1

ndice
1. Introduo .................................................................................................... 2
2. Ensaio de Mortalidade com Daphnia Magna ............................................... 4
2.1 Objetivo ................................................................................................. 4
2.2 Material ................................................................................................. 4
2.3 Concentraes ...................................................................................... 4
2.4 Procedimento ........................................................................................ 6
2.5 Resultados ............................................................................................ 6
2.6 Discusso de Resultados ......................................................................... 8
3. Ensaio de Mortalidade com Thamnocephalus platyurus ............................. 9
3.1 Objetivo ................................................................................................. 9
3.2 Material ................................................................................................. 9
3.3 Concentraes ...................................................................................... 9
3.4 Procedimento ...................................................................................... 10
3.5 Resultados .......................................................................................... 11
3.6. Discusso dos Resultados ..................................................................... 12


2

1. Introduo

No mbito da unidade curricular Toxicologia Ambiental, foi proposta a
realizao de dois ensaios ecotoxicolgicos com os crustceos Daphnia magna
e Thamnocephalus platyurus para avaliar a toxicidade da gua de superficial de
um determinado ponto da albufeira da barragem de Alqueva.

A Barragem de Alqueva a stima maior barragem de Portugal (tem 96 metros
de altura), situa-se no rio Guadiana, no interior da regio alentejana, perto da
fronteira espanhola. o maior lago artificial da Europa, com 250 km
2
de
superfcie. A sua capacidade, 4.150 hm
3
, permite a conquista do ttulo de maior
reservatrio de gua portugus. A barragem foi construda com o objetivo de
regadio para toda a zona do Alentejo e produo de energia eltrica para alm
de outras atividades complementares.
1


Ambos os crustceos utilizados nos ensaios, Daphnia magna e
Thamnocephalus platyurus, so bioindicadores para ensaios em gua doce.
Bioindicadores so espcies, grupos de espcies ou comunidades biolgicas
cuja presena, abundncia e condies so indicativos biolgicos de uma
determinada condio ambiental. Os bioindicadores so importantes para
correlacionar com um determinado fator antrpico ou um fator natural com
potencial impactante, representando importante ferramenta na avaliao da
integridade ecolgica (condio de sade de uma rea, definida pela
comparao da estrutura e funo de uma comunidade biolgica entre uma
rea impactada e reas de referncia).

Daphnia magna tem sido usada intensivamente para determinar a toxicidade
de amostra de gua e efluentes. So organismos muito sensveis e a sua
sade facilmente afetada pela dieta e meio de cultura utilizados.
Geralmente so cultivadas entre 20 a 25C. Um nmero de fontes de gua
podem ser adequados para culturas de Daphnia, incluindo o uso de gua

1
Alqueva.com, http://www.alqueva.com/default.html
3

natural. Um meio de cultura aceitvel a agua ionizada reconstituda com uma
dureza de 160 a 180 mg/L de CaCO
2
.
As ninhadas adultas devem ser entre 2 e 4 semanas de idade e os novos da
primeira ou segunda ninhada devem ser descartados. Recm-nascidos usados
num determinado teste devem ser todos da mesma ninhada. Para obter
organismos para teste, os adultos so transferidos para uma novo meio de
cultura no dia anterior ao teste ser iniciado. No dia seguinte, os recm-nascidos
podem ser recolhidos para teste de ciclo de vida parcial de 7 dias que sero
realizados num ou 2 copos de vidro durante 5 dias e tratados como foi referido
acima, at que o teste inicie.
2




2
ASTM, Standard Guide for conducting sediment toxicity tests with freshwater invertebrates, Method E1383-90, Annual Book of ASTM
Standards, Vol. 11.04, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, 1992.
4

2. Ensaio de Mortalidade com Daphnia Magna

2.1 Objetivo

Determinar o efeito de substncias contaminantes de guas superficiais na
imobilidade/morbilidade do crustceo Daphnia Magna ao fim de 24 horas de
exposio. Este teste segue o protocolo descrito na norma ISSO 6341 (1996)
adaptada. Calcular o EC
50.

2.2 Material

gua da Albufeira da Barragem de Alqueva 250 ml
Soluo de referncia (ASTM)
50 Organismos da espcie Daphnia Magna
10 Frascos de vidro de vidro de 25 ml
3 bales de 50 ml
Balana eletrnica

2.3 Concentraes

0%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
0% x
Logo utiliza-se apenas 50 ml de ASTM, 25 ml em cada frasco de vidro.


x =
= 0 ml de gua da barragem
5

25%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
25% x
Logo utilizam-se 37,5 ml de ASTM (18,75 ml em cada frasco de vidro) e
12,5 ml de gua da barragem (6,25 em cada frasco de vidro).

50%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
50% x
Logo utilizam-se 25 ml de ASTM (12,5 ml em cada frasco de vidro) e 25
ml de gua da barragem (12,5 ml em cada frasco de vidro).

75%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
75% x
Logo utilizam-se 37,5 ml de gua da barragem (18,75 ml em cada frasco
de vidro) e 12,5 ml de ASTM (6,25 em cada frasco de vidro).

