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Princpios de funcionamento
dos microscpios eletrnicos
Ao fnal desta aula, voc dever ser capaz de:
Situar a microscopia eletrnica como instrumento bsico
no estudo da clula.
Situar a microscopia eletrnica num contexto histrico.
Reconhecer os componentes bsicos do funcionamento
de um microscpio eletrnico.
Discriminar os diferentes tipos de microscpios eletrnicos
de transmisso e de varredura.
Correlacionar os equipamentos usados e as informaes
contidas nas imagens.
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HISTRICO
O sculo XX conheceu uma verdadeira "febre" a partir da
descoberta dos eltrons, feita por Thompson, em 1897. Tanto os clculos
feitos pelos fsicos tericos, quanto os experimentos feitos nos "tubos de
raios catdicos" vieram a provar a natureza ondulatria dos eltrons.
Esses pioneiros provavelmente no faziam a menor idia aonde aquelas
observaes iriam levar, mas o estudo do comportamento ondulatrio dos
eltrons resultou tanto na inveno dos aparelhos de televiso quanto na
de um dos instrumentos fundamentais no estudo da Biologia Celular: o
microscpio eletrnico. No ano de 1926, Bush provou que era possvel
focalizar um feixe de eltrons utilizando uma lente eletromagntica
circular, estabelecendo assim os fundamentos da ptica eletrnica. Com
base nesses princpios, foi iniciada em 1931 a construo do primeiro
microscpio eletrnico por um grupo liderado por Ruska. Pelo enorme
avano que a microscopia eletrnica trouxe para as cincias, Ruska
recebeu o Prmio Nobel na dcada de 80. Em 1939, a Siemens j construa
o primeiro modelo comercial de microscpio eletrnico.
Os microscpios eletrnicos so instrumentos fundamentais no estudo da clula.
Foram desenvolvidos na primeira metade do sculo XX, sendo contemporneos
da televiso e dos aparelhos de raios-X.
INTRODUO

Quando falamos em microscpio eletrnico, na verdade estamos
nos referindo a uma famlia de instrumentos que utiliza um feixe de
eltrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Essa famlia
composta por dois tipos de micrscopios: os microscpios eletrnicos
de transmisso e os microscpios eletrnicos de varredura. Os primeiros
se baseiam na capacidade do feixe de eltrons de atravessar a amostra,
enquanto nos segundos o feixe de eltrons percorre a superfcie da amostra
gerando um sinal que ser visualizado num monitor (Figura 2.1).
Figura 2.1: Princpios de funcionamento do microscpio eletrnico de transmisso e do microscpio eletrnico
de varredura. No microscpio eletrnico de transmisso (1) o feixe de eletrns atravessa as reas da amostra onde
tomos mais leves esto presentes. No microscpio eletrnico de varredura (2) a interao dos eltrons com a superfcie
da amostra gera sinais que formam uma imagem num monitor de TV.
ERNST RUSKA
(1906-1988)
Fsico alemo nascido
em Heidelberg, um
dos ganhadores do
Prmio Nobel de
Fsica (1986) por seu
trabalho fundamental
em ptica eletrnica
e por projetar o
primeiro microscpio
eletrnico.
Pesquisador da
Siemens-Reiniger-
werke AG (1937-
1955), diretor do
Fritz-Haber-Institut
der Max-Planck-
Gesellschaft,
Berlim (1955-1972)
e professor na
Universidade Tcnica
de Berlim.
(1) (2)
tela de observao
espcime
monitor
feixe de eltrons
sinal emitido do espcime
gerando imagem
espcime
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imagem observada
diretamente
lente
ocular
lente objetiva
espcime
lente condensadora
fonte de luz
filamento aquecido
(fonte de eltrons)
lente
projetora
imagem em tela
fluorescente
Trs sculos de microscopia ptica serviram para acelerar os
progressos na interpretao das imagens da microscopia eletrnica. Ao
microscpio ptico no difcil determinar o formato geral da clula e a
localizao do ncleo, mas no muito fcil identifcar estruturas dentro
da clula. Por qu? Veja a resposta ao lado.
