Anda di halaman 1dari 13

BAB I

PENDAHULUAN
Perkembangan bioteknologi modern di awal tahun 1970-an telah
membuka cakrawala baru dunia ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai
disiplin ilmu bergerak bersama dalam proses pengembangan teknik-teknik
yang digunakan dalam penelitian biologi molekuler. Kajian aktivitas terpadu
antar ilmu-ilmu biologi, biokimia, genetika, mikrobiologi, teknik kimia,
komputasi, dan biofisika dengan menggunakan pendekatan biologi molekuler
untuk menghasilkan suatu barang dan jasa yang terkait dengan
perkembangan IPTEK.
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain
Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan
jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-
107 kali. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana
cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi
urutan non-target.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan
perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit
genetik, infeksi oleh virus, dan diagnosis dini penyakit seperti AIDS.
Seperti yang telah diketahui bahwa setiap mahkluk hidup memiliki
materi genetik yang terkandung dalam DNA maupun RNA, begitu pula pada
virus. Hal inilah yang menjadi salah satu dasar dari pemeriksaan materi
genetik pada kasus-kasus resistensi. Penelitian ini membutuhkan
penggandaan dari kopi RNA virus yang membutuhkan teknologi PCR atau
RT-PCR., yaitu Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi
sebesar 200 l ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga
miliaran kali jumlah semula. Maka pantas saja dengan berbekal DNA yang
terkandung dalam sampel yang sedikit bisa diperoleh banyak sekali informasi
sesuai kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang
terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi
penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan bantuan
enzim DNA polymerase.





BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. RT- PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase
Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari
proses PCR biasa.
Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung
satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA
(complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase.
Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul
DNA secara in vitro menggunakan template RNA.
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan
variasi dari polymerase chain reaction (PCR), sebuat teknik laboratorium
yang biasanya digunakan dalam biologi molekular untuk menghasilkan
sejumlah gandaan bagian tertentu untai DNA atau yang dikenal dengan
Amplifikasi. Dalam RT-PCR, sebaliknya, untai RNA pertama-tama di transkrip
balik menjadi DNA komplemen (complementary DNA, atau cDNA)
menggunakan enzim reverse transcriptase, dan cDNA yang dihasilkan akan
digandakan seperti halnya PCR pada umumnya. Reverse transcription PCR
(RT-PCR) jangan dirancukan dengan Real-Time Polymerase Chain Reaction
(Q-PCR/qRT-PCR), yang biasanya terjadi kesalahan dalam penggunaan
singkatan. Jadi RT-PCR merupakan singkatan dari Reverse-Transcription
Polymerase Chain Reaction dan bukan kependekan dari Real-Time PCR.
Biasanya Real-Time PCR disingkat dengan Q-PCR atau qPCR atau yang
sebenarnya adalah Quantitative PCR.
Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga
diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda
dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni.
Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka
DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses
amplifikasi mRNA yang mempunyai poly (A) tail pada ujung 3, maka oligo dT,
random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat
dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.
Amplifikasi RNA dengan PCR dapat dilakukan dengan menggunakan
primer yang menempel ke templat RNA dan kemudian mensintesis copy DNA
(cDNA) dengan menggunakan enzim reverse transcriptase (RT) dan diikuti
dengan proses PCR. Beberapa DNA polimerase dapat digunakan pada tahap
ini, seperti T. thermophilus (Tth) DNA polimerase, bila terdapat mangan (Mn)
dapat melakukan transkripsi balik RNA. Karena Tth DNA polymerase dapat
menggunakan DNA dan RNA sebagai templat, maka prosedur ini dapat
dilakukan dalam satu tabung. Templat RNA virus (seperti retrovirus) atau
RNA poli A akan di copy menggunakan heksamer acak atau primer spesifik.
RNA (RT) PCR merupakan teknik yang sangat sensitif untuk mempelajari
ekspresi gen pada tingkat RNA, dan pada kuantifikasi mRNA atau level RNA
virus.
Reverse transcriptase biasanya digunakan untuk mensintesis rantai
pertama cDNA dari RNA. Reverse transkriptase dapat dipurifikasi dari
beberapa sumber, seperti: avian myeloblastosis virus (AMV) dan Molones
murine leucemia virus (MMLV). AMV reverse transkriptase adalah RNA-
dependent DNA plimerase yang menggunakan RNA rantai tunggal sebagai
templat dan dapat mensintesis cDNA dengan arah 53 jika terdapat primer.
Sama seperti aktivitas DNA polimerase, enzim ini juga mempunyai aktifitas
ribonuklease H yang spesifik terhadap hibrida RNA : DNA.







RT-PCR menggabungkan sintesis cDNA dari template RNA dengan
PCR, metode yang sensitif cepat untuk menganalisis ekspresi gen. RT-PCR
digunakan untuk mendeteksi atau mengukur ekspresi mRNA, sering dari
konsentrasi terkecil dari target RNA.













II.2. Prinsip dan Prosedur RT-PCR
RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan
sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut
kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan
menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya
mengikuti amplifikasi logaritmik.
II.2.1. Tahap tahap RT-PCR
RT-PCR meliputi tiga tahap utama antara lain :
a. Tahap reverse transcription
Tahap reverse transcription (RT) atau transkripsi balik adalah dimana RNA
ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse
transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan
performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase
sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa
DNA. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung
yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah
(two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40C sampai 50C, tergantung
pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan.

b. Tahap denaturasi pada suhu 95C,
Pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada
untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya akan
dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu
anealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi,
probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation.
Perhatian utama saat memilih temperatur anealing optimal adalah melting
temperatur dari primer dan probe (jika digunakan). Temperatur annealing
dipilih untuk PCR tergantung langsung pada panjang dan komposisi dari
primer tersebut. Hal ini merupakan hasil dari perbedaan ikatan hidrokarbon
antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3 ikatan). Temperatur annealing
biasanyaberkisar 5 derajat di bawah Tm terendah dari pasangan primer yang
digunakan.
c. Amplifikasi PCR
Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan
DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang
termostabil, biasanya pada suhu 72C, yang merupakan suhu optimal untuk
aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur,
perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram
menggunakan programmable thermal cycler. Analaisa produk PCR
tergantung pada kebutuhann PCR. Jika menggunakan PCR konvensional,
maka produk PCR dapat dideteksi dengan agarose gel electrophoresis dan
ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).
II.3. One-step RT-PCR vs. two-step RT-PCR
RT-PCR dapat dilakukan baik dalam dua langkah (two-step) atau satu
langkah (one-step). Dalam RT-PCR dua langkah (two-step), setiap langkah
dilakukan di bawah kondisi optimal. Sintesis cDNA pertama dilakukan di RT
bufer dan sepersepuluh dari reaksi akan dihapus oleh PCR. Dalam RT-PCR
satu langkah (one-step), RT dan PCR berlangsung berurutan dalam tabung
tunggal dalam kondisi yang dioptimalkan untuk kedua RT dan PCR.
Perbedaan antara kedua pendekatan terletak pada jumlah tabung
yang digunakan saat melakukan prosedur. Dalam pendekatan satu-langkah
(one-step), seluruh reaksi dari sintesis cDNA ke amplifikasi PCR terjadi dalam
tabung tunggal. Di sisi lain, reaksi dua-langkah (two-step) mensyaratkan
bahwa reaksi reverse transcriptase dan amplifikasi PCR dilakukan dalam
tabung terpisah. Pendekatan satu-langkah (one-step) diperkirakan untuk
meminimalkan variasi eksperimental yang berisi semua reaksi enzimatik
dalam lingkungan tunggal. Namun, pemulaan template RNA rentan terhadap
degradasi dalam pendekatan satu-langkah (one-step), dan penggunaan
pendekatan ini tidak dianjurkan bila tes diulang dari sampel yang sama.
Selain itu, pendekatan satu-langkah (one-step) dilaporkan kurang akurat
dibandingkan dengan pendekatan dua langkah (two-step). Pendekatan dua
langkah (two-step) juga merupakan metode yang disukai analisis ketika
menggunakan pewarna DNA seperti SYBR Green sejak penghapusan
primer-dimer dapat dicapai melalui perubahan sederhana dalam suhu
leleh. Kerugian dari pendekatan dua langkah adalah kerentanan terhadap
kontaminasi akibat penanganan sampel yang lebih sering.







II.4. Perbedaan PCR dan RT- PCR
PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi
genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu
tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai.
Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya
menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi
pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi dalam tabung
reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA
dapat langsung diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka
diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap
transkripsi balik. Dalam hal ini, metode yang digunakan disebut RT-PCR
(reverse-transcription PCR).











BAB III
KESIMPULAN
1. RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini
berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi
cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse
Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat
mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA.
2. RT-PCR meliputi tiga tahap utama antara lain :
a. Tahap reverse transcription
b. Tahap denaturasi pada suhu 95C
c. Amplifikasi PCR







DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2014. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. (Online).
(diakses tanggal 24 05 2014, http://
en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reacti
on).
Gaffar, S. 2007. Penggunaan PCR (Polimerase Chain Reaction) Untuk
Deteksi Retrovirus HTLV (Human T-Cell Lymphotropic Virus).
Universitas Padjadjaran. Bandung.
Santos C. F., Sakai V. T., Machado M. A., Schippers D. N., dan Greene A. S.
2004. Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction:
Principles and Applications In Dentistry. Journal Appl. Oral Science
2004; 12(1): 1-11.

Anda mungkin juga menyukai