1

TUGAS BIOTEKNOLOGI FARMASI

APLIKASI PCR-RFLP UNTUK ANALISIS POLIMORFISME CYP2C9 DAN VKORC1 SERTA
EFEKNYA PADA DOSIS ACENOCOUMAROL PADA PASIEN DENGAN PENGGANTIAN
KATUP JANTUNG MEKANIK



DISUSUN OLEH :
ALWIYAH
11613127


PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
2013 / 2014
2

DAFTAR ISI ....................................................................................................... 1
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ...................................................................................... 2
B. Rumusan Masalah ................................................................................. 3
C. Tujuan ................................................................................................... 3
D. Manfaat ................................................................................................. 3
BAB II PEMBAHASAN
A. Penggantian Katup Jantung .................................................................... 5
B. Antikoagulan ......................................................................................... 5
C. Cytochrome 450 ................................................................................... 7
D. PCR-RFLP .............................................................................................. 7
E. Analisis Polimorfisme CYP2C9 dan VKORC1 dengan PCR-RPLF .............. 8
BAB III PENUTUP
A. KESIMPULAN ........................................................................................ 11
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 12
LAMPIRAN

3

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pasien dengan katup mekanis akan memerlukan pengobatan seumur hidup
dengan antikoagulan (pengencer darah). Salah satu jenis antikoagulan adalah
antagonis vitamin K. Antagonis vitamin K termasuk dalam kelompok obat yang paling
sering digunakan di seluruh dunia. Obat antikoagulan golongan ini sering digunakan
untuk terapi antikoagulasi jangka panjang, dan menunjukkan efek antikoagulan
dengan cara menghambat vitamin K epoksida reduktase. Salah satu contoh obat
antikogulan jenis antagonis vitamin K adalah Acenocoumarol.
Penggunaan antagonis vitamin K harus dimonitoring sebab indeks terapeutik
obatnya sempit dan memiliki hubungan dosis-respons tak terduga, sehingga sering
menimbulkan komplikasi perdarahan. Besar variasi respon dosis secara nyata
dipengaruhi oleh aspek farmakokinetik yang ditentukan oleh genetik, lingkungan dan
mungkin faktor-faktor lainnya yang belum diketahui.
Beberapa gen yang bertanggung jawab terhadap metabolisme obat adalah
gen CYPP450, yang menyandi ekspresi dari enzim-enzim metabolisme obat yaitu
CYP2C19, CYPIA1, CYP206, CYP2C9, CYP2E1. Variasi struktur dan fungsi dari enzim-
enzim tersebut dapat menyebabkan meningkatnya efek samping dari berbagai jenis
obat. Polimorfisme pada enzim seringkali juga dapat meningkatkan efek toksik dari
obat dibandingkan dengan individu normal. Polismorfisme pada enzim CYP2C9, yang
merupakan salah satu enzim pemetabolisme Acenocoumarol, kemungkinan dapat
menyebabkan besarnya variasi respon dosis yang dapat menimbulkan efek samping
pendarahan.
Dikatakan bahwa di antara faktor penentu genetik, varian c.430C > T
(Arg144Cys) dan c.1075A > C (Ile359Leu) dari sitokrom P450 2C9 (CYP2C9), yang
terlibat dalam metabolisme warfarin dan acenocoumarol, telah ditunjukkan dapat
mempengaruhi dosis antikoagulan (Aithal et al, 1999; Daly & King, 2005). Karena itu
diperlukan suatu metode untuk menganalisis polimorfisme pada gen tersebut, salah
4