Mesmo assim, grande parte das estruturas intracelulares, as organelas,
j havia sido descrita ao microscpio ptico. Naturalmente, as funes e
a estrutura detalhada dessas organelas s foram esclarecidas mais tarde.
O grande salto conferido Biologia Celular depois da inveno desse instrumento
reside no grande poder de resoluo que suas imagens possuem.
d= 0,61

onde, d = limite de resoluo
= comprimento de onda da radiao, no caso
de eltrons, 0,37
= abertura da objetiva em radianos (0,5
o
= 0,01rad)
assim,
d = 2,2 no microscpio eletrnico e
= angstron. Sabe quantos angstrons h em 1 m? 1m = 10
10

Isto , no apenas uma questo de aumentar mais as clulas e sim
de permitir que sejam observadas estruturas menores dentro delas.
O microscpio eletrnico de transmisso
O microscpio eletrnico de transmisso idntico ao
microscpio ptico na montagem de seus itens bsicos (Figura 2.2),
apenas maior e invertido.
Figura 2.2: Compar a o ent r e
o mi c r o s c p i o ptico (1) e o
microscpio eltrnico de transmisso
(2) mostrando a posio relativa e a
equivalncia de seus componentes.
Resposta:
Porque so pequenas,
transparentes, de
forma e tamanho
varivel
!
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O que os diferencia fundamentalmente :
1 a fonte: luz visvel no microscpio ptico e feixe de eltrons
no microscpio eletrnico de transmisso;
2 o vcuo na coluna do microscpio eletrnico de transmisso;
3 as lentes: de vidro no microscpio ptico e eletromagnetos no
microscpio eletrnico de transmisso;
4 a espessura da amostra: da ordem de micrmetros (m) no
microscpio ptico e de nanmetros (nm) no microscpio eletrnico.
O feixe de eltrons gerado por um flamento de tungstnio que
aquecido; podemos comparar ao que observamos numa lmpada em
que o flamento aquecido emite o feixe luminoso (e eltrons tambm).
O vcuo, que tambm existe dentro do bulbo da lmpada,
necessrio no apenas para impedir a combusto do flamento na
presena de oxignio como tambm para impedir a coliso do feixe de
eltrons com molculas do ar. Por outro lado, esse um dos fatores que
impossibilita a observao de clulas vivas no microscpio eletrnico
de transmisso.
As lentes magnticas desviam e orientam o feixe de eltrons
da mesma forma que as lentes de vidro desviam e orientam o
feixe de luz; lembre-se de que eltrons so uma radiao de carga
negativa, sendo portanto atrados por cargas opostas e repelidos
por cargas semelhantes.
J a amostra precisa ser cortada em fatias muito fnas para ser
atravessada pelos eltrons. Mesmo a lmina de vidro mais fna barraria
o feixe de eltrons. Por esse motivo so usadas telas de cobre para servir
de suporte para os cortes ultrafnos (o processamento e o preparo das
amostras para observao sero descritos mais adiante).
A seguir voc v uma foto de um microscpio de transmisso;
note como ele bem maior que os microscpios pticos, a comear
pela coluna por onde passa o feixe de eltrons e onde esto distribudas
as lentes magnticas (Figura 2.3).
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Figura 2.3: Microscpio eletrnico Zeiss 900 instalado no Instituto de
Biofsica da UFRJ.
COMO SE FORMA A IMAGEM NUM MICROSCPIO
ELETRNICO DE TRANSMISSO?
