoses e suas descendentes foram acumulando outras mutaes at darem origem a uma clula cancerosa, portanto a incidncia destes tumores se caracteriza pela proliferao celular anormal. BIOLOGIA MOLECULAR
Os principais segmentos de DNA que participam do aparecimento de tumores so os anti-oncogenes (genes supressores) e os oncogenes, sendo que os primeiros codificam protenas que mantm as clulas G- zero e, portanto, fora do ciclo celular. Como exemplo podemos citar o gene RD, o p53, p16, BRCA1, BRCA2, APC e VHL.
Os oncogenes so derivados de genes normais denominados proto- oncogene, que leva a clula a perder o controle sobre o ciclo mittico, dividindo-se continuamente.
Dentre os oncogenes, uns dos mais estudados o oncogene ras, com suas variantes H-ras, K-ras e N-ras. BIOLOGIA MOLECULAR CNCER
A palavra Cncer empregada para descrever um complexo e heterogneo grupo de estados patolgicos no qual as clulas proliferam descontroladamente e invadem tecidos vizinhos.
BIOLOGIA MOLECULAR O cncer uma enfermidade de carter gentico, que se produz ao serem eliminadas as restries que limitam a diviso celular em clulas de tecidos j diferenciados, produzindo uma massa celular diferenciada do resto, denominada tumor. Nmero de casos de cncer em 2010 BIOLOGIA MOLECULAR Um tumor pode ser:
1 - No invasivo: constitudo por um conjunto de clulas que permanecem encapsuladas no local de origem sem produzir maiores danos aos tecidos adjacentes. Neste caso considera-se o tumor como benigno.
2 - Invasivo: quando somamos ao crescimento e proliferao descontrolados a propriedade de invaso e disperso a outros tecidos com produo de metstase, neste caso o tumor ser catalogado como maligno.
Metstase um tumor secundrio originado pela disseminao de clulas cancerosas procedentes de um primeiro tumor (ou tumor primrio).
BIOLOGIA MOLECULAR Outra forma de denominao do cncer neoplasia, que significa literalmente novas proliferaes ou multiplicao progressiva de clulas, e estas podem se iniciar a partir de clulas normais em qualquer tecido sadio.
BIOLOGIA MOLECULAR CLASSIFICAO BIOLGICA E CLNICA
Tumor benigno: 1) no necessariamente avana para a malignidade, 2) se mantm parecido com o tecido de origem, 3) nem todos os tipos de tecidos podem estar implicados e 4) muitas vezes esto separados do tecido normal por uma espcie de cpsula de tecido conjuntivo.
Citologicamente no se diferenciam muito de clulas normais e os problemas clnicos surgem, em muitos casos, de maneira indireta por presso da massa tumoral sobre nervos ou outros tecidos prximos BIOLOGIA MOLECULAR CLASSIFICAO BIOLGICA E CLNICA
Tumor maligno ao contrrio do anterior apresenta numerosas anormalidades citolgicas, tais como: 1) variaes na forma e tamanho, 2) aumento da densidade e tamanho do ncleo celular, 3) mitoses anormais, 4) no se encapsulam, 5) destroem a membrana basal invadindo vasos sangneos e ndulos linfticos - Angiognese
BIOLOGIA MOLECULAR ANGIOGNESE
Em sua fase inicial, um tumor slido composto por clulas neoplsicas que obtm seus nutrientes e fatores de crescimento por difuso a partir dos tecidos adjacentes.
Focos tumorais maiores que 1 a 2 mm em dimetro necessitam de um suprimento sanguneo garantido, para que continuem a crescer. BIOLOGIA MOLECULAR ANGIOGNESE
Para isso, as clulas tumorais passam a produzir fatores de crescimento (p.ex., VEGF - Fator de Crescimento do Endotlio Vascular e outros) que promovem a formao de novos vasos, num processo denominado angiognese.
BIOLOGIA MOLECULAR Oncologia Molecular
A compreenso dos mecanismos gnicos importante na elucidao do desenvolvimento de diversos tumores, assim como no conhecimento de predisposio gentica em famlias acometidas por casos de cncer.
