Biotech-Master I - Ufhb-2013 Chap 2f

OGM et Bioscurit
Biotechnologie et bioscurit Biotechnologie et bioscurit

Dr. Nazaire KOUASSI, LCB / CNRA
Cours-Confrences
UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
Notions de gnomique Notions de gnomique
et Cration des OGM et Cration des OGM
Chapitre 2 Chapitre 2
2
Notions de gnomique Notions de gnomique
et Cration des OGM et Cration des OGM
Acide dsoxyribonuclique
Gnes et modifications gntiques
Expression et rgulation des gnes
OGM : Dfinition et Principes
Construction gntique et cration des OGM
Transformation gntique
Analyse de la plante transgnique
Introgression du gne dans les varits locales
Traits (caractres utiliss) pour cultures transgniques
Plan Plan
www.uemoa.int
www.izf.net
Acide dsoxyribonuclique
Gnes et modifications gntiques
Expression et rgulation des gnes
OGM : Dfinition et Principes
Construction gntique et cration des OGM
Transformation gntique
Analyse de la plante transgnique
Introgression du gne dans les varits locales
Traits (caractres utiliss) pour cultures transgniques
Cellules et Chromosomes Cellules et Chromosomes
Les organismes unicellulaires Les organismes unicellulaires
4
L'ADN des procaryotes se compose d'une molcule
circulaire super enroule.
Information stockes dans lADN = disque dur
LADN contient des gnes qui ont des fonctions
spcifiques.
LADN LADN plasmidique plasmidique
ADN circulaire de petite taille
utile pour le biologiste
molculaire.
Est capable de se rpliquer dans
les bactries;
Cest un vecteur idal pour la
transgnse.
Agrobacterium tumefaciens
(Bactrie) possde la capacit de
transfrer une partie de son
plasmide directement dans lADN
de la plante.
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ADN circulaire de petite taille
utile pour le biologiste
molculaire.
Est capable de se rpliquer dans
les bactries;
Cest un vecteur idal pour la
transgnse.
Agrobacterium tumefaciens
(Bactrie) possde la capacit de
transfrer une partie de son
plasmide directement dans lADN
de la plante.
ADN = Acide dsoxyribonuclique ADN = Acide dsoxyribonuclique))
ADN = Le livre de la vie
Ce livre est crit dans un
langage universel avec un
alphabet qui comporte 4
lettres et contient des
mots appels gnes
Lexpression et la fonction
du gne peuvent tre
affectes par
lenvironnement
ADN
A= adnine
C= Cytosine
G= Guanine
T= Thymine
(= U / ARN)
ADN
A= adnine
C= Cytosine
G= Guanine
T= Thymine
(= U / ARN)
ADN = Le livre de la vie
Ce livre est crit dans un
langage universel avec un
alphabet qui comporte 4
lettres et contient des
mots appels gnes
Lexpression et la fonction
du gne peuvent tre
affectes par
lenvironnement
ADN
A= adnine
C= Cytosine
G= Guanine
T= Thymine
(= U / ARN)
ADN
A= adnine
C= Cytosine
G= Guanine
T= Thymine
(= U / ARN)
ADN = Acide dsoxyribonuclique ADN = Acide dsoxyribonuclique
Le gne correspond un mot du livre de la vie.
Un gnome peut en contenir des milliers.
Le gne est donc une portion dADN qui a une
signification donne
On peut avoir par exemple un gne dont la lecture
va permettre de dire quelle est la couleur des
yeux de lindividu qui le porte: on dit que le gne
code pour la fonction couleur des yeux
Une petite modification dans le mot (changement
dune lettre = mutation) peut changer le sens du
mot (gne)
Le gne correspond un mot du livre de la vie.
Un gnome peut en contenir des milliers.
Le gne est donc une portion dADN qui a une
signification donne
On peut avoir par exemple un gne dont la lecture
va permettre de dire quelle est la couleur des
yeux de lindividu qui le porte: on dit que le gne
code pour la fonction couleur des yeux
Une petite modification dans le mot (changement
dune lettre = mutation) peut changer le sens du
mot (gne)
Remaniement gntique Remaniement gntique
Les transpositions : Ce sont des segments d'ADN, ou
transposons, qui se dplacent (alatoirement) au sein du
gnome. Ces segments sont limits par des squences prcises
reconnues par une enzyme, la transposase, qui permet de les
couper et de les recoller dans un autre filament d'ADN.