Ao interagir com a amostra, os eltrons do feixe podem (Figura 2.4):
1 passar entre os tomos sem colidir com eles;
2 ser barrados por um tomo desviando-se num grande ngulo
(desvio elstico);
3 ser levemente desviados de sua rota por um tomo (desvio
inelstico);
Figura 2.4: Possveis desvios na trajetria de um eltron ao interagir com um tomo.
flamento
posio das
lentes magnticas
Lupa
para observao
da imagem na tela
fuorescente
local onde
colocada a
amostra
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PREPARO DE AMOSTRAS PARA OBSERVAO AO
MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO
O ambiente no interior da coluna do microscpio eletrnico
vcuo, feixe de eltrons no nem um pouco favorvel preservao
da estrutura celular. Alm disso, a composio qumica das clulas,
basicamente tomos leves como C, H, O e N, tambm no propcia
formao de imagens no MET. Por esses motivos, assim como o
microscpio foi-se aperfeioando desde sua inveno, paralelamente
toda uma metodologia de preparao de amostras para observao ao
microscpio eletrnico de transmisso foi sendo desenvolvida.
Destas trs possibilidades de interao resultar a imagem no
microscpio eletrnico de transmisso: os eltrons barrados ou desviados
(2) sero excludos da imagem fnal, resultando em pontos escuros,
enquanto os eltrons que atravessarem a amostra (1 e 3) iro colidir
com uma tela fuorescente, dando origem a pontos claros (Figura 2.5).
Figura 2.5: Formao da imagem no microscpio eletrnico de transmisso.
tela
fluorescente
eltrons barrados
eltrons transmitidos
abertura da objetiva
espcime
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No incio era assim:
A micrografa ao lado foi obtida em 1945 com microscpio
de transmisso utilizando espcime biolgico (um fbroblasto de
embrio de pinto). Repare que uma clula inteira e que a imagem
lembra muito o que observamos em microscopia ptica.

Cortesia de www.rockfeller.edu/rucal/journey/journey.html
O uso de substncias para preservar as estruturas
celulares, chamadas fxadores, tornou o microscpio muito
mais til. Veja na fgura ao lado a imagem de uma clula vegetal
fxada com uma soluo de KMnO4. O citoplasma aparece
vazio, mas muitas estruturas j so reconhecveis. Veja no
fnal da aula, se voc identifcou corretamente as organelas.
O uso mais recente do
glutaraldedo, do OsO4 e de
solues tampo, que mantm o
pH e a osmolaridade adequadas
boa preservao celular,
resulta em imagens como esta,
em que a estrutura da celula
pode ser observada em toda a
sua complexidade.
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As etapas desse processo esto esquematizadas na Figura 2.6 e
so as seguintes:
1 Fixao: Em geral feita mergulhando as clulas ou tecidos em solues
que estabilizam as membranas e os constituintes celulares na forma o mais
prxima possvel da in vivo. Os mais utilizados so o formaldedo (sim, o
formol, tambm utilizado na preservao de cadveres) e o glutaraldedo,
superior ao formol e por isso mais utilizado do que este. Essas substncias,
chamadas fxadores, so empregadas diludas em tampes, que ajudam
a manter o pH e a osmolaridade da soluo fxadora o mais prximas
possvel das condies vitais. Dessa maneira evita-se a deformao ou o
rompimento das estruturas celulares.
2 Ps-fxao e contrastao: Como os seres vivos so compostos
basicamente por tomos leves que desviam pouco ou nada a passagem
do feixe de eltrons, so utilizadas solues de sais de metais pesados
(Fe, Os, Ur, Pb), que, alm de melhorarem a preservao das clulas,
aumentam o contraste das amostras quando observadas ao microscpio
eletrnico de transmisso. Esses sais se impregnam seletivamente nas
membranas (caso do smio e do chumbo), no DNA (caso do urnio)
ou em outros componentes celulares, facilitando a visualizao dessas
estruturas. O tetrxido de smio (OsO4) impregna-se nas membranas
funcionando como um fxador e conferindo simultneamente maior
contraste s mesmas. Por ser utilizado depois do glutaraldedo, um
ps-fxador. J os sais de chumbo e urnio geralmente so utilizados na
ltima etapa de preparao da amostra, logo antes da observao ao
microscpio eletrnico.