satunya yaitu dengan metode PCR jenis polymerase chain reaction-restriction fragment
length polymorphism (PCR-RFLP).
B. Rumusan Masalah
Dari latar belakang diatas dapat ditarik suatu rumusan masalah sebagai berikut.
1. Apa yang dimaksud dengan penggantian katup jantung?
2. Bagaimana hubungan antara penggunaan antikoagulan terhadap pasien
dengan katup jantung mekanik?
3. Polimorfisme pada gen apa yang menyebabkan efek samping dari
penggunaan antikoagulan (econocoumarol) tersebut?
4. Bagaimana cara analisis polimorfisme dari gen tersebut dengan metode
PCR-RFLP?
C. Tujuan
Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini yaitu untuk
1. Mengetahui yang dimaksud dengan penggantian katup jantung.
2. Mengetahui hubungan antara penggunaan antikoagulan terhadap pasien
dengan katup jantung mekanik.
3. Mengetahui jenis polimorfisme yang terjadi yang menyebabkan efek
samping dari penggunaan antikoagulan (econocoumarol).
4. Mengetahui cara analisis polimorfisme dari gen tersebut dengan metode
PCR-RFLP.
D. Manfaat
Dari penulisan makalah ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa
informasi mengenai polimorfisme yang terjadi pada gen pemetabolisme obat
Acenocoumarol, sehingga dapat menimbulkan efek samping pendarahan
terutama pada pasien yang menggunakan antikoagulan (baik warfarin atau
acenocoumarol) untuk terapi jangka panjang seperti pada pasien dengan katup
jantung mekanis.


5

BAB II
PEMBAHASAN
A. Penggantian Katup Jantung Mekanik
Katup jantung buatan adalah perangkat ditanamkan di jantung dari pasien
dengan penyakit katup jantung (Bertazzo, Sergio, et al, 2013 & Miller, Jordan D.,
2013). Katup jantung mekanik (MHV) adalah prosthetics yang dirancang untuk meniru
fungsi katup alami dari jantung manusia. Sebagai hasil dari sejumlah proses penyakit,
baik diperoleh dan bawaan, salah satu dari empat katup jantung dapat mengalami
kegagalan fungsi dan mengakibatkan baik stenosis (aliran ke depan terhambat) dan /
atau aliran mundur (regurgitasi). Hal tersebut akan membebani kerja jantung dan
dapat menyebabkan masalah serius termasuk gagal jantung. Sebuah katup jantung
mekanik dimaksudkan untuk menggantikan katup jantung yang sakit dengan setara
prostetiknya. Namun, jantung dengan katup mekanis akan memerlukan pengobatan
seumur hidup dengan antikoagulan (pengencer darah), misalnya warfarin atau
acenocoumarin, sehingga dibutuhkan pemantauan pemeriksaan darah bulanan.
B. Antikoagulan
Antikoagulan adalah zat yang mencegah penggumpalan darah dengan cara
mengikat kalsium atau dengan menghambat pembentukan trombin yang diperlukan
untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin dalam proses pembekuan. Salah satu
jenis antikoagulan adalah antagonis vitamin K, contohnya warfarin dan
acenocoumarol. Struktur dari obat-obatan golongan ini mirip dengan vitamin K, obat
ini bekerja dengan cara antagonis terhadap vitamin K. Obat ini mengurangi bentuk
aktif dari vitamin K dengan menghambat enzim reduktase vitamin K epoksida dan
dengan demikian daur ulang vitamin K epoksida yang aktif kembali ke bentuk vitamin
K tereduksi aktif.
Obat-obatan antagonis vitamin K secara struktural mirip dengan vitamin K
dan bertindak sebagai inhibitor kompetitif enzim. Istilah "antagonis vitamin K" adalah
keliru, karena obat tidak langsung menginhibisi aksi vitamin K dalam arti farmakologi,
melainkan daur ulang vitamin K. Zat ini menghalangi pembentukkan faktor
pembekuan dalam hati, antara lain dari protrombin. Oleh karena itu, proses
6