O diagnstico molecular fornece ao mdico informaes de grande valia tanto para o diagnstico quanto para o prognstico de diversos tipos de doenas.
BIOLOGIA MOLECULAR A clula neoplsica apresenta uma srie de anomalias genticas, grande parte delas somticas (adquiridas).
Evidentemente, existem casos em que a alterao gentica determinante de natureza germinativa, mas estima-se que isso ocorra em apenas 5 a 10% dos tumores.
De maneira simplificada, pode-se dividir os genes associados ao cncer em trs grupos: (1) oncogenes, quando o aumento da funo est associada com neoplasias; (2) genes supressores de tumores, quando o que se encontra no cncer a diminuio de funo ou deleo gnica; e (3) genes de reparo do DNA, cuja ausncia ou reduo de funo se associa com determinados tipos de cncer.
BIOLOGIA MOLECULAR gene supressor de tumor
Um gene supressor de tumor um gene que reduz a probabilidade de uma clula num organismo multicelular se tornar um tumor.
Uma mutao ou deleo de tal gene ir aumentar a probabilidade de formao de um tumor.
Na maior parte dos cnceres, h um gene supressor de tumor deletado ou mutado, impedindo a produo de uma protena ou levando produo de uma protena no funcional.
Os dois membros dessa classe que j foram melhor caracterizados so os genes que codificam para as protenas pRb e p53. BIOLOGIA MOLECULAR Protenas codificadas por genes supressores do crescimento celular
A protena Rb foi inicialmente encontrada como estando mutada em retinoblastomas e depois foi caracterizada como sendo um importante regulador da progresso do ciclo celular.
A protena p53 consiste no mais importante regulador do ciclo celular, com funes que vo desde a parada do ciclo celular at induo da morte celular, sendo estimado que pelo menos 50% dos tumores humanos possuem o gene p53 mutado.
A ausncia de represso da diviso celular ou inibio da morte celular por apoptose, leva a imortalidade celular.
Interao com a matriz extracelular - O anti-oncogene DCC produz uma protena transmembranar que interage com componentes da matriz extracelular, sendo responsvel pela sinalizao da inibio do crescimento por contato entre as clulas, perdida nas neoplasias. BIOLOGIA MOLECULAR Regulao da transduo O anti-oncogene NF-1 age inativando a protena do proto- oncogene ras.
Esta protena um transdutor, que tem como funo levar ao ncleo a informao de que a clula est sendo estimulada por fatores de crescimento ligados aos receptores de membrana.
Em casos de inativao do NF-1 por mutao ou deleo, o sinal transdutor no ser inibido, gerando estmulo contnuo para a clula entrar em mitose.
BIOLOGIA MOLECULAR Receptores Catalticos
-Glicoprotenas transmembranas; -Mais conhecidas so as cinases proteicas; -Esses receptores tm a parte que adere ao sinal qumico (hormnio, fator do crescimento,etc) exposta ma MP e a parte citoplasmtica tem ao enzimtica. -Quando a extremidade externa recebe o sinal qumico, a parte citoplasmtica (cinase proteica) se torna ativa e transfere o grupamento hidroxila da tirosina de certas protenas. -Algumas cinases agem sobre as protenas denominadas RAS (RAT SARCOMA). -Estimula a diferenciao e multiplicao celular.
BIOLOGIA MOLECULAR Regulao da transcrio do DNA - Os anti-oncogenes Rb e p53 so o prottipo deste grupo.
O gen Rb foi o primeiro anti-oncogene a ser descoberto, durante estudos do retinoblastoma, neoplasia maligna da retina.
Ele atua impedindo a clula de sair dos estgios G0/G1 e entrar na fase S do ciclo celular.
Quando a clula sofre estmulos mitognicos, a protena codificada pelo gen Rb inativada, permitindo a progresso do ciclo proliferativo. BIOLOGIA MOLECULAR Os genes supressores de tumor (anti-oncogenes) codificam protenas que inibem a diviso celular.
Por desempenharem esta funo e terem sido descobertos em estudo de tumores receberam esta denominao.
O primeiro gene supressor de tumor descrito foi o Rb o qual est localizado no cromossomo 13q14 e est associado ao desenvolvimento do retinoblastoma, que afeta aproximadamente 1 em 20.000 crianas.