3 Desidratao, incluso e microtomia: A fxao confere preservao s
clulas; entretanto, o fato de serem em geral muito espessas e hidratadas
para que o feixe de eltrons possa atravess-las tambm um obstculo
a ser superado. Para isso as amostras tm toda sua gua substituda,
inicialmente por um solvente orgnico como lcool etlico ou acetona, e
em seguida por uma resina que, inicialmente, lquida, mas nas condies
adequadas (em geral ao ser aquecida) endurece, permitindo que as amostras
sejam cortadas em fatias fnas o sufciente para que os eltrons possam
passar nas reas em que no se impregnaram os metais pesados.
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Figura 2.6: Preparo de amostra para microscpio eletrnico de transmisso.
planta animal
fragmento
de amostra
1 fixao:
glutaraldedo
clulas isoladas,
bactrias, etc.
centrifugao
lavagem
ps-fixao:
OsO
4
lavagem
desidratao:
acetona
25% 50% 75% 95%100% 25% 50% 75% 95%100%
resina
lavagem
incluso
polimerizao
(a 60C a resina endurece)
ultramicrotomia
(O tecido cortado
em fatias ultrafinas)
As sees ultrafinas
so coletadas da superfcie
da gua com telas de cobre.
contrastao
Antes de ser levada ao microscpio
eletrnico a amostra, j sobre a grade,
passada por solues de acetato de uranila
e citrato de chumbo, que aumentam
o contraste das clulas.
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Figura 2.7: Corte ultrafno de um hemcito de
caramujo como o visto na Figura 1.8D. Ao mi-
croscpio eletrnico de transmisso podemos
observar que o ncleo no compacto e que di-
versas organelas esto dispersas no citoplasma.
(Foto Marco Antonio Vasconcelos Santos)
!
D uma paradinha!
Eltrons, ftons, fxadores
e microtomia... quanta
novidade, no? Neste
ponto sugerimos que voc
interrompa a leitura e
reveja os muitos conceitos
aqui apresentados, antes
de iniciar a leitura do
texto sobre microscopia
eletrnica de varredura.
Questes de auto-
avaliao sobre este tema
voc encontrar junto
com as de microscopia
eletrnica de varredura.
No plo voc encontrar
material em vdeo sobre
o assunto.
As imagens das amostras observadas ao microscpio eletrnico
de transmisso podem ser fotografadas ou gravadas digitalmente para
registro e estudo posterior (Figura 2.7).
Uma idia mais clara sobre a preparao de amostra para microscopia
eletrnica voc ter consultado a plataforma Cederj.
A microscopia eletrnica de transmisso permite a observao
do interior da clula e de suas estruturas e organelas. Infelizmente,
como a observao em geral feita em fatias muito fnas das clulas,
temos sempre imagens bidimensionais de objetos que, na realidade, so
tridimensionais. Essa difculdade foi, ao menos parcialmente contornada
pela microscopia eletrnica de varredura, onde a resoluo de detalhes da
clula se combina observao da sua estrutura tridimensional.
O MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA
No incio deste texto voc pde observar um esquema muito
simplificado, comparando as imagens obtidas num microscpio
de transmisso com o de varredura (Figura 2.1). A Figura 2.8
compara os componentes do microscpio eletrnico de varredura
com o de transmisso. No microscpio de varredura (Figura 2.8)
um flamento de tungstnio aquecido gera um feixe de eltrons,
que tambm incide sobre a amostra, mas ao invs de atravess-
la varre a superfcie ponto a ponto; porm, nesse caso, ao invs
de atravess-la, interage com a amostra, extraindo da superfcie
desta outros eltrons (chamados eltrons secundrios) que geram
um sinal luminoso que convertido numa imagem (Figura 2.9).
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Como acabamos de comentar, o feixe de eltrons passeia sobre a
amostra, como o feixe de laser sobre o CD que voc ouve. Assim
como de cada ponto do CD extrado um sinal sonoro diferente (a
msica!), cada ponto da amostra interage de modo diferente com
o feixe de eltrons e dessas diferenas so gerados pontos mais ou
menos brilhantes que formaro a imagem. Essa imagem observada
num monitor de TV e pode ser registrada em fotografa ou num
computador. Veja tambm um modelo de microscpio eletrnico de
varredura na Figura 2.10.