pembekuan darah terhambat secara tidak langsung, selain mengurangi
pembentukkan fibrin.
Kumarin (lebih tepatnya 4-hydroxycoumarins ) adalah antagonis vitamin K
paling umum digunakan. Obat golongan ini yang paling umum digunakan adalah
warfarin (Pibarot, P., 2009).
Acenocoumarol merupakan turunan kumarin digunakan sebagai
antikoagulan. Turunan kumarin menghambat pengurangan vitamin K oleh reduktase
vitamin K. Hal ini untuk mencegah carboxylation vitamin K yang bergantung pada
faktor pembekuan, II, VII, XI dan X, dan mengganggu koagulasi. Hematokrit,
hemoglobin, rasio normalisasi internasional dan panel hati harus dipantau.
Acenocoumarol diidikasikan untuk pengobatan dan pencegahan penyakit
tromboemboli. Lebih khusus lagi, diindikasikan
untuk untuk pencegahan emboli serebral,
trombosis vena dalam, emboli paru, infark
tromboemboli dan serangan iskemik transien. Hal
ini digunakan untuk pengobatan deep vein
thrombosis dan infark miokard.
Farmakodinamik, Acenocoumarol
menghambat pengurangan vitamin K oleh
reduktase vitamin K. Hal ini untuk mencegah carboxylation residu asam glutamat
tertentu dekat N-terminal faktor pembekuan II, VII, IX dan X, yang tergantung K
faktor pembekuan vitamin. Carboxylation asam glutamat penting bagi interaksi
antara faktor-faktor pembekuan tersebut dan kalsium. Tanpa interaksi ini,
pembekuan tidak dapat terjadi. Kedua fase ekstrinsik (melalui faktor VII, X dan II) dan
intrinsik (melalui faktor IX, X dan II) dipengaruhi oleh acenocoumarol.
Mekanisme kerja, Acenocoumarol menghambat vitamin K reduktase,
sehingga penipisan bentuk tereduksi dari vitamin K (vitamin KH2). Seperti vitamin K
adalah kofaktor untuk karboksilasi residu glutamat pada daerah N-terminal vitamin K
tergantung faktor pembekuan, ini membatasi gamma karboksilasi dan aktivasi
7

berikutnya dari protein koagulan tergantung K vitamin. Sintesis vitamin K tergantung
faktor koagulasi II, VII, IX, dan X dan protein antikoagulan C dan S dihambat
mengakibatkan penurunan kadar protrombin dan penurunan jumlah trombin
dihasilkan dan terikat fibrin. Hal ini akan mengurangi thrombogenicity gumpalan.
C. Cytochrome 450
Beberapa gen yang bertanggung jawab terhadap metabolisme obat adalah
gen P450, yang menyandi ekspresi dari enzim-enzim metabolisme obat yaitu
CYP2C19, CYPIA1, CYP206, CYP2C9, CYP2E1. Variasi struktur dan fungsi dari enzim-
enzim tersebut dapat menyebabkan meningkatnya efek samping dari berbagai jenis
obat termasuk antidepresan, amfetamin, dan beberapa obat golongan beta-adreno
receptor. Variasi allele pada enzim metabolisme obat lainnya yaitu thiopurine methyl
transferase (TPMT), dapat menyebabkan efek samping yang tidak diinginkan.
Polimorfisme pada enzim seringkali juga dapat meningkatkan efek toksik dari obat
dibandingkan dengan individu normal.
D. PCR-RFLP
PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu proses pemisahan untai ganda
DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA
dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim
polimerase, yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang.
Komponen PCR : 1. DNA
2. Primer
3. Dntp
4. Polimerase DNA
5. Bufer reaksi PCR
Prinsip Dasar Reaksi PCR
Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) membutuhkan tiga
tahap :
1. Denaturasi (Melting),
2. Annealing Primer PCR, dan 3. Elongasi (ekstensi rantai DNA).
Aplikasi PCR dibidang klinis
Aplikasi PCR utama dibidang klinis adalah untuk diagnosis, dan kloning. Yang
paling sering dipakai di bidang klinis saat ini adalah untuk diagnosis, yaitu untuk
8