BIOLOGIA MOLECULAR O p53 o gene supressor de tumor mais comumente relacionado aos cnceres humanos. Alteraes nestes genes so encontradas em aproximadamente 70% dos cnceres de clon, em 30 a 50% dos cnceres de mama e em 50% dos cnceres de pulmo.
Alm dos tumores epiteliais, mutao no p53 tem sido encontrada em leucemias, linfomas, sarcomas e tumores neurognicos.
O p53 o mais comumente alterado, sendo encontrado entre outros, nos tumores de bexiga, clon, fgado, pulmo, crebro, mama e algumas leucemias.
BIOLOGIA MOLECULAR Os agentes quimioterpicos e a radioterapia agem sobre as clulas em mitose, causando graves erros em seu DNA e induzindo a apoptose. Isto leva a duas concluses:
(1) essas formas de tratamento no vo ter efeito satisfatrio em tumores com grandes quantidades de clulas com o p53 inativo por no conseguirem induzir a apoptose
(2) em neoplasias sensveis vai haver seleo de clones com p53 deficiente, possivelmente levando recada do tumor com caractersticas mais agressivas e menos responsiva ao tratamento. BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR
Os genes mutantes com um efeito recessivo, isto , nos genes supressores tumorais, expressam por mutao ou deleo nos dois alelos induzindo a formao de um tumor.
BIOLOGIA MOLECULAR Qualquer mudana na sequncia de DNA constitui um erro gentico chamado mutao.
A consequncia de tal erro pode ser de grande extenso, mesmo a troca de um nico nucleotdeo pode ter efeitos importantes na clula, dependendo onde a mutao ocorreu.
Uma mutao em um gene, causada pela alterao na sua sequncia de DNA, pode levar inativao de uma protena crucial.
Por outro lado, a mutao pode ser silenciosa e no afetar a funo da protena. BIOLOGIA MOLECULAR Oncogene a denominao dada aos genes relacionados com o surgimento de tumores, sejam malignos ou benignos, bem como genes que quando deixam de funcionar normalmente, transformam uma clula normal numa clula cancerosa.
As verses de funo normal de oncogenes, os proto-oncogenes, so genes responsveis pelo controle da diviso celular (mitose), da diferenciao celular e da traduo proteica.
Aps sofrer uma mutao gnica somtica, por exemplo, uma translocao, amplificao ou mutao pontual um proto-oncogene torna-se eventualmente um oncogene. BIOLOGIA MOLECULAR Os mecanismos de ao dos oncogenes no esto totalmente elucidados. Alguns oncogenes produzem oncoprotenas, como a bcl-2, IE84 (Citomegalovrus), SV40-T (vrus SV40), E6 (HPV), EBNA- 5 (EBV) e HBx (vrus da hepatite B), que se ligam fortemente e inibem as protenas codificadas por gens supressores do crescimento celular ou indutores da apoptose, como o p53 e o Rb. clula cancergena BIOLOGIA MOLECULAR Os genes mutantes com um efeito dominante, isto , os oncogenes, expressam por mutao ou deleo de um alelo apenas suficiente para induzir a formao de um tumor.
BIOLOGIA MOLECULAR Os proto-oncogenes podem transformar-se em oncogenes atravs de 2 formas:
-mudanas na estrutura do gene, resultando na sntese de oncoprotenas (produtos genticos anormais) tendo funo aberrante.
-mudanas na regulao da expresso do gene, resultando um aumento ou produo inadequada de protenas promotoras de crescimento estruturalmente normais.
BIOLOGIA MOLECULAR Os oncogenes codificam protenas chamadas oncoprotenas que participam na transduo de sinais durante vrias etapas do ciclo celular.
Existem 4 categorias de oncogenes que esto associados a diviso celular e desenvolvimento de cncer que so: fator de crescimento, receptor de fator de crescimento, protenas envolvidas na transduo de sinais e protenas reguladoras nucleares.
BIOLOGIA MOLECULAR Mutao em ponto - o oncogene ras o melhor exemplo de mutao em ponto e est associado a um grande nmero de tumores humanos. Por exemplo, 90% dos adenocarcinomas pancreticos, 50% dos cnceres de clon, endomtrio e tireide e 30% dos adenocarcinomas pulmonares e leucemias mielides apresentam este tipo de alterao.