Les dltions : Il s'agit de la perte d'une portion plus ou
moins grande d'ADN.
Les inversions : C'est une portion d'ADN qui, dcoupe,
se replace dans le sens inverse sur le brin d'ADN.
Les recombinaisons gntiques : Ce sont des changes
de portions de chromosomes lors de la miose. Elles
permettent de renforcer le brassage gntique.
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Les transpositions : Ce sont des segments d'ADN, ou
transposons, qui se dplacent (alatoirement) au sein du
gnome. Ces segments sont limits par des squences prcises
reconnues par une enzyme, la transposase, qui permet de les
couper et de les recoller dans un autre filament d'ADN.
Les dltions : Il s'agit de la perte d'une portion plus ou
moins grande d'ADN.
Les inversions : C'est une portion d'ADN qui, dcoupe,
se replace dans le sens inverse sur le brin d'ADN.
Les recombinaisons gntiques : Ce sont des changes
de portions de chromosomes lors de la miose. Elles
permettent de renforcer le brassage gntique.
Les mutations peuvent tre provoques par la nature et par
lHomme ( irradiations : rayons X, gamma, ultraviolet,
enzymes, et les produits chimiques)
La mutation peut tre ponctuelle (un seul nuclotide)
De recopiage en recopiage, des erreurs surviennent
(des mutations surviennent. Elles sont soit:
Silencieuses = peut tre sans effet
Neutres ne modifient pas la capacit se reproduire,
Peut modifier certaines proprits (phnotype)
Mutations conditionnelles, s'expriment certaines conditions
Expliquent l'existence d'une variabilit entre les gnes Expliquent l'existence d'une variabilit entre les gnes..
LADN : Mutations LADN : Mutations
Les mutations peuvent tre provoques par la nature et par
lHomme ( irradiations : rayons X, gamma, ultraviolet,
enzymes, et les produits chimiques)
La mutation peut tre ponctuelle (un seul nuclotide)
De recopiage en recopiage, des erreurs surviennent
(des mutations surviennent. Elles sont soit:
Silencieuses = peut tre sans effet
Neutres ne modifient pas la capacit se reproduire,
Peut modifier certaines proprits (phnotype)
Mutations conditionnelles, s'expriment certaines conditions
Expliquent l'existence d'une variabilit entre les gnes Expliquent l'existence d'une variabilit entre les gnes..
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Description du gne
Deux catgories de gnes
Gnes de structure (activit mtaboliques, protines de
structure)
Gnes de rgulation (contrle lexpression des gnes)
Il a des effets spcifiques sur la morphologie ou la
physiologie des organismes
Il Constitue une banque dinformation qui est active et
agi la demande, peut tre mut
Le gne dun eucaryote est morcel en fragment :
Promoteur-Exons-Introns
Deux catgories de gnes
Gnes de structure (activit mtaboliques, protines de
structure)
Gnes de rgulation (contrle lexpression des gnes)
Il a des effets spcifiques sur la morphologie ou la
physiologie des organismes
Il Constitue une banque dinformation qui est active et
agi la demande, peut tre mut
Le gne dun eucaryote est morcel en fragment :
Promoteur-Exons-Introns
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Gne: Promoteur, Exons, Introns
Le promoteur = squence rgulatrice de la transcription
du gne. Il est localis en amont des gne de structure
(20 200 pb)
Exon = cest la partie codante du gne. Le gne
commence par le codon ATG (signale dinitiation de la
transcription) et se termine par un codon stop (TAA, TAG,
TGA).
Les introns sont des squences non codantes situes
dans le gne. Prsent que chez les eucaryotes; lintron
varie en taille et en nombre et est limin lors de
lpissage (splicing)
Intron Intron Exon 2 Intron Exon 3 Promoteur Exon 1
ATG
TAA-TAG-TGA
PolyA
AATAA
5 3
Le promoteur = squence rgulatrice de la transcription
du gne. Il est localis en amont des gne de structure
(20 200 pb)
Exon = cest la partie codante du gne. Le gne
commence par le codon ATG (signale dinitiation de la
transcription) et se termine par un codon stop (TAA, TAG,
TGA).
Les introns sont des squences non codantes situes
dans le gne. Prsent que chez les eucaryotes; lintron
varie en taille et en nombre et est limin lors de
lpissage (splicing)
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Squences de rgulation
Le promoteur: tabli le site dinitiation de la transcription
et la direction vers laquelle la transcription va se drouler.
