Anda di halaman 1dari 9

PEWARNAAN BAKTERI

I. TUJUAN
Mengetahui apa itu pewarnaan sederhana dan differensial
Mengetahui cara pewarnaa sederhana dan diferensial

II. LANDASAN TEORI
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
(Jimmo, 2008).
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan
cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan
pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan
granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan adalah
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti
sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat
warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang
khas bagi suatu spesies

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan diferensial, pengecatan khusus (struktural)dan
pengecatan negatif.
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Disebut demikian karena Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang
menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) dengan tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil,
spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna
sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna
saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam
bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat
morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan
adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5
detik).

2. Pewarnaan differensial
Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan bakteri yang menggunakan
lebih dari satu zat warna, dan merupakan prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe. Pewarnan
diferensial dibagi menjadi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.
a. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram adalah suatu tehnik untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik
ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini
diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding
sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel.
Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang
tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk
membantu determinasi suatu bakteri.

b. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak
dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika
bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses
pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa
mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol.
Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan
bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada
beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara
menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

3. Pewarnaan khusus
Pewarnaan khusus adalah pewarnaan untuk melihat struktur tertentu bakteri :
pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik
pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak
digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu
dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan
untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .
Prinsip kerja:
Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-
pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali
mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan
dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan
mengambil warna biru dari methylen blue.
Pewarnaan flagel
Flagel merupakan komponen tambahan dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari
protein Flagelin.
Dikenal 4 jenis flagel :
Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal : Vibrio sp.
Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes sp
Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth: Alcalingenes sp
Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis

Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Untuk
itu pewarnaan khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang
digunakan untuk melihat flagel adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain
diantaranya pewarnaan Novel, Zattnow, dan Fontana-Tribondeau dengan menggunakan
impregnasi Ag.

Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga
sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada
latar belakang. Yang berwana biru gelap.

4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri
pewarnaan Neisser (granula volutin)
pewarnaan yodium (granula glikogen).
5. Pewarnaan negatif
Pewarnaan negatif dilakukan untuk mengamati morfologi organisme yang sukar
diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta (Treponema, Leptospira
dan Borrelia)
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop
Metode pewarnaan negatif ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran
sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras
dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat negrosin dan tinta cina.
Pewarna negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna
asam memeiliki negative charge kromogen, tidak akan menembus atau berpenetrasi
kedalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak
berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

III. PRINSIP KERJA
1. Pewarnaan sederhana
Mengoleskan suspensi bakteri diatas objek glas (membuat sediaan) dan melakukan
pewarnaan dengan safranin selama 1menit, keringkan dan amati dibawah mikroskop
2. Pewarnaan diferensial
Membuat sediaan dan melakukan pewarnaan dengang pewarnaan gram (pengecatan
gram, keringkan dan amati dibawah mikroskop

IV. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
Objek glas
Ose tumpul
Mikroskop
Lampu bunsen dan korek api

2. Bahan
Koloni bakteri (padat dan cair)
Pz
Pewarna gram
Safranin
Oil imersi
Tissue

V. CARA KERJA
1. Pewarnaan sederhana (pada koloni bakteri padat)
Fiksasi objek glas dengan lampu bunsen
Teteskan pz diatas objek glas secukupnya
Ambil koloni bakteri dengan ose yang telah dipanaskan
Oleskan sampai diameter lk.1 cm
Fiksasi dengan bunsen / Keringkan dengan bunsen dengan mengangin-
anginkannya
Cat dengan safranin
Tunggu
Bilas/cuci dengan air mengalir, dengan menggenangkannya sehingga merata
cat tidak menumpuk disatu tempat yang akan menyulitkan pengamatan
Keringkan dengan angin atau bisa dengan tissue
Amati dibawah mikroskop dimulai dari perbesaran objektif 10 sampai 100
(tambah oil imersi)
2. Pewarnaan diferensial (pada koloni bakteri cair)
Fiksasi objek glas dengan lampu bunsen
panaskan ose
Ambil koloni bakteri dengan ose yang telah dipanaskan (tunggu dingin)
Oleskan sampai diameter lk.1 cm Fiksasi dengan bunsen / Keringkan dengan
bunsen dengan mengangin-anginkannya di atasnyala
Cat dengan gram 1 (gention violet/kristal violet), tunggu 1 menit lalu bilas/cuci
Cat dengan gram 2 (lugol/iodin), tunggu 1 menit lalu bilas/cuci
Cat dengan gram 3 (alkohol), tunggu 30 detik lalu bilas/cuci
Cat dengan gram 4 (safranin), tunggu 1 menit
Cuci/bilas dengan air mengalir
Keringkan dengan angin/penganginan atau dengan tissue
Amati dibawah mikroskop dimulai dari perbesaran objektif 10 sampai 100
(tambah oil imersi)

VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan pengecatan / pewarnaan bakteri dengan tehnik pewarnaan
sederhana dan deferensial (pewarnaan gram). Pada tehnik pengecatan/pewarnaan
sederhana, dilakukan dengan pewarna safranin dengan sampel koloni bakteri cair
(stphilococcus) dan pada pewarnaan deferensial dengan pengecatan gram menggunakan
sampel koloni bakteri padat (basil).
Pewarnaan sederhana dilakukan dengan membuat olesn koloni bakteri cair dengan
ose tumpul, lalu dikeringkan dengan nyala api. Setelah kering lansung dilakukan
pewarnaan dengan safranin. Cat safranin digenangkan diatas olesan bakteri, tunggu 1
menit. Sediaan dicuci diatas air mengalir dengan tehnik penggenangan, sehingga cat tercuci
merata. Setelah itu, dikeringkan dengan mengangin-anginkannya atau bisa juga dengan
menggunakan tissue. Setelah kering diamati dibawah mikroskop mulai dengan perbesaran
objektif 10x sampai dengan 100x (diteteskan oil imersi). Pengecatan dengan safranin
membuat sediaan berwarna merah.
Pewarnaan diferensial, cat gram negatif. Dalam pengecatan dengan menggunakan
cat gram negatif digunakan 4 macam pewarna. Pewarna 1 adalah kristal violet, berfungsi
sebagai cat utama. Pewarna 2 adalah iodin, berfungsi sebagai penguat warna cat utama.
Pewarna 3 adalah alkohol 96 %, berfungsi sebagai peluntur yang akan melunturkan cat
utama. Dan pewarna 4 adalah safranin, cat pembanding yang akan menggantikan cat
utama yang luntur.
Setelah olesan bakteri siap, lansung dilakukan pengecatan pertama,dilakukan
dengan cra yang sama dengan pada pewarnaan sederhana. Cat diteteskan diatas sediaan
dengan merata tunggu 1 menit cuci dan cat dengan cat kedua, tunggu lagi 1 menit, cuci
dan cat lagi dengan cat ketiga (cat peluntur), tunggu 30 detik, cuci dan cat kembali dengan
cat pembanding safranin tunggu 1 menit, cuci dan keringkan. Karena sampel yang
digunakan merupakan jenis bakteri gram negatif, sediaan berwarna merah, karena warna
ungu kristal violet telah luntur pada pengecatan ke 3. Setelah kering, diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran objektif 100 x dengan penambahan oil imersi.
Pada pewarnaan sederhan didapatkan bakteri coccus yang bertumpuk-tumpuk
seperti anggur (sthapilococcus) dan pada pewarnaan deferensial ditemukan bakteri basil
yang menyendiri (monobasil).

VII. HASIL
Dari pengamatan yang dilakukan, dapat dilihat bahwa bakteri yang ada pada sampel koloni
bakteri padat dengan pewarnaan gram adalah bakteri yang berbentuk basil dengan
penataan sendiri-sendiri dan sifat pewarnaan merah (gram negatif), dan pada sampel
koloni bakteri cair engan ewarnaan sederhana adalah bakteri berbentuk coccus, penatan
bertumpuk-tumpuk dengan sifat pewarnaan merah.

VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa bakteri pada sampel
koloni bakteri padat adah monobasil, dan pada sampel koloni bakteri cair adalah bakteri
streptobasil.

Anda mungkin juga menyukai