Figura 2.8: Filamento aquecido (fonte de eltrons) do MET, apontar a lente objetiva do MEV.
Figura 2.9: Imagens de microscopia de varredura: A: Clulas na fase fnal da diviso. B: Detalhe da
regio anterior do inseto Oncopeltus fasciatus. A sensao de profundidade e relevo so as
principais caractersticas dessa modalidade de microscopia eletrnica.
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Figura 2.10: Foto de mi-
croscpio eletrnico de
varredura Jeol 5310 em
operao no Instituto de
Biofsica da UFRJ.
PREPARO DA AMOSTRA PARA MICROSCOPIA DE VARREDURA
Como, em geral, o objetivo do pesquisador ao utilizar o
microscpio eletrnico de varredura obter informaes sobre a forma
externa das amostras (sejam elas clulas, folhas, insetos, dentes, plos
etc.), estas no so cortadas em fatias. O processamento para observao
no microscpio eletrnico de varredura envolve, aps o tratamento com
solues fxadoras, a secagem do material (para remover toda a gua, j
que esse microscpio tambm opera sob vcuo) e seu revestimento com
ouro ou outro elemento condutor, para gerao do sinal (Figura 2.11).
Para maiores detalhes, consulte a plataforma Cederj.
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Figura 2.11: Esquema das principais etapas do processamento de amostras
para microscopia eletrnica de varredura.
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Outras imagens obtidas com o microscpio de varredura podem
ser observadas nos seguintes endereos da Internet:
http://www.ou.edu/research/eletctron/www-vl/-_links para muitas
colees de imagens, tanto de microscopia ptica quanto eletrnica.
http://www.uq.edu.au/nanoworld/images_1.html
http://www.prbc.hawaii.edu/nanoworld/~kunkel
http://www2.uerj.br/~micron/- laboratrio de microscopia e
processamento de imagens
http://www2.uerj.br/~micron/
Voc tambm pode localizar outros endereos interessantes nos
sites de busca como o:
www.google.com
www.yahoo.com
Compartilhe os resultados de sua busca com seu tutor e com os
colegas do plo.
OUTROS MICROSCPIOS ELETRNICOS
Como comentamos no incio da aula, os
microscpios eletrnicos formam uma verdadeira
famlia. De acordo com os acessrios de que so
dotados ou ainda conforme as amostras sejam
preparadas, diferentes tipos de imagem e de
informao so obtidos.
O MICROSCPIO ELETRNICO DE ALTA
VOLTAGEM
Enquanto no microscpio eletrnico de
transmisso convencional o feixe de eltrons
acelerado de 50 a 80 KV, permitindo a observao
de amostras at 100-150 nm de espessura, no
microscpio eletrnico de transmisso de alta
voltagem a acelerao do feixe de at 1.000
KV. Isso permite a observao de amostras bem
mais espessas (at 2 m!). A maioria das clulas
mais espessa do que isso (5-20 m), mas mesmo
assim aspectos importantes das clulas foram
observados nesse microscpio eletrnico de
transmisso (Figura 2.12)
Figura 2.12: Microscpio eletrnico de alta voltagem (1.000 KV)
instalado na Universidade do Colorado em Boulder. (Imagem
retirada do site http://bio3d.colordo.edu/m.html).
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MICROANLISE
De acordo com a natureza dos tomos presentes na amostra, a
coliso com os eltrons do feixe gera raios-X e outras radiaes que
podem ser captadas por detectores especiais, dando informaes sobre
a composio qumica da amostra. Esses detectores so acessrios que
podem ser adaptados ao microscpio eletrnico de transmisso ou ao
microscpio eletrnico de varredura.
VARREDURA DE ALTA RESOLUO
Nesse microscpio (Figura 2.13) o feixe emitido muito fno,
varrendo reas muito menores da amostra. Assim, detalhes que passam
despercebidos na varredura convencional podem ser resolvidos. Organelas
e flamentos do citoesqueleto (Figura 2.14), que normalmente no so
visveis ao microscpio eletrnico de varredura, podem ser vistas aqui.