Il existe des promoteurs tissu-spcifiques et constitutifs
Inhibiteur (silencers): diminuent ou inhibe lexpression du
gne
Activateur (enhencer) situ en aval ou en among du gne,
stimule son expression.
Insulateur: empche linfluence dun gne sur son voisin
Le promoteur: tabli le site dinitiation de la transcription
et la direction vers laquelle la transcription va se drouler.
Il existe des promoteurs tissu-spcifiques et constitutifs
Inhibiteur (silencers): diminuent ou inhibe lexpression du
gne
Activateur (enhencer) situ en aval ou en among du gne,
stimule son expression.
Insulateur: empche linfluence dun gne sur son voisin
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Les Transposons
Se sont des lments transposables capables de se dplacer
et causer des rarrangements de squences.
Leur dplacement peut crer de nouvelles squences par
des suppressions, des inversions et changement de position.
Le rarrangement peut galement changer la fonction des
squences en les plaant sous le contrle d'une autre
squence de rgulation.
Les transposons sont des squences de nuclotides
immdiatement flanques chaque extrmit de squences
inverses rptes
Se sont des lments transposables capables de se dplacer
et causer des rarrangements de squences.
Leur dplacement peut crer de nouvelles squences par
des suppressions, des inversions et changement de position.
Le rarrangement peut galement changer la fonction des
squences en les plaant sous le contrle d'une autre
squence de rgulation.
Les transposons sont des squences de nuclotides
immdiatement flanques chaque extrmit de squences
inverses rptes
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Transposons: Ac et Ds du mas
Ac (activateur) & Ds (dissociateur) dans le
mas.
Ac capable de bouger de manire autonome;
Ds bouge quand il est activ par AC
Les transpositions de Ac et Ds dans le mas
sont lorigine des couleurs des aleurones.
Le gne du pigment danthocyanine est
inactiv dans certaines cellules et pas
dans dautres
Ac (activateur) & Ds (dissociateur) dans le
mas.
Ac capable de bouger de manire autonome;
Ds bouge quand il est activ par AC
Les transpositions de Ac et Ds dans le mas
sont lorigine des couleurs des aleurones.
Le gne du pigment danthocyanine est
inactiv dans certaines cellules et pas
dans dautres
14
Les Transposons
15
Modifications gntiques
Avec la dcouverte de la gntique mendlienne,
la slection sest affine
Pour obtenir certaines caractristiques prcises,
il faut normment de croisements, et la
slection prend des annes.
Ainsi les techniques de transgnse (produire un
OGM) reprsentent un gigantesque bond en
avant
Le fait de jouer directement sur les gnes
permet dsormais de prdterminer l'effet
attendu (gain de temps)
Avec la dcouverte de la gntique mendlienne,
la slection sest affine
Pour obtenir certaines caractristiques prcises,
il faut normment de croisements, et la
slection prend des annes.
Ainsi les techniques de transgnse (produire un
OGM) reprsentent un gigantesque bond en
avant
Le fait de jouer directement sur les gnes
permet dsormais de prdterminer l'effet
attendu (gain de temps)
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OOr gani smes r gani smes
GGnt i quement nt i quement
MModi f i s odi f i s
OVM OVM : Organismes Vivants Modifis
PGM PGM : Plantes Gntiquement Modifies;
PT PT : Plantes Transgniques
CT: Cultures Transgniques
CGM CGM: Cultures Gntiquement Modifis
PB: Plant Biotech
OO
GG
MM
OVM OVM : Organismes Vivants Modifis
PGM PGM : Plantes Gntiquement Modifies;
PT PT : Plantes Transgniques
CT: Cultures Transgniques
CGM CGM: Cultures Gntiquement Modifis
PB: Plant Biotech
Organismes gnt iquement
modifis : OGM
Les OGM sont des organismes vivants organismes vivants dont
l lADN ADN a t modifi en utilisant des procds
de Gnie Gntique Gnie Gntique dans le but de leur
confrer de nouvelles proprits nouvelles proprits.
Organismes vivants : plantes, animaux, bactries etc.
Gntiquement modifi : ADN manipul
Gnie Gntique: Manipulation de lADN/transformation
Nouvelles proprits : Rsistance, productivit, etc.
