NALISIS DEL CONTENIDO O S DE PROTENAS EN LOS ALIMENTOS EN LOS ALIMENTOS 2013 Dra. Roxana Verdini Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos La determinacin de la CANTIDAD DE PROTENA de un alimento no es sencilla y el valor obtenido en cada caso depende del MTODO utilizado. Muchos ensayos dependen de la presencia de Muchos ensayos dependen de la presencia de una determinada cadena lateral aminoacdica (Lowry, Biuret). los resultados analticos se vern condicionados por la proporcin del condicionados por la proporcin del aminocido en cuestin en las protenas sometidas al ensayo y necesitarn ser referidos a alguna protena estndar. Otros mtodos se basan en la determinacin del Otros mtodos se basan en la determinacin del contenido de nitrgeno total (Kjeldahl). Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos Existen numerosas fuentes de NITRGENO NO PROTEICO que pueden interferir en algunos mtodos de anlisis: aminocidos libres pptidos pequeos aminocidos libres, pptidos pequeos, cidos nucleicos, fosfolpidos, aminoazcares, porfirina, algunas vitaminas, alcaloides, cido rico, urea, iones amonio, etc. Otras fuentes de interferencia pueden ser los otros macronutrientes presentes en los alimentos como hidratos de carbono y lpidos. Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos Los mtodos mas comnmente empleados son: Kjeldahl, Kjeldahl/Bethelot Kjeldahl/Bethelot, Biuret, Lowry, absorbancia a 280 nm, fijacin de colorantes, turbidimtrico turbidimtrico. Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos Estos mtodos se fundamentan en: determinaciones de nitrgeno, enlaces peptdicos enlaces peptdicos, aminocidos aromticos, absortividad UV de las protenas, grupos amino libres, propiedades de dispersin de la luz, capacidad de adhesin de colorantes capacidad de adhesin de colorantes. Mtodo de Kjeldahl j Es un mtodo oficial descrito en mltiples normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. El mtodo de Kjeldahl se basa en los siguientes supuestos: la proporcin de nitrgeno no protenico en un producto alimenticio es demasiado pequea i ifi ti para ser significativa, una determinacin del contenido de it t t l ( fl j fi i t i i nitrgeno total (refleja con suficiente precisin el contenido de protena del alimento, l i t l it la proporcin que representa el nitrgeno en la mayor parte de las protenas alimenticias es de 16%. de 6% Mtodo de Kjeldahl j FUNDAMENTO Involucra la conversin del nitrgeno presente a sulfato de amonio por OXIDACIN HMEDA con sulfato de amonio por OXIDACIN HMEDA con cido sulfrico. Posteriormente el sulfato de amonio se descompone por ALCALINIZACIN con hidrxido de sodio y DESTILACIN del amonaco liberado de sodio y DESTILACIN del amonaco liberado captndolo en una solucin cida. Finalmente se realiza una VALORACIN del amonaco. Esta determinacin incluye todo el nitrgeno reducido presente (-NH 2 y =NH), de modo que los compuestos amoniacales, urea y aminocidos libres son tambin valorados. Mtodo de Kjeldahl j UN POCO DE HISTORIA En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso bsico del conocido mtodo desarroll el proceso bsico del conocido mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno orgnico. El mtodo original fue sufriendo luego algunas El mtodo original fue sufriendo luego algunas modificaciones. Wilforth (1885) Gunning (1889) Arnold Arnold Winkler Mtodo de Kjeldahl j UN POCO DE HISTORIA En el mtodo original la digestin se efectuaba con una mezcla de cido sulfrico y anhdrido con una mezcla de cido sulfrico y anhdrido fosfrico y la oxidacin se completaba mediante la adicin de permanganato de potasio. Las modificaciones del mtodo que han resultado ms tiles emplean: resultado ms tiles emplean: xido de mercurio como catalizador de oxidacin (Wilfoth). K 2 SO 4 para aumentar el punto de ebullicin del cido sulfrico (Gunning) ebullicin del cido sulfrico (Gunning). CuSO 4 tambin como catalizador de oxidacin (Arnold). Mtodo de Kjeldahl j UN POCO DE HISTORIA Los catalizadores permiten acortar el tiempo de digestin y actan como transportadores de O digestin y actan como transportadores de O 2 . Otra modificacin ampliamente aceptada es la introducida en la etapa de destilacin