Figura 2.13: Microscpio de
varredura de alta resoluo Jeol.
Figura 2.14: Os microtbulos que formam o
citoesqueleto desse protozorio (Herpetomonas
megaseliae) no seriam visveis no microscpio
de varredura convencional.
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R E S UMO
O poder de resoluo da microscopia eletrnica muito maior do que os dos
microscpios pticos porque o comprimento de onda dos eltrons muito
menor do que o da luz visvel. Os princpios da microscopia eletrnica foram
estabelecidos por Ruska no incio do sculo XX. Os microscpios eletrnicos
podem ser divididos em de transmisso e de varredura. Nos primeiros, as imagens
so de cortes ultrafnos ou mostram a regio interna da clula com a estrutura
de membrana, as organelas, como mitocndrias e retculo endoplasmtico etc.
No microscpio de varredura a imagem formada quando o feixe percorre a
superfcie da amostra, arrancando de sua superfcie eltrons que iro formar
uma imagem da superfcie externa que estiver sendo "varrida".
VARREDURA DE PRESSO VARIVEL (AMBIENTAL)
Nesse modelo de microscpio eletrnico de varredura, a presso
na coluna varivel, sendo possvel observar amostra frescas, isto , sem
nenhum tratamento qumico e sem o processo de secagem. Potencialmente,
podem ser observadas amostras vivas nesse microscpio, mas o poder de
resoluo ainda bastante limitado.
Links de interesse:
http://www.mos.org/sln/SEM/works/slideshow/semmov.html
- animao sobre o funcionamento do MEV.
http://www.denniskunkel.com/ - imagens de microscopia ptica
e eletrnica artifcialmente coloridas. Muito bonito!
http://www.molbio.princeton.edu/confocal/510image2/
Zeisslist2.html - Maravilhosas imagens de fuorescncia obtidas em
microscpio de fuorescncia confocal.
http://mgasun.bch.umontreal.ca/protists/gallery.html - imagens de
protistas em microscopia ptica de contraste interferencial e de fase. Links
para imagens desses mesmos organismos em microscopia eletrnica,
mostrando como vrios mtodos de observao deve ser conjugados na
anlise de um organismo.
http://www.msa.microscopy.com/ProjectMicro/Books4.html
- col eo de CD- roms selecionados com comentrios.
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EXERCCIOS
1. Defna, em suas prprias palavras, o que o poder de resoluo.
2. Se uma determinada estrutura mede 100nm de dimetro, quanto medir se
observada ao microscpio eletrnico com 10.000X de aumento?
3. Se a rea de observao na tela do microscpio eletrnico mede 9x9 cm e uma
clula mede cerca de 30 m de dimetro, qual o maior aumento com o qual
poderemos observar toda sua circunferncia?
4. Faa uma tabela comparando o poder de resoluo, a natureza das lentes
e o tipo de emisso do filamento do microscpio eletrnico de transmisso
em relao ao microscpio ptico.
5. A formao da imagem no microscpio de transmisso se d sobre uma tela
fuorescente. Nos pontos em que os eltrons foram barrados pelos tomos da
amostra, a imagem ____________________, enquanto os eltrons no barrados
incidem sobre a tela e fornecem _______________. tomos de elementos mais leves
tendem a ________________ mais eltrons e elementos mais pesados tendem a
____________________mais eltrons.
6. Por que necessrio que a coluna dos microscpicos eletrnicos permanea
sob vcuo?
7. As clulas so hidratadas e, mesmo sendo formadas por elementos leves
(C, H, N, O), so muito espessas para permitir a passagem de um feixe de eltrons.
Quais os principais processos a que precisam ser submetidas antes da observao
ao microscpio de transmisso?
8. No microscpio eletrnico de varredura as imagens so _______________.
O feixe de eltrons _______________ a superfcie da amostra gerando um sinal
para um monitor de TV.
9. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
transmisso: ______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
10. So bons exemplos de estrutura mais bem visualizadas no microscpio de
varredura:__________________________________________________________________
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