OGM : Dfinitions
Un Organisme Gntiquement Modifi (OGM) est un
animal, une plante ou un micro-organisme dans lequel,
grce aux techniques de gnie gntique, lhomme a
Introduit un ou des gnes trangers spcifiques, pour
lacquisition dun caractre nouveau (introduit/retir)
Un OGM ou OVM, tout organisme vivant qui possde une
combinaison de matriel gntique indite obtenue par
recours aux biotechnologies modernes.
La transgnse fait donc bien partie des biotechnologies
puisqu'elle permet de faire produire par des organismes
Vivants, des substances utiles l'homme.
Un Organisme Gntiquement Modifi (OGM) est un
animal, une plante ou un micro-organisme dans lequel,
grce aux techniques de gnie gntique, lhomme a
Introduit un ou des gnes trangers spcifiques, pour
lacquisition dun caractre nouveau (introduit/retir)
Un OGM ou OVM, tout organisme vivant qui possde une
combinaison de matriel gntique indite obtenue par
recours aux biotechnologies modernes.
La transgnse fait donc bien partie des biotechnologies
puisqu'elle permet de faire produire par des organismes
Vivants, des substances utiles l'homme.
Les OGM: le Principe des OGM Les OGM: le Principe des OGM
XX
Hybrides Hybrides
Classiques Classiques
OGM OGM
Caractre dsir (GIA) Caractre dsir (GIA)
Caractre non dsir (nocif) Caractre non dsir (nocif)
Caractre dintrt (GIA) dj Caractre dintrt (GIA) dj
prsent chez la varit amliore prsent chez la varit amliore
Autre espce Autre espce
Promoteurs : CaMV 35 S = promoteur constitutif
est le plus communment utilis.
Gne : rsistance aux stress biotiques/abiotiques
Ex. le gne Bt (Fragments dADN)
Terminateur (ex. Nos = terminateur de la
nopaline synthase)
Vecteurs de transformation (ex. pMon99)
La construction gntique
Promoteur Gne dintrt NosT
Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
Promoteurs : CaMV 35 S = promoteur constitutif
est le plus communment utilis.
Gne : rsistance aux stress biotiques/abiotiques
Ex. le gne Bt (Fragments dADN)
Terminateur (ex. Nos = terminateur de la
nopaline synthase)
Vecteurs de transformation (ex. pMon99)
Promoteurs constitutifs : ce jour, la plupart des
promoteurs dans les varits transgniques sont des
promoteurs constitutifs, c'est--dire, induisant
l'expression des gnes tout au long du cycle de vie de la
plante dans la plupart des tissus.
Promoteur spcifiques : Il existe des promoteurs
tissus-spcifiques (feuilles ou racines, fruits) ou
actifs certains stades de dveloppement (maturit)
Promoteurs inductibles: sont inductibles par divers
stress (lumire, d'oxygne, chaleur, froid, blessure,
substances chimiques).
Les OGM : Promoteur et marqueur de slection
Promoteurs constitutifs : ce jour, la plupart des
promoteurs dans les varits transgniques sont des
promoteurs constitutifs, c'est--dire, induisant
l'expression des gnes tout au long du cycle de vie de la
plante dans la plupart des tissus.
Promoteur spcifiques : Il existe des promoteurs
tissus-spcifiques (feuilles ou racines, fruits) ou
actifs certains stades de dveloppement (maturit)
Promoteurs inductibles: sont inductibles par divers
stress (lumire, d'oxygne, chaleur, froid, blessure,
substances chimiques).
Les OGM : slection des cellules transformes
Il suffit donc de repiquer les cellules sur un milieu contenant
l'antibiotique (kanamycine, ampicilline, nomycine phospho
transfrase (NPT-II) et streptomycine pour ne slectionner
que les cellules transgniques.
Ces gnes sont de plus en plus interdits au profit dune
mthode sans gne de rsistance lantibiotique.
Usage dun systme binaire (deux plasmides) : l'un portant la
cassette "gne d'intrt", l'autre la cassette "gne marqueur"
afin de pouvoir se dbarrasser du gne marqueur.
Il suffit donc de repiquer les cellules sur un milieu contenant
l'antibiotique (kanamycine, ampicilline, nomycine phospho
transfrase (NPT-II) et streptomycine pour ne slectionner
que les cellules transgniques.
Ces gnes sont de plus en plus interdits au profit dune
mthode sans gne de rsistance lantibiotique.
