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Nutrio e cultivo microbiano

Como estudar microrganismos no laboratrio???


Cultivo in vitro
conhecer as exigncias nutricionais e ambientais dos m.o.
NUTRIO MICROBIANA
fornecimento de nutrientes para a sntese de macromolculas
essenciais e para a obteno de energia
ANABOLISMO
CATABOLISMO
METABOLISMO
EXIGNCIAS NUTRICIONAIS : Grande diversidade
GUA : sem ela no h vida
essencial para os microrganismos: absoro nutrientes dissolvidos
disponibilidade varivel no ambiente
Se ambiente possui < concentrao de gua: clula aumenta
concentrao de solutos internos (bombeamento de ons para o interior
celular ou pela sntese de solutos orgnicos)
Os elementos qumicos fundamentais
C, N, H, O, S, P, K, Ca, Mg, Fe
1. CARBONO
todos os organismos requerem alguma forma de carbono
esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgnicos : lipdeos,
carboidratos e protenas: fornecem energia para o crescimento e servem
como unidade bsica para biossntese
heterotrficos utilizam compostos orgnicos como fonte de carbono
autotrficos utilizam o CO
2
como fonte de carbono
2. NITROGNIO
todos os organismos necessitam em alguma forma
parte essencial dos aminocidos (protenas) e cidos nuclicos
bactrias so mais versteis para N que eucariotos
podem utilizar o N
2
(fixao biolgica), nitratos, nitritos e sais de amnia
em geral compostos nitrognio orgnico: aminocidos e peptdeos
3. HIDROGNIO, OXIGNIO, ENXOFRE E FSFORO
essenciais a todos os organismos
S necessrio na biossntese de cistena, cistina, metionina e de
vitaminas (tiamina e biotina)
P essencial para a sntese de cidos nuclicos e ATP
sais inorgnicos (sulfatos e fosfatos) podem ser utilizados para suprir
estes elementos
tambm presentes em fontes proticas (aa), DNA e RNA
alguns destes elementos so encontrados na gua ou na atmosfera
4. POTSSIO, MAGNSIO, CLCIO, FERRO (minerais essenciais)
K, Mg cofatores enzimtico
Ca estabilizao parede celular e formao de endosporos
Fe faz parte dos citocromos, e protenas transporte eltrons
C, H, O, N, S, P macronutrientes (g/L)
Fe, Mg, Ca, K, Na metais / minerais essenciais (mg/L)
5. MICRONUTRIENTES OU ELEMENTOS TRAO:
Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr
necessrios em concentrao muito baixa (g/L)
cofatores de enzimas
geralmente no preciso adicionar: presentes na gua
se gua desmineralizada: adicionar soluo elementos trao
6. FATORES DE CRESCIMENTO:
compostos orgnicos: vitaminas, aminocidos, purinas e pirimidinas
muitas vitaminas (tiamina, biotina, cobalamina) atuam como coenzimas
alguns m.o. no sintetizam os fatores que devem ser disponveis no meio
Classificao nutricional dos microrganismos
Quanto a fonte de Carbono:
- autotrfico: CO
2
- heterotrfico: carbono orgnico
Quanto a fonte de energia:
- fototrficos: luz
- quimiotrficos: oxidao compostos qumicos
orgnicos: quimiorganotrficos
inorgnicos: quimiolitotrficos
Classificao Nutricional dos Organismos
Grupo Nutricional
Fonte de
Carbono
Fonte de Energia Exemplos
Quimioautotrficos
Quimiolitotrfico
CO
2
compostos
inorgnicos
bactrias
nitrificantes
do Fe, H e S
Quimioheterotrficos
Quimioorganotrficos
compostos
orgnicos
compostos
orgnicos
bactrias, fungos,
protozorios e
animais
Fotoautotrficos
CO
2
luz
bactrias
sulfurosas,ciano
bactrias, algas,
plantas
Fotoheterotrficos
compostos
orgnicos
luz
bactrias
prpuras e
verdes no
enxofradas
MEIO DE CULTURA: preparao contendo os nutrientes necessrios
para cultivar e manter microrganismos viveis em laboratrio.
Duas grandes classes de meios de cultura:
Meio definido ou sinttico: composio qumica exata conhecida
Meio complexo: composio qumica exata no conhecida
(composto por extratos naturais de carne, levedo, protenas hidrolisadas)
Meio de Cultura Sinttico
Glicose 10 g/l
NH
4
Cl 0,5 g/l
Na
2
HPO
4
0,21 g/l
NaH
2
PO
4
0,09 g/l
MgSO
4
.7H
2
O 0,2 g/l
KCl 0,04 g/l
CaCl
2
0,015 g/l
FeSO
4
.7H
2
O 0,01 g/l
gua p/ 1 L
pH final 6.8
Meio complexo
Peptona 10 g/l
Extrato de levedura 5 g/l
NaCl 5 g/l
Completar com gua p/ 1 L
pH final 7,0
L. mesenteroides: bactria fastidiosa
muito exigente em termos nutricionais
Substratos para meios complexos:
Extrato de Carne: extrato aquoso de tecido muscular, concentrado sob
a forma de pasta, contm carboidratos, N orgnico, vitaminas
hidrossolveis e sais.
Peptona: produto da digesto da carne (enzimtica ou cida), fonte de
N orgnico e vitaminas.
Triptona: hidrolisado pancretico de carne , rica em nitrognio-amnico;
destinado ao isolamento de organismos de difcil crescimento.
Extrato de Levedura: extrato aquoso de clulas de leveduras lisadas,
fonte excelente de substncias estimulantes do crescimento como
vitamina complexo B; contm compostos orgnicos de N e C.
Extrato de malte: extrato aquoso de cevada malteada. Rica em
carboidratos, contm material nitrogenado, vitaminas e sais minerais.
Tripticase: peptona derivada da casena por digesto pancretica, fonte
rica em nitrognio de aminocidos.
Meios complexos so altamente nutritivos
geralmente mais fceis de preparar
so os mais usados ( composio exata no necessria)
mais adequados para fastidiosos
Quanto ao estado fsico os meios podem ser:
a) lquidos: (caldos) nutrientes so dissolvidos em gua e esterilizados
b) slidos: so preparados a partir da adio, ao meio lquido de um agente
solidificante, antes da esterilizao do meio.
gar-gar: polissacardeo obtido de algas marinhas . Usado como agente
solidificante dos meios. Funde a 100C e gelifica q uando a temperatura
menor de 45C. Concentrao 1,5 - 2% p/v. No serve como nutriente!!!!
c) semi-slidos: obtido atravs da adio de uma quantidade reduzida de
agente solidificante (0,3 a 0,5% de gar)
Meios lquidos: multiplicao celular ; processos industriais em reatores
Meios slidos: usados para imobilizao de m.o. em placas ou tubos
aparecimento de massas celulares: colnias
Colnia: originada da multiplicao de m.o. em meio slido
importante para a caracterizao dos m.o.
para colnia ser visvel : 1 x 10
6
clulas
so isolados em meios slido visando obteno de culturas puras
Cultura pura: contm um nico tipo de m.o. sem contaminantes
Numero de colnias obtidas a partir de uma amostra:
Contagem de microrganismos controle de qualidade
Contagem de microrganismos viveis presentes
Unidades formadoras de colnias: UFC por mL ou g
Colnias microbianas
Placas resultantes de isolamento microrganismos
Obteno culturas puras: isolamento de colnias
Tcnica de esgotamento: diluio para obteno de colnias isoladas
Meios com finalidades especiais
1. Meios Seletivos: permitem crescimento de um tipo particular de
microrganismo