100%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
100% x
Logo utiliza-se apenas 50 ml de gua da barragem, 25 ml em cada
frasco de vidro.


x =
= 12,5 ml de gua da barragem
x =
= 50 ml de gua da barragem
x =
= 37,5 ml de gua da barragem
x =
= 50 ml de gua da barragem
6

2.4 Procedimento

1 Realizar as diluies acima referidas, cada uma num copo de 25 ml;
2 Recolher 5 indivduos da espcie Daphnia Magna (Juvenis) para cada
copo, perfazendo um total de 50 Daphnia Magna;
3 Em seguida colocar os frascos a uma temperatura de 20C e com um
fotoperodo de 16 horas, ou seja, 16 horas de luz seguidas de 8 horas de
escuro;
4 Aps 24 horas efetuar a contagem das D. Magna e calcular a concentrao
de imobilidade /mortalidade (EC50 (%)) das mesmas usando o mtodo de
Spearman.


2.5 Resultados

Aps a contagem, procedemos realizao de uma tabela demonstrativa dos
resultados.
1 Rplica 2 Rplica
Diluies (%) Vivas Mortas Vivas Mortas
0% 5 0 5 0
25% 5 0 5 0
50% 5 0 5 0
75% 5 0 5 0
100% 5 0 5 0
7







0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
Series1
% Relativa de Mortalidade
(1 Rplica)
8





2.6 Discusso de Resultados

Nos resultados obtidos, pudemos concluir que em todas as percentagens de
concentrao de gua da Barragem do Alqueva, no houve nenhuma rplica
morta, o que nos leva a concluir que a gua de barragem no seja txica para
o crustceo Daphnia magna.
No foi possvel calcular EC
50
porque a populao de organismos sobreviveu
na totalidade. Este parmetro toxicolgico s pode ser calculado quando mais
de metade da populao morrer, o que no foi o caso.





0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
Series1
% Relativa de Mortalidade
(2 Rplica)
9

3. Ensaio de Mortalidade com Thamnocephalus
platyurus

3.1 Objetivo

Determinar o efeito de amostras ambientais de gua superficial da barragem de
Alqueva, na mortalidade o crustceo T. platyurus aps 24 horas de exposio a
essa amostra e, deste modo perceber qual a concentrao mxima por estes
suportada (EC
50
).

3.2 Material

3 Bales de 25 ml
1 Proveta
2 Pipetas e 1 pipetador
1 Copo de vidro
Papel de alumnio
Placa de bioensaio
gua da barragem de Alqueva
Standard Artificial Freshwater meio de cultura

3.3 Concentraes

0%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
0% x
Logo utiliza-se apenas 50 ml de SAF.

x =
= 0 ml de gua da barragem
10

25%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
25% x
Logo utilizam-se 37,5 ml de SAF e 12,5 ml de gua da barragem.

50%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
50% x
Logo utilizam-se 25 ml de SAF e 25 ml de gua da barragem.

75%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
75% x
Logo utilizam-se 37,5 ml de gua da barragem e 12,5 ml de SAF.

100%(p/p) de gua da barragem
100% 50 ml
100% x
Logo utiliza-se apenas 50 ml de gua da barragem

3.4 Procedimento

Preparar trs bales de 25 ml, onde sero feitas todas as diluies de
25%, 50% e 75% e, com a caneta de acetato identificar os bales com
as respetivas diluies;
x =
= 12,5 ml de gua da barragem
x =
= 50 ml de gua da barragem
x =
= 37,5 ml de gua da barragem
x =
= 50 ml de gua da barragem
11

Pipetar para a proveta a quantidade de amostra necessria para a
diluio de 25% e transferi-la para o respetivo balo, repetindo o
processo para as restantes diluies;
Colocar gua-ultra pura em cada um dos bales de modo a perfazer 25
ml;
Preparar a placa de bioensaios e, com uma pipeta, colocar em A
1
, B
1
e
C
1,
1 ml da amostra de gua-pura;
Pipetar para A
2
, B
2
e C
2
, 1 ml da diluio de 25% e repetir este passo
para as restantes diluies;
Colocar 1 ml de gua da barragem em A
5
, B
5
e C
5
;
Com o auxlio de uma pipeta Pasteur retirar 10 organismos;
Revestir a placa de bioensaios com papel de alumnio para evitar que
esta apanhe luz;
Calcular os valores de EC
50
(%), considerando como parmetro de
avaliao a percentagem de mortalidade de organismos teste e
utilizando o mtodo de Spearman.

3.5 Resultados

Diluies Vivos Mortos
0% A1 6 0
B1 6 0
25% A2 5 0
B2 7 0
50% A3 6 0
B3 5 0
75% A4 6 0
B4 7 0
100% A5 5 0
B5 5 0

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3.6. Discusso dos Resultados

Nos resultados obtidos, podemos concluir que sobreviveram todos os
indivduos envolvidos no ensaio da espcie Thamnocephalus platyurus em
todas as concentraes. Em suma, o T. platyurus suporta todas as
concentraes de gua de barragem, sem resultados de mortalidade, aps a
exposio de 24h.
No foi possvel calcular o EC
50
porque a populao de organismos sobreviveu
na totalidade. Este parmetro toxicolgico s pode ser calculado quando mais
de metade da populao morrer.
















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4. Bibliografia

Alqueva. (8 de janeiro de 2014). Alqueva. Obtido de
http://www.alqueva.com/default.html
ASTM, Standard Guide for conducting sediment toxicity tests with freshwater
invertebrates, Method E1383-90, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.04,
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, 1992.
ISO 6341. 1996. Water quality Determination of the inhibition of the mobility of
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test.
International Organization for Standardisation. Geneve, Switzerland.