Usage dun systme binaire (deux plasmides) : l'un portant la
cassette "gne d'intrt", l'autre la cassette "gne marqueur"
afin de pouvoir se dbarrasser du gne marqueur.
1 - Identifier, isoler, cloner et multiplier un gne
2 - Faire la construction gntique : la cassette
3 - Transfrer le gne dans lorganisme receveur
4 - Rgnrer et valuer les plantes transformes
5 - Analyser le gne et son expression
6 Intgrer ou introgresser le gne dans une
varit commerciale
Les tapes de lobtention des OGM
1 - Identifier, isoler, cloner et multiplier un gne
2 - Faire la construction gntique : la cassette
3 - Transfrer le gne dans lorganisme receveur
4 - Rgnrer et valuer les plantes transformes
5 - Analyser le gne et son expression
6 Intgrer ou introgresser le gne dans une
varit commerciale
Rsum des tapes de cration des OGM
OGM : tapes de cration OGM : tapes de cration
Etape 1: Identifier, isoler, cloner un gne d'intrt Etape 1: Identifier, isoler, cloner un gne d'intrt
La premire tape est l'identification d'un caractre que
l'on veut introduire dans la plante (rsistance certains
insectes, certaines maladies, des Herbicides)
Etape 2 Etape 2 Raliser une construction Raliser une construction gntique:cassette gntique:cassette
Implique la ralisation d'une squence nuclotidique compose
dun promoteur, en amont du gne d'intrt et en aval de ce
gne dintrt un terminateur de transcription = Nos.
Le gne coup est intgr coll dans une construction
gntique (vecteur). La construction est ensuite multiplie
(clonage) afin de disposer d'une quantit suffisante d'ADN
pour son introduction dans les cellules vgtales que l'on
veut transformer.
Etape 1: Identifier, isoler, cloner un gne d'intrt Etape 1: Identifier, isoler, cloner un gne d'intrt
La premire tape est l'identification d'un caractre que
l'on veut introduire dans la plante (rsistance certains
insectes, certaines maladies, des Herbicides)
Etape 2 Etape 2 Raliser une construction Raliser une construction gntique:cassette gntique:cassette
Implique la ralisation d'une squence nuclotidique compose
dun promoteur, en amont du gne d'intrt et en aval de ce
gne dintrt un terminateur de transcription = Nos.
Le gne coup est intgr coll dans une construction
gntique (vecteur). La construction est ensuite multiplie
(clonage) afin de disposer d'une quantit suffisante d'ADN
pour son introduction dans les cellules vgtales que l'on
veut transformer.
Plasmide vecteur
OGM : tapes de cration
1. Identifier et isoler le gne (ex. la CP)
5
SIT
ORF
1
ORF
2a
ORF
3
ORF
2b
NLS
4452 nts
3
1100 nuclotides
ORF
3
5 3
MV
POLYPROTEINE
CP
VPg PRO REP
26 kD
17,8
kD
Sub-gnomique
Molcule dARN simple brin de 4452 nts
Digestion du plasmide et insert puis clonage
LADN est coup avec une
(ou des) enzyme (s) de restriction,
Le plamide hte est coup
pareillement,
Le gene est insr dans le
plasmide et recoll laide dune
ligase,
Le nouveau plasmide est insr
dans une bactrie(transformation)
Le produit de transformation est
ensuite tal sur un milieu solide
contenant un antibiotique.
LADN est coup avec une
(ou des) enzyme (s) de restriction,
Le plamide hte est coup
pareillement,
Le gene est insr dans le
plasmide et recoll laide dune
ligase,
Le nouveau plasmide est insr
dans une bactrie(transformation)
Le produit de transformation est
ensuite tal sur un milieu solide
contenant un antibiotique.
Culture des bactrie transformes : Criblage
Plasmide
N mol.
Enzymes
Restriction
promoteur
DNA
ligase
1. Clonage du gne dans un vecteur 1. Clonage du gne dans un vecteur
2.Transfert dans une bactrie
Gne
(n mol.
2. Construction gntique : la casset 2. Construction gntique : la cassette te
Un vecteur est dfini comme une molcule
dADN qui est capable de se reproduire
dans un organisme hte (bactrie par
exemple)
La plupart des vecteurs procaryotes sont
bases sur les plasmides (pBR322)
Ces vecteurs peuvent tre utiliss dans le
clonage et lexpression des gnes.
