Anda di halaman 1dari 5

Human Plasma Proteome:

STRATEGI STRATEGI DALAM PROTEOMIK UNTUK


MENGANALISIS CAIRAN TUBUH
Maryanna Istiqomah Pratiwi/ 106 11 014
1. Pendahuluan
1.1. Konteks cairan tubuh dalam biologi
- Pada abad 19, Claude Bernard, seorang ahli fisilogi memperkenalkan konsep lingkungan
internal, yaitu suatu sirkulasi cairan organik yang mengelilingi jaringan. Lingkungan internal
didefinisikan sebagai cairan ektrasel yang menjaga keseimbangan lingkungan seluler. Cairan
organik ini penting dalam analisis proteomik
- Tubuh manusia terdiri dari 60% cairan yang terdistribusi dalam 2 kompartemen besar yaitu
ruang ekstraseluler dan ruang intraseluler. Cairan ekstraseluler secara umum terbagi menjadi
cairan interstisial (lingkungan mikro) serta plasma darah (lingkungan makro).
- Suatu jaringan terdiri dari elemen seluler dan elemen ekstraseluler yaitu matriks
ekstraseluler beserta cairan interstisial jaringan tersebut.
- umumnya dalam literatur lingkungan mikro jaringan merujuk pada kedua elemen jaringan
tersebut, namun, disini lingkungan mikro didefinisikan sebagai cairan interstisial saja.
- protein dikeluarkan ke lingkungan mikro, oleh karena itu, sekret suatu individual sel
terefleksikan dalam profil lengkap protein lingkungan mikro. Lingkungan mikro mengalami
kontak langsung dengan sel dan mengalami pertukaran molekul, sementara lingkungan
makro (plasma) berkomunikasi dengan semua lingkungan mikro di tubuh, mengantarkan
nutrien dan sinyal serta menerima umpan balik melalui limfatik.
-plasma penting dalam analisis proteomik cairan tubuh manusia karena plasma
menggambarkan status fisiologis dari setiap sel dan dapat mempengaruhi cairan tubuh
lainnya.
1.2. Pengkayaan biomarker pada cairan tubuh
- tantangan besar dalam proteomik adalah menemukan biomarker atau penanda molekuler
dari suatu penyakit. Hal ini karena plasma darah 99% terdiri dari protein albumin dan
tranferin, dan hanya 1% saja yang dapat dijadikan biomarker.
-untuk analisis proteomik, dilakukan penghilangan protein yang berlimpah dalam plasma
serta pengkayaan protein langka. Kemudian, jumlah protein setelah pengkayaan pada sebuah
sampel dibandingkan dengan jumlah protein pada keadaan fisiologis normal dan dihasilkan
suatu status fisologis. Misal: CEA (carcinoembyonic antigen) pada sampel yang terkena
tumor 5 x 10
3
kali lebih banyak daripada pada manusia normal.
2. Pendekatan proteomik untuk mempelajari cairan tubuh
-Proteomik merupakan teknologi postgenomik baru yang memungkinkan pemahaman akan
kompleksitas sistem biologis yang dikode oleh genom pada level protein.
- teknologi ini merupakan teknik yang memungkinkan untuk menganalisis sejumlah besar
protein dalam suatu eksperimen. Secara umum, proteomik dibagi menjadi dua pendekatan:
1. Proteomik ekspresi: bertujuan mengkatalogkanprotein yang diekspresikan suatu sel
pada waktu tertentu
2. Proteomik target: berfokus pada penentuan fungsi seluler gen langsung pada level
protein.
Proteomik cairan tubuh berfokus dalam proteomik ekspresi, terutama perbedaan
kualitatif antara profil protein pada kondisi fisiologis yang berbeda (sakit/ tidak). Proteomik
cairan tubuh merupakan suatu rangkaian teknologi, seperti yang diilustrasikan dalam gambar
berikut:

2.1. Pengambilan dan penyimpanan sampel
- Sampel yang paling umum digunakan dalam analisis proteomik adalah plasma darah.
Darah yang menggumpal secara alami lalu disentrifugasi menghasilkan 2 fasa yaitu
gumpalan yang terdiri atas sel darah dan fibrin serta fase cairan (serum). Serum yang
dihilangkan fibrinogennya dengan penambahan EDTA/heparin disebut plasma
-cara sampling dan penyimpanan yang lazim dipakai oleh HUPO (Human Plasma Proteome
Organization) pada Human Plasma Proteome Project antara lain dengan menambahkan
plasma darah kasar dengan inhibitor protease, lalu disentrifugasi 1 jam blood draw
(serum) pendinginan cepat dalam dry icedisimpan dalam suhu -70
o
C
2.2. Loading sampel
-untuk menganalisis protein dari jaringan atau sel yang dilisis, dilakukan perbandingan
sejumlah protein.
-volume protein total yang dibandingkan harus sama. Berikut ilustrasi yang menggambarkan
pentingnya loading volume.