Translocao cromossmica - o rearranjo do material gentico por translocao cromossmica usualmente resulta em aumento da expresso do proto-oncogene. O melhor exemplo de translocao provocando tumor ocorre no linfoma de Burkitt e resulta no movimento do seguimento contendo c-myc do cromossomo 8 para o cromossomo 14q na banda 32. BIOLOGIA MOLECULAR Amplificao gnica - a ativao do proto-oncogene associada com aumento da expresso de seus produtos pode resultar da reduplicao do DNA, produzindo vrias cpias de proto-oncogene nas clulas tumorais.
O caso mais interessante de amplificao envolve N-myc em neuroblastoma e c-erb B2 em cncer de mama.
BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR MECANISMOS DE INVASO E METSTASE
A invaso e metstase so processos relacionados aos tumores malignos e se desenvolvem em vrias etapas.
Estudos revelaram que embora milhes de clulas do tumor primrio sejam lanadas diariamente na circulao, somente algumas metstases so produzidas.
Isto explicado pelo fato de clulas de um mesmo tumor serem heterogneas e apenas algumas terem potencial metasttico. BIOLOGIA MOLECULAR As clulas normais expressam glicoprotenas transmembrnicas que promovem adeso intercelular, desempenhando importante papel na manuteno da integridade estrutural.
As caderinas so as de maior importncia. No tecido epitelial so chamadas de E-caderina. Alteraes nestas protenas diminuem a adeso entre as clulas e facilitam o desprendimento do tumor primrio e invaso dos tecidos vizinhos.
Caderinas so glicoprotenas formadas pro 700 a 750 AA dependentes de Ca e permitem a ligao entre clulas vizinha. Ligam-se na parte intracelular aos filamentos de actina e ao citoesqueleto. BIOLOGIA MOLECULAR PRINCIPAIS PROTO-ONCOGENES BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR Diagnstico molecular
1) F I S H (HIBRIDAO IN SITU FLUORESCENTE)
O QUE FISH
FISH a abreviao de Fluorescent in situ hybridization (hibridao in situ fluorescente) que define uma tcnica pela qual se realiza o acoplamento (hibridao) de duas fitas de DNA complementares, em lminas para microscopia.
Esta tcnica permite identificar, ao microscpio, a presena, ausncia, quantidade ou localizao de segmentos cromossmicos especficos, atravs de sondas de DNA marcadas com fluorocromos.
BIOLOGIA MOLECULAR A tcnica consiste na hibridizao de uma sonda marcada com corantes fluorescentes ou radioativos, para identificar o seu segmento complementar dentro de uma metfase cromossmica espalhada numa lmina.
O DNA dos cromossomos metafsicos desnaturado na prpria lmina (da a tcnica ser denominada de in situ), iniciando-se, a seguir a hibridizao com a sonda marcada.
A sonda visualizada por fluorescncia, no caso da tcnica de FISH, ou por um filme de raio X.
BIOLOGIA MOLECULAR SINAIS PRODUZIDOS PELA HIBRIDAO
Os sinais coloridos produzidos pela hibridao fluorescente so visveis por meio de microscpio de fluorescncia com epi-iluminao e filtros apropriados.
BIOLOGIA MOLECULAR APLICAES DO FISH NA PRTICA CLNICA
A tcnica de FISH pode ser utilizada para detectar, elucidar e quantificar alteraes cromossmicas numricas e/ou estruturais, tais como as encontradas em:
1)- NEOPLASIAS
O estudo das alteraes cromossmicas presentes nas neoplasias, principalmente hematolgicas, tem grande importncia no auxlio do diagnstico, no prognstico e na monitorizao da doena.
A tcnica de FISH tem a vantagem de poder ser aplicada em diversos tipos de amostras e ser mais rpida porque no necessita de cultivo de clulas.
BIOLOGIA MOLECULAR Por exemplo: A LMC caracteriza-se pela presena da translocao t(9;22) que d origem ao cromossomo Philadelphia.