AB
a. Les deux gnes sur la mme cassette
Un vecteur est dfini comme une molcule
dADN qui est capable de se reproduire
dans un organisme hte (bactrie par
exemple)
La plupart des vecteurs procaryotes sont
bases sur les plasmides (pBR322)
Ces vecteurs peuvent tre utiliss dans le
clonage et lexpression des gnes.
A +
B
b. Les deux gnes sur deux cassettes spares
Etape 3 - Transfrer le gne dans lorganisme receveur
Il existe plusieurs mthodes pour introduire un gne dans le
noyau dune cellule :
la mthode transformation biologique = mthode indirecte
Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhyogene qui
a la proprit de raliser naturellement la transformation
gntique d'une plante, afin de la parasiter.
Cette bactrie possde un plasmide dont une portion d'ADN
(l'ADN-T = ADN Transfrable) est capable de s'intgrer
par recombinaison gntique, dans le gnome des plantes.
Etape 3 - Transfrer le gne dans lorganisme receveur
Il existe plusieurs mthodes pour introduire un gne dans le
noyau dune cellule :
la mthode transformation biologique = mthode indirecte
Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhyogene qui
a la proprit de raliser naturellement la transformation
gntique d'une plante, afin de la parasiter.
Cette bactrie possde un plasmide dont une portion d'ADN
(l'ADN-T = ADN Transfrable) est capable de s'intgrer
par recombinaison gntique, dans le gnome des plantes.
La transgnse vgtale
Transfert du gne dans un vecteur de plante
Le plasmide Ti comme vecteur
OGMs : Mthodes transfert de lADN
Mthode direct : Biolistique : particule dor
enrob dADN complexe ADN-OR propuls dans
les cellules pour atteindre le noyau puis le
gnome
dans les cellules de la plante laide d'un
canon acclrateur de particules enrobes
d'ADN, soit dans des protoplastes, par
lectroporation
Mthode direct : Biolistique : particule dor
enrob dADN complexe ADN-OR propuls dans
les cellules pour atteindre le noyau puis le
gnome
dans les cellules de la plante laide d'un
canon acclrateur de particules enrobes
d'ADN, soit dans des protoplastes, par
lectroporation
Canon acclrateur de particules.
Agrobacterium
Or
Plant cell
Microprojectile gun
Gene of interest
Promoter Coding region 3 UTR
DNA
Mthodes de transformation des plantes : OGM
Gold or tungsten particles coated with DNA
Transformed plant cell
Plant cell culture
By using antibiotic or sugar resistance gene
Plant regeneration Plant acclimatation
Transformation par Agrobacterium tumefaciens
Bombardement/microparticules de cellules ou de
tissus vgtaux
Introduction / chimique dans des protoplastes
Systme de transfert d'ADN par lectroporation
La slection classique - hybridation croise
Voie pollen tube (PTP)
Mthodes dintroduction de lADN
Transformation par Agrobacterium tumefaciens
Bombardement/microparticules de cellules ou de
tissus vgtaux
Introduction / chimique dans des protoplastes
Systme de transfert d'ADN par lectroporation
La slection classique - hybridation croise
Voie pollen tube (PTP)
OGM : tapes de la cration
Etape 5 Analyser le gne et son expression
Les plantes rgnres sont ensuite analyses pour confirmer
l'insertion de la construction gntique dans leur gnome.
Lanalyse molculaire du transgne (prsence du gne insr)
est ralise par raction de polymrisation en chane (PCR)
La confirmation de lintgration de ce gne et le nombre de
copies intgres de ce gne est ralise par la technique du
Southern blot.
Le niveau dexpression de lARNm est analys par la technique
de Northern blot ou la Technique de la RT-PCR
Le niveau dexpression de la protine est analys par la
Technique de Western blot et le test ELISA
Etape 5 Analyser le gne et son expression
Les plantes rgnres sont ensuite analyses pour confirmer
l'insertion de la construction gntique dans leur gnome.
Lanalyse molculaire du transgne (prsence du gne insr)
est ralise par raction de polymrisation en chane (PCR)
La confirmation de lintgration de ce gne et le nombre de
copies intgres de ce gne est ralise par la technique du
Southern blot.