propuesta por Winkler: originalmente se utilizaba cido sulfrico valorado para captar el amonaco, titulando posteriormente su exceso con NaOH valorado NaOH valorado. Mtodo de Kjeldahl j UN POCO DE HISTORIA La modificacin consiste en: recibir el NH 3 sobre una solucin de cido brico, valorarlo directamente con solucin valorada de H 2 SO 4 (Winkler) o HCl. Ventajas: la solucin de cido brico no necesita ser exactamente medida eliminando los errores en ser exactamente medida, eliminando los errores en la medicin del cido valorado en el colector y por otra parte slo se requiere una solucin valorada H 2 SO 4 (Winkler) o HCl. El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo para la El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo para la formacin de burbujas. Mtodo de Kjeldahl j ESQUEMTICAMENTE Mtodo de Kjeldahl j ALGUNOS EQUIPOS Mtodo de Kjeldahl j ALGUNOS EQUIPOS Los equipos mas modernos viene con un sistema os equ pos as ode os e e co u s ste a de extraccin y neutralizacin de gases: una unidad Scrubber que bloquea el paso y u a u dad Sc ubbe que b oquea e paso y neutraliza las condensaciones cidas, una bomba de recirculacin de agua que proporciona un gran caudal de vaco para la aspiracin de los gases. Mtodo de Kjeldahl j VENTAJAS DEL MTODO Apropiado para varios tipos de productos. Alta fiabilidad. Usado como mtodo de referencia Usado como mtodo de referencia. DESVENTAJAS DEL MTODO DESVENTAJAS DEL MTODO Interfieren compuestos nitrogenados no Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos. Uso de catalizadores txicos o caros Uso de catalizadores txicos o caros. Eleccin del factor de conversin. Mtodo de Kjeldahl j FACTOR DE CONVERSIN El contenido porcentual promedio de N en las protenas de diversos alimentos es de 16% protenas de diversos alimentos es de 16%. El factor para convertir N en protenas sera entonces 100/16 = 6,25. Este factor general de conversin no es sin Este factor general de conversin no es sin embargo exacto, ya que las protenas de origen animal contienen generalmente menos nitrgeno y las de origen vegetal ms. As el factor de conversin para la protena del As, el factor de conversin para la protena del trigo es 5,7 y para la de productos lcteos es 6,38. Mtodo de Kjeldahl j FACTOR DE CONVERSIN Actualmente se conoce el contenido de N, y por lo tanto el factor apropiado de una gran cantidad lo tanto el factor apropiado, de una gran cantidad de productos agrcolas. Debido a la confusin que podra derivarse del hecho de utilizar el factor general de conversin 6 25 o el especfico para la protena en estudio 6,25 o el especfico para la protena en estudio Es necesario aclarar siempre en los informes el factor de conversin utilizado para el clculo de protenas. Mtodo de Kjeldahl j FACTOR DE CONVERSIN Mtodo de Kjeldahl j ECUACIONES Digestin: g
n-C-NH 2 + mH 2 SO 4 + catalizadores CO 2 + (NH 4 ) 2 SO 4 + SO 2
Neutralizacin y destilacin
(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH 2 NH 3 + Na 2 SO 4 + 2 H 2 O ( 4 ) 2 4 3 2 4 2
NH 3 + H 3 BO 3 NH 4 + + H 2 BO 3 -
Titulacin
H 2 BO 3 - + H + H 3 BO 3
Mtodo de Kjeldahl j CLCULOS %N = V x N x 14 x 100 %N V x N x 14 x 100 1000 p %N = V x N x 0,014 x 100 p V: mL de cido N: normalidad del cido P: gramos de muestra 0,014: equivalente volumtrico del N , q Mtodo de Kjeldahl j Mtodo de Kjeldahl /Berthelot Este mtodo combina la digestin hmeda del mtodo de Kjeldahl con la reaccin colorimtrica de mtodo de Kjeldahl con la reaccin colorimtrica de Bethelot. El producto de la digestin se neutraliza se lleva El producto de la digestin se neutraliza, se lleva a volumen final y luego una alcuota se somete a la reaccin colorimtrica. El NH 4 + presente en la digestin sulfrica reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en medio alcalino, formndose un complejo de color azul. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de N amoniacal presente en la muestra amoniacal presente en la muestra. Mtodo de Kjeldahl j Mtodo de Kjeldahl /Berthelot La absorbancia del complejo de se lee a 540 nm. Se calibra con solucin de sulfato de amonio. Por lo tanto lo que se determina por este mtodo es nitrgeno total. Otros mtodos Mtodos qumicos Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos mtodos empricos e que se sugiere que estos mtodos empricos e indirectos sean calibrados con el mtodo de Kjeldahl. Se espera una buena correlacin entre estos dos tipos de determinaciones de protena cuando la tipos de determinaciones de protena cuando la relacin N no proteico/N proteico es baja y constante Son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayora de los vegetales y insatisfactorios para la mayora de los vegetales y mezclas de alimentos. Otros mtodos Mtodo de absorbancia a 280 nm El mtodo se basa en la medicin de absorbancia a 280 nm. Las protenas poseen una banda de absorcin en el UV entre190 y 290 nm debida fundamentalmente a la presencia de aminocidos aromtcos (tirosina, triptofano y fenilalanina) triptofano y fenilalanina). Es un mtodo simple, rpido y no destructivo. Es un mtodo directo para la determinacin de protenas que puede aplicarse en algunos sistemas alimenticios alimenticios. Es necesaria la calibracin con una protena estndar estndar. Otros mtodos Mtodo de absorbancia a 280 nm La solucin debe ser clara e incolora, la turbidez puede afectar los resultados. El contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente entre las distintas protenas. Los cidos nucleicos interfieren, no as el amonio. Otros mtodos Mtodo de Biuret Las protenas y pptidos reaccionan con iones de cobre en solucin alcalina, formando un quelato color violeta de configuracin desconocida. La intensidad de color del complejo a 550 nm es directamente proporcional a la concentracin de protenas presente en la muestra protenas presente en la muestra. Es rpido, simple y no detecta nitrgeno de fuentes no proteicas o no peptdicas fuentes no proteicas o no peptdicas. Es necesaria la calibracin con una protena estndar estndar. Otros mtodos Mtodo de Biuret Altas concentraciones de carbohidratos, lpidos pueden causar opalescencia en la solucin final. Las sales de amonio tambin interfieren en la reaccin. Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azcares reductores que reducen el ion cprico en medio alcalino produciendo resultados cprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche. Otros mtodos Mtodo de Lowry Cuando se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina triptfano cistina cistena e histidina tirosina, triptfano, cistina, cistena e histidina. La absorbancia del complejo se lee a 750 nm (mayor sensibilidad) o a 500 nm (mayor sensibilidad) o a 500 nm. Tiene mayor sensibilidad que el mtodo del Biuret Biuret. La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de protena protena. La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protena proporcional a la concentracin de protena. Otros mtodos Mtodo de Lowry Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reaccin. Es menos afectado por la turbidez de la muestra. Es afectado por la presencia de azcares reductores al igual que el mtodo de Biuret. Otros mtodos Mtodos de adhesin de colorante Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reaccin. Es menos afectado por la turbidez de la muestra. Es afectado por la presencia de azcares reductores al igual que el mtodo de Biuret. Pueden adherirse colorantes ANINICOS o CATINICOS (BRADFORD). Sus fundamentos son diferentes. Otros mtodos Mtodos de adhesin de colorante aninico El COLORANTE ANINICO se une a los grupos catinicos de los residuos bsicos de las protenas (histidina, arginina, lisina) y forman un complejo insoluble insoluble. El colorante en exceso permanece soluble y se relaciona inversamente con la concentracin de relaciona inversamente con la concentracin de protenas. El mtodo con el colorante NARANJA 12 est El mtodo con el colorante NARANJA 12 est descripto en la AOAC para leche fluida, helados, leche en polvo descremada (=480 nm). Algunos compuestos no proteicos como almidn o metales pueden unirse al colorante. Otros mtodos Mtodos de Bradford El Se basa en la unin del colorante Coomassie Blue G-250 a las protenas. Las protenas (aminocidos bsicos y aromticos) se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible, simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas detergentes y las soluciones bsicas. No interfieren los carbohidratos.