A sua deteco realizada, geralmente, em preparaes de aspirado de medula ssea. Nesses casos a tcnica de FISH indicada, aps a realizao da citogentica tradicional, nos casos em que:
a) pacientes com diagnstico de LMC apresentarem um rearranjo mais complexo que pode mascarar a presena do cromossomo Philadelphia; b) no so observadas clulas em metfase; c) h necessidade de quantificar a presena de clulas com e sem o cromossomo Philadelphia, seja aps tratamento com Interferon ou aps transplante.
BIOLOGIA MOLECULAR A tcnica de FISH vem sendo aplicada tambm para avaliao de amplificao gnica em alguns tipos de cncer. Assim, por exemplo, diferentes graus de amplificao de N-myc em neuroblastoma e de HER- 2/neu em cncer de mama esto associados a prognsticos e condutas clnicas diferentes.
2) ALTERAES CONSTITUCIONAIS (CONGNITAS)
BIOLOGIA MOLECULAR Diagnstico Molecular 2) PCR Exemplo: Cncer de Mama os principais genes associados com cncer de mama so BRCA1 e BRCA2. Mulheres que possuem mutaes no gene BRCA1 tm 80% de chance de desenvolver cncer de mama e 60% para cncer de ovrio. Foram identificadas trs mutaes especficas mais relevantes para auxiliar o prognstico para cncer de mama: as mutaes 185delAG e 5382insC, no gene BRCA1 e a mutao 6174delT, no gene BRCA2. O gene BRCA1 localiza-se no cromossomo 17 (17q21) e composto por 24 xons e o gene BRCA2 localiza-se no cromossomo 13 (13q12) e possui 27 xons. Estes genes pertencem a uma classe conhecida como supressores de tumor que, em clulas normais, ajudam a impedir o seu crescimento descontrolado (BERNARDI, 2008). BIOLOGIA MOLECULAR Diagnstico Molecular 3) Sequenciamento
O primeiro passo a obteno de fitas simples do DNA que se deseja sequenciar. Essas fitas podem ser separadas pelo aquecimento que quebra as pontes de hidrognio entre as bases do DNA e que mantm as fitas unidas.
Com as fitas separadas, liga-se um oligonucleotdeo sinttico (primer) uma regio pr-determinada de uma das fitas do vetor de clonagem (pela complementariedade das bases nitrogenadas).
BIOLOGIA MOLECULAR A enzima DNA polimerase adiciona desoxinucleotdeos (dNTPs) sequencialmente na extremidade 3 do iniciador (primer), complementar ao DNA molde.
Na prtica, ao tubo de reao, alm do DNA a ser sequenciado, adiciona-se a enzima DNA polimerase, o iniciador adequado e os quatro desoxinucleotdeos (dNTPs):- ATP, TTP, CTP e GTP. A mistura de reao tambm inclui uma pequena quantidade de didesoxinucleotdeos (ddNTPs). BIOLOGIA MOLECULAR Quando um anlogo didesoxinucleotdeo incorporado ao polinucleotdeo crescente no lugar de um desoxinucleotdeo normal (dNTP), o crescimento da cadeia terminada, pois a adio do prximo nucleotdeo requer uma hidroxila (OH) 3 livre, que no est presente nos didesoxinucleotdeos que no possuem hidoxilas nas posies 2 e 3.
Os vrios fragmentos de DNA gerados contendo em uma das extremidades um ddNTP colorido so separados de acordo com seus tamanhos por eletroforese em gel. BIOLOGIA MOLECULAR A fluorescncia identificada assim que o didesoxinucleotdeo passa por um feixe de laser e esta informao enviada diretamente para um computador que a converte em um grfico de picos.
Uma vez determinada a sequncia de nucleotdeos de um gene, ela precisa ser analisada. Para isso ela comparada (alinhada) com sequncias de genes j estudadas depositadas em bancos pblicos que renem sequncias de DNA e de aminocidos e estruturas de protenas. Os principais bancos so o GenBank, o EBI (European Bioinformatics Institute), o DDBJ (DNA Data Bank of Japan) e o PDB (Protein Data Bank). BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR ( verde - A, azul - C, amarelo - G e vermelho - T ). BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR BIOLOGIA MOLECULAR