Le niveau dexpression de lARNm est analys par la technique
de Northern blot ou la Technique de la RT-PCR
Le niveau dexpression de la protine est analys par la
Technique de Western blot et le test ELISA
Caractrisation des Plantes OGM Caractrisation des Plantes OGM
Amplification du promoteur/ gne / Amplification du promoteur/ gne / NosT NosT promoteur promoteur
PCR : amplification du gne dintrt et du gne
de slection
Hyg Hyg
CP CP
PCR : amplification du gne dintrt et du gne
de slection
Hy
g.
CP
S assurer de lincorporation du gne dans le gnome
Kouassi et al., 1995
par par Northern Northern blot (expression blot (expression ARNm ARNm))
Northern (sonde radioactive) Kouassi et al., 1995
Lignes transgniques M Lignes transgniques
650 pb
(CP)
RT-PCR Kouassi et al., 2006
par Western blot (expression de la protine) par Western blot (expression de la protine)
Kouassi et al., 2006
tape de cration (suite) tape de cration (suite)
Etape 6-Introgresser le gne dans
une autre varit par croisement
OVM Non-OVM
Test de rsistance des varits
Non OGM--- papayer --- OGM
Papayer
(OGM)
Papayer
(non OGM)
Non OGM--- papayer --- OGM
Resistance contre les insectes ravageurs
Coton Bt sans pulvrisation.
Rdt: 1102 kg/ha
Coton : varit locale sans
pulvrisation. Rdt: 735 kg/ha
Coton Coton Bt Bt en en essais essais Fada Fada NGourma NGourma (Burkina (Burkina Faso) Faso)
Plantation de papayers Hawa
(Technique de la CP rsistant)
Plantation de papayers Hawa
(Technique de la CP rsistant)
Papayers non OGM Papayers OGM
OGM : Principaux gnes utiliss
Protection des vgtaux: Rsistance aux insectes
La principale stratgie de lutte contre les insectes
utilise un gne de la bactrie Bacillus thuringiensis
(toxine Bt) toxique pour les larves de lpidoptres
ravageurs du coton (phyllophages et carpophages)
Protection des vgtaux: Rsistance aux maladies
(champignons, virus) Rsistance aux virus
Il a en effet t dcouvert depuis 1986 : quand une
plante contient une fraction du matriel gntique
dun virus, elle peut dvelopper une rsistance contre
ce mme virus (protection croise)
47
Protection des vgtaux: Rsistance aux insectes
La principale stratgie de lutte contre les insectes
utilise un gne de la bactrie Bacillus thuringiensis
(toxine Bt) toxique pour les larves de lpidoptres
ravageurs du coton (phyllophages et carpophages)
Protection des vgtaux: Rsistance aux maladies
(champignons, virus) Rsistance aux virus
Il a en effet t dcouvert depuis 1986 : quand une
plante contient une fraction du matriel gntique
dun virus, elle peut dvelopper une rsistance contre
ce mme virus (protection croise)
Protection des vgtaux
La rsistance aux herbicides
La rsistance quatre herbicides diffrents a t utilise ce jour
glyphosate (Roundup), phosphinothricine (Liberty, Basta ou Finale).
Des plantes rsistantes aux bromoxynil et au sulfonyurea sont
galement disponibles
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Traits agronomiques
Fixation de lazote
Des plantes lgumineuses (acacias, mimosas,
tamarinier, flamboyant, le soja, haricots, nib,
arachide etc.) sont naturellement approvisionnes en
azote grce des symbioses tablies au niveau des
racines avec des bactries (fixatrice dazote =
Rhizobium)
Le dterminisme gntique contrlant la symbiose (NIF,
Dof1) peut tre transfr dans une plante non
lgumineuse.
De mme les bactries fixatrices dazote, peuvent tre
transformes (OGM) de manire ce quune telle
symbiose puisse stablir chez dautres plantes
cultives.
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Fixation de lazote
Des plantes lgumineuses (acacias, mimosas,
tamarinier, flamboyant, le soja, haricots, nib,
arachide etc.) sont naturellement approvisionnes en
azote grce des symbioses tablies au niveau des
racines avec des bactries (fixatrice dazote =
Rhizobium)
Le dterminisme gntique contrlant la symbiose (NIF,
Dof1) peut tre transfr dans une plante non
lgumineuse.
De mme les bactries fixatrices dazote, peuvent tre
transformes (OGM) de manire ce quune telle
symbiose puisse stablir chez dautres plantes
cultives.