deteksi patogen infeksius dan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan
faktor resiko penyakit.
Untuk aplikasi PCR dibidang klinis tersebut, telah dikembangkan berbagai
macam teknis berbasis PCR, antara lain : RFLP-PCR (restriction fragment lenght
polymorphisms)
Pada prinsipnya, teknik ini dimanfaatkan untuk deteksi polimorfisme. Secara
umum teknik ini menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui adanya
polimorfisme (RFLP), dan produk hasil digesti tersebut diamplifikasi dengan PCR
(RFLP-PCR).
Teknik analisis
Teknik dasar untuk mendeteksi RFLPs melibatkan memecah-belah sampel
DNA oleh enzim restriksi, yang dapat mengenali dan memotong DNA mana pun
spesifik pendek urutan terjadi, dalam proses yang dikenal sebagai pembatasan digest.
Fragmen DNA yang dihasilkan kemudian dipisahkan oleh panjang melalui proses yang
dikenal sebagai elektroforesis gel agarosa, dan ditransfer ke membran melalui blot
Southern prosedur. Hibridisasi dari membran ke berlabel DNA probe kemudian
menentukan panjang fragmen yang melengkapi dengan menyelidiki. Sebuah RFLP
terjadi ketika panjang fragmen terdeteksi bervariasi antara individu. Setiap panjang
fragmen dianggap sebagai alel, dan dapat digunakan dalam analisis genetik.
Analisis RFLP dapat dibagi menjadi single-(SLP) dan penyelidikan multi-lokus
(MLP) paradigma. Biasanya, metode SLP lebih disukai daripada MLP karena lebih
sensitif, lebih mudah untuk menafsirkan dan mampu menganalisis sampel campuran
DNA. Selain itu, data dapat dihasilkan bahkan ketika DNA rusak (misalnya ketika
ditemukan dalam tulang tetap.)
Aplikasi
Analisis variasi RFLP dalam genom merupakan alat vital dalam pemetaan
genom dan analisis penyakit genetik. Jika peneliti mencoba untuk awalnya
menentukan lokasi kromosom gen penyakit tertentu, mereka akan menganalisis DNA
dari anggota keluarga terserang penyakit ini, dan mencari alel RFLP yang
menunjukkan pola yang sama dari warisan seperti yang dari penyakit. Setelah gen
penyakit itu terlokalisasi, analisis RFLP keluarga lain bisa mengungkapkan siapa yang
berisiko untuk penyakit ini, atau yang mungkin menjadi pembawa gen mutan.
9

Analisis RFLP juga dasar untuk metode awal sidik jari genetik, berguna dalam
identifikasi sampel diambil dari kejahatan adegan, dalam penentuan ayah, dan dalam
karakterisasi keragaman genetik atau pola breeding pada populasi hewan.
RFLPs dapat digunakan menentukan status penyakit individu. Misalnya bisa
digunakan dalam deteksi mutasi gen tertentu yang mengakibatkan perubahan
farmakokinetik obat atau mutasi yang dapat menyebabkan penyakit tertentu. Selain
itu, RFLPs juga dapat digunakan untuk mengukur tingkat rekombinasi yang dapat
menyebabkan genetik peta dengan jarak antara lokus RFLP yang diukur dalam
centiMorgans.
E. Analisis polimorsime CYP29 dan VKORC1 dengan PCR-RFLP
Analisis polimorfisme pada gen CYP2C9 dan VKORC1 menggunakan metode
PCR-RFLP. Sampel DNA diekstraksi dari darah dengan menggunakan Invitrogen DNA
ekstraksi kit murni DNA genom Link kit. PCR digunakan untuk memperkuat segmen
gen CYP2C9 dan VKORC1 dari 100 ng DNA genom dalam volume total reaksi 25 l.
Total 2.5 mM MgCl2, masing-masing 200 M dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0.025 unit/l
Taq DNA polimerase, 75 mM Tris-HCl (pH 8.8 pada 25 C), 2SO4 20 mM (NH4), 0.16 M
dari setiap forward dan reverse primers ditambahkan 1 l template DNA per reaksi.
Reaksi berantai polimerase dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut : 94
C selama 5 menit, diikuti oleh 34 siklus 94 c selama 45 detik, 54.3 C untuk 1 min dan
72 C untuk 1 min 30 detik diikuti oleh akhir ekstensi pada 72 C selama 8 menit di
pengendara sepeda termal (PTC 200 Thermal Cyclers, BioRad Inc) 8, 9. urutan primer
forward dan reverse untuk CYP2C9*2, CYP2C9* , VKORC1 adalah sebagai berikut: * 2F
= 5'TACAAATACAATGAAAATATCATG-3', * 2R = 5'CTAACAACCAGGACTCATAATG3';
untuk * 3F = 5'AGGAAGAGATTGAACGTGTGA-3', * 3R =
5'GGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3'; VF=-5 'ATCCCTCTGGGAAGTC AGC-3' ; dan VR
=-5 'CACCTTCAACCTCTCCATCC-3.
AVAII, STY I, dan NCI1 masing-masing digunakan untuk metabolisme DNA
untuk CYP2C9 * 2, CYP2C9 * 3, dan VKORC1. Produk PCR yang dielektroforesi pada 2
persen agarose gel di 120 V selama 60menit ditambahkan dengan 0,5 g/ml ethidium
bromida Tris Borat EDTA (TBE) pH buffer (8.3) dan Divisualisasikan oleh radiasi
10