-cara umum yang dilakukan untuk menhindari kesalahan analisis akibat kesalahan loading
sampel terbagi dua:
Memasukkan sejumlah volume total protein yang sama. Cara ini masih mengandung
kelemahan karena adanya efek dari perlakuan penurunan protein yang berlimpah yaitu
informasi volumetrik hilang selama pemisahan kromatografis dan desalting.
Normalisasi data sesuai konsentrasi protein total. Misal sampel pasien A sebagai
baseline maka faktor normalisasi menjadi

. disebut sebagai faktor


kompensasi.
2.3 Prefraksinasi dan fraksinasi
- pemisahan protein yang paling umum yaitu dengan metode 2DE (2 dimensi elektroforesis).
2DE dapat membaca >5000 protein dalam 1 gel dan mendeteksi <1ng protein per spot.
-namun, terdapat masalah antara lain plasma diperkirakan mengandung >1 juta bentuk
protein serta adanya kelimpahan protein yang berbeda-beda kisarannya.
2.3.1 Prefraksinasi
- prefraksinasi merupakan pengkayaan populasi protein target, yaitu dengan cara
menghilangkan protein yang berlimpah serta mengisolasi subpopulasi protein misal
glikoprotein, fosfoprotein dll, sehingga dihasilkan komponen protein individual.
- mencari protein tunggal dalam campuran protein di plasma bagaikan mencari jarum dalam
tumpukan jerami, oleh karena itu terdapat 2 strategi yang digunakan untuk mengurangi
perbedaan kelimpahan protein.
Pendekatan yin: yaitu dengan menurunkan protein yang berlimpah. Cara ini
merupakan metode yang paling umum. Pendekatan ini dilakukan dengan melakukan
kromatografi substraksi imunoafiitas. Namun kekurangannya yaitu menurunkan
kemungkinan ditemukannya protein spesifik
Pendekatan yang: dengan cara meningkatkan jumlah kopi protein yang langka
(sedikit). Terdapat dua metode. Metode pertama dengan perpustakaan peptida, yaitu
dengan pembentukan peptida besar melalui reaksi kimia kombinatorial. Metode ini
cukup jarang dipakai terkait efektifitas dan efisiensi kerja. Metode kedua yaitu metode
penangkapan selektif. Cara yang sering dipakai yaitu dengan imunopresipitasi
(penangkapan berdasarkan afinitas antar antibodi dengan protein target) dan isotope
coded tagging + MS (protein ditangkap dalam kolom, ditandai kemudian
diidentifikasi dengan bantuan spektrometri massa).
2.3.2 Fraksinasi
- Teknologi yang umum dipakai yaitu dengan elektroforesis dan kromatografi cairan (LC).
Metode yang dapat digunakan untuk fraksinasi antara lain isoelectric focusing (IEF) yaitu
memanfaatkan migrasi protein berdasarkan muatan pada gradien pH serta 2DE (2 dimensi
eleketroforesis). 2DE menggabungkan IEF pada dimensi pertama serta SDS PAGE pada
dimensi kedua dengan memisahkan protein berdasarkan karakteristik pI (titik isoelektrik) dan
M
r.
Kemampuan memisahkan protein pada 2DE bergantung pada ukuran gel dan gradien pH.
-adapula DIGE, suatu inovasi fraksinasi 2DE. Mulanya, sampel akan dilabel secara in vitro
oleh 2 pewarna fluoresen sianin yang kemudian dibedakan dari eksitasi dan emisi panjang
gelombangnya. Pewarna ini dicampur sebelum IEF lalu di 2DE.
- pada teknologi kromatografi cairan, pemisahan komponen campuran protein berdasarkan
distribusinya pada fase gerak dan fase diam. Fase diam merupakan kunci utama kromatografi
cair. Fase diam dibuat dari matriks penyokong yang dilapis dengan gugus fungsi yang
diinginkan sesuai interaksi pengikatannya.
2.4 Spektrometri massa (MS)
- Spektrometri massa berguna untuk mengidentifikasi serta mengkuantifikasi protein dalam
suatu campuran hasil ionisasi ringan protein dan pencocokan dengan database. Tujuan utama
dari spektrometri massa antara lain menentukan struktur primer peptida, analisis kuantitatif,
serta karakterisais modifikasi pasca translasi. Spektrometer massa dapat dibagi menjadi tiga
bagian dasar , yaitu sumber ionisasi , analisator , dan detektor .
-Sampel harus dipaparkan ke sumber ionisasi dari instrumen . di dalam sumber
ionisasi , molekul sampel akan terionisasi , karena ion lebih mudah untuk
dimanipulasi daripada molekul netral . Ion-ion ini diekstrak ke wilayah analyzer
spektrometer massa di mana mereka dipisahkan sesuai dengan rasio massa mereka (
m ) terhadap muatan ( z ) ( m / z ) . Ion yang dipisahkan terdeteksi dan sinyal ini
dikirim ke sistem data di mana rasio m / z disimpan bersama dengan kelimpahan
relatif mereka untuk dipresentasikan dalam format spektrum am / z .
Berikut merupakan pendekatan identifikasi protein menggunakan MS.


2.4.1 Identifikasi protein
-Pengidentifikasian protein umumnya dilakukan dengan pendekatan bottom up MS/MS
(tandem massa spectrometry). Protein dipecah menjadi peptida lalu ion peptida diisolasi,
difragmentasi dan dianalisis untuk menghasilkan spektrum MS/MS. Spektrum ini kemudian
dibandingkan dengan spektrum MS/MS yang dibuat dari database urutan protein melalui
algoritma sehingga dihasilkan derajat kesamaan antar MS/MS eksperimen dengan teori.
2.4.2 Analisis kuantitatif dengan MS
Terdapat dua pendekatan:
1. Labeling dengan isotop stabil; yaitu dengan membandingkan langsung 2 keadaan
proteom dalam suatu analisis
2. Kuantisasi berdasarkan arus ion (metode tanpa labeling); membandingkan arus ion
pada peptida yang sama di eksperimen yang berbeda.
-cara yang umum dalam kuantisasi protein cairan tubuh adalah tagging kimia (labelling
isotop). Mula-mula sampel protein diberi label cahaya dan isotop berat lalu dikumpulkan dan
dianalisis bersama untuk meliat kelimpahan protein berisotop tersebut.