Traits agronomiques
Rsistance la scheresse
Un gne de tolrance la scheresse a t isol chez une
espce dAfrique du Sud : Xerophyta viscosa, dite "plante
de rsurrection car supporte les priodes de scheresse
Ce gne a t transfr avec chez le mas et la pomme
de terre en Afrique du Sud o des essais sont en cours.
Tolrance aux sels (essais)
Des plantes tolrantes aux sels seraient capables de
pousser dans sur des sols salins.
En Russie, on procde des expriences dintroduction
dans le bl dun gne tir de lorge augmentant la rsistance
aux concentrations leves de sel.
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Rsistance la scheresse
Un gne de tolrance la scheresse a t isol chez une
espce dAfrique du Sud : Xerophyta viscosa, dite "plante
de rsurrection car supporte les priodes de scheresse
Ce gne a t transfr avec chez le mas et la pomme
de terre en Afrique du Sud o des essais sont en cours.
Tolrance aux sels (essais)
Des plantes tolrantes aux sels seraient capables de
pousser dans sur des sols salins.
En Russie, on procde des expriences dintroduction
dans le bl dun gne tir de lorge augmentant la rsistance
aux concentrations leves de sel.
Traits qualitatifs: Valeur nutritive
Acides gras, vitamines, sucre, etc.
La plante de colza gntiquement modifie pour
augmenter la valeur nutritive de lhuile (+ acide
olique, - acide linolique) est commercialises.
Des modifications de la valeur nutritive ont lieux chez
le soja (acide gras) et mas (protine) et le riz
(provitamine A et Fer)
Le Sorgho biofortifi en Afrique = ABS
(teneur en vitamine A et E, fer, lysine, Zinc)
projet en cours en Afrique du Sud, au Kenya,
et au Burkina Faso etc.
Le riz dor (Golden rice, riche en vitamine A)
Le gne insr = Beta-carotne (provitamine A)
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Acides gras, vitamines, sucre, etc.
La plante de colza gntiquement modifie pour
augmenter la valeur nutritive de lhuile (+ acide
olique, - acide linolique) est commercialises.
Des modifications de la valeur nutritive ont lieux chez
le soja (acide gras) et mas (protine) et le riz
(provitamine A et Fer)
Le Sorgho biofortifi en Afrique = ABS
(teneur en vitamine A et E, fer, lysine, Zinc)
projet en cours en Afrique du Sud, au Kenya,
et au Burkina Faso etc.
Le riz dor (Golden rice, riche en vitamine A)
Le gne insr = Beta-carotne (provitamine A)
Traits : Mdecine Substances (vaccins)
Des vaccins, de mme que des protines que lon
trouve dans le sang, sont dj produits dans des
varits de soja de tabac,de patate et de banane
transgniques
Utiliser les OGM pour produire des alicaments,
par exemple la banane vaccin contre l'hpatite B,
ou un yaourt cens restaurer la flore intestinale...
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Des vaccins, de mme que des protines que lon
trouve dans le sang, sont dj produits dans des
varits de soja de tabac,de patate et de banane
transgniques
Utiliser les OGM pour produire des alicaments,
par exemple la banane vaccin contre l'hpatite B,
ou un yaourt cens restaurer la flore intestinale...
Traits environnementaux dcontamination
Possible utilisation des plantes transgniques pour
la dcontamination des sols pollus par des rsidus
de mtaux lourds (zinc, cadmium, mercure, cuivre).
Quelques exemples de plantes transgniques obtenues
Culture Culture Caractre dintrt Caractre dintrt Institutions Institutions Etat actuel Etat actuel
Caf Floraison synchrone CENICAFE (Colombie) Essais
Caf Rsistant aux insectes CENICAFE (Colombie) Essais
Coton Rsistant aux insectes Monsanto Commerce
Coton Rsistant aux herbicides Monsanto Commerce
Papayer Rsistant / maladie virale Universit de Hawaii Commerce
Soja Rsistant un herbicide Monsanto Commerce Soja Rsistant un herbicide Monsanto Commerce
Riz Fort taux de Vitamine A IRRI, Institut Suisse existe
Manioc Faible contenu en cyanure Ohio State University Laboratoire
Manioc Rsistant lACMV Danforth ; IPS / IITA Essais
Mas Rsistant un herbicide Monsanto Commerce
Mas rsistant aux insectes Mosanto Commerce
Arachide Sans aflatoxine Texas A&M University Essais
Banane Mrissement retard Syngenta Laboratoire

Biotech-Master I - Ufhb-2013 Chap 2f

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