ultraviolet. Gambar perwakilan gel ditunjukkan dalam gambar 1. Ukuran amplicon
untuk CYP2C9 * 2, * 3 dan VKORC1 yang 690,130, dan 636, masing-masing. Liar dan
alel kecil masing-masing yang diidentifikasi oleh 521,169 dan 690 bp untuk CYP2C9 * 2,
130 dan 104, 26 untuk CYP2C9 * 3 dan 472, 114, 50 dan 522,114 untuk VKORC1.
Dari metode PCR-RFLP tersebut diperoleh hasil bahwa polimorfisme gen
CYP2C9 dan VKORC1 menentukan besarnya variabilitas dosis antar individu dari
acenocoumarol pada pasien India dengan penggantian katup jantung mekanik.

11

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Gen yang bertanggung jawab terhadap metabolisme obat Acenoumarol
adalah gen P450, yang menyandi ekspresi dari enzim metabolisme obat yaitu CYP2C9.
Variasi struktur dan fungsi atau polismorfisme pada enzim CYP2C9, kemungkinan
dapat menyebabkan besarnya variasi respon dosis yang dapat menimbulkan efek
samping pendarahan, terutama pada pasien dengan penggantian katup jantung
mekanik yang selalu membutuhkan antikoagulan untuk terapi jangka panjang.
PCR-RFLP (polimorfisme panjang) digunakan untuk mengetahui genotipe
CYP2C9 *2, *3 dan VKORC1-1639G. Diperoleh hasil bahwa polimorfisme gen CYP2C9
dan VKORC1 menentukan besarnya variabilitas dosis antar individu dari
acenocoumarol pada pasien dengan penggantian katup jantung mekanik.
12

DAFTAR PUSTAKA

Kaur, Anupriya, et al, 2013, Cytochrome P450 (CYP2C9*2,*3) & Vitamin-K Epoxide
Reductase complex (VKORC1 -1639G<A) Gene Polymorphisms & Their Effect on
Acenocoumarol Dose in Patients with Mechanical Heart Valve Replacement, Indian J
Med Res, 137: 203 209.
S. C. Cannegieter, F. R. Rosendaal and E. Briet, 1994, Thromboembolic and bleeding
complications in patients with mechanical heart valve prostheses, Circulation, 89: 635
641.
Ramon Montes, Estefana Ruiz de Gaona, Miguel Angel Martnez-Gonzalez, Ignacio
Alberca and Jose Hermida, 2006, The c.) 1639G > A polymorphism of the VKORC1
gene is a major determinant of the response to acenocoumarol in anticoagulated
patients, British Journal of Haematology, 133: 183187.
Aithal, G.P., Day, C.P., Kesteven, P.J. & Daly, A.K., 1999, Association of polymorphisms
in the cytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose requirement and risk of bleeding
complications, Lancet, 353: 717719.
Daly, A.K. & King, B.P., 2005, Pharmacogenetics of oral anticoagulants,
Pharmacogenetics, 13: 247252.
Bertazzo, Sergio, et al, 2013, Nano-analytical electron microscopy reveals
fundamental insights into human cardiovascular tissue calcification, Nature Materials,
12 (6): 57683.
Miller, Jordan D., 2013, Cardiovascular calcification: Orbicular origins, Nature Materials,
12 (6): 4768.
Pibarot, P.; Dumesnil, J.G., 2009, Prosthetic Heart Valves: Selection of the Optimal
Prosthesis and Long-Term Management, Circulation, 119 (7): 103448.
http://www.drugbank.ca/drugs/DB01418 diakses pada 29 April 2014.