GUIA PARA CLCULO DA CONCENTRAO DE ATIVIDADE ENZIMTICA

A concentrao de atividade enzimtica (U/mL) em uma amostra pode ser determinada a partir da velocidade da
reao catalisada pela enzima em anlise.
Antes de iniciar a explicao da estratgia usada neste clculo deve ser lembrado que por definio 1 unidade
(1U) de atividade enzimtica corresponde quantidade de enzima que catalisa uma reao com velocidade de
formao de 1 micromol de produto por minuto.
Nesta disciplina, propomos uma estratgia para avaliao da concentrao de atividade enzimtica que se baseia
na determinao da velocidade de uma reao atravs da quantificao de produto em diferentes tempos de
reao.
Nesta estratgia so preparados 4 tubos de ensaio idnticos contendo substrato e soluo com enzima. Os 4 tubos
so simultaneamente incubados a 30C e a reao interrompida em cada um dos tubos em tempos diferentes
atravs da desnaturao da enzima. Ao final, o produto da reao detectado atravs de espectrofotometria nos 4
tubos.
Os valores de absorbncia so convertidos em mols atravs de uma curva-padro apropriada para o produto
detectado. A partir dos dados de tempo de incubao versus mols de produto construdo um grfico, o qual
deve ser linear se o produto no estiver sendo esgotado ou a enzima no estiver se inativando durante o ensaio.
A inclinao da reta (por exemplo: mols/min) corresponde velocidade da reao e pode ser diretamente
convertida em unidades de atividade enzimtica. A concentrao de atividade enzimtica (U/mL) da amostra
calculada levando em considerao o volume de amostra utilizado em um tubo de ensaio e a diluio prvia
(antes da amostra ser adicionada em um dos 4 tubos de ensaio), segundo descrito no exemplo abaixo.

Exemplo:
tubo substrato amostra experimental tempo de incubao (min) absorbncia micromols de produto
1 0,1 mL 0,1 mL 5 0,1 0,5
2 0,1 mL 0,1 mL 10 0,2 1
3 0,1 mL 0,1 mL 15 0,3 1,5
4 0,1 mL 0,1 mL 20 0,4 2
y = 0,1x
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20
min
m
o
l
s
Suponha que antes de ser
adicionada nestes tubos de
ensaio esta amostra tenha sido
diluda 5x. Esta amostra contm
a enzima
Os valores de absorbncia
foram convertidos em micromols
utilizando-se uma curva padro
apropriada para o produto
formado nesta reao
Todos os quatro tubos foram
previamente preparados no gelo
e levados para o banho-maria a
30C simultaneamente. Aps 5
minutos a reao no tubo n 1
foi interrompida. A reao nos
demais tubos foi interrompida
nos tempos indicados.
Este grfico foi construdo
utilizando as colunas 4 e 6 da
tabela acima. A inclinao da
reta (coeficiente angular)
corresponde velocidade da
reao, ou seja, formam-se
0,1micromols de produto por
min.
A inclinao (0,1 micromols/min) a velocidade da reao e corresponde atividade enzimtica presente em cada um dos tubos. Note que a
obteno de uma reta indica que a velocidade igual em todos os tubos, independentemente do tempo de incubao. Logo, qualquer um dos
tubos contm a mesma quantidade de atividade enzimtica (0,1 U).
Sabendo que cada um dos tubos recebeu 0,1 mL de amostra com enzima, conclui-se que a soluo inicial contendo a enzima apresenta a
concentrao de 1U/mL (0,1 U / 0,1 mL).
Um erro comum considerar que 0,1 U de enzima est presente na somatria dos 4 tubos simplesmente porque foram usados 4 tubos no
ensaio.
Supondo que antes de ser adicionada em cada um dos tubos de ensaio a soluo contendo enzima foi diluda 5 vezes (1:4), conclui-se que a
soluo original continha 5U/mL (1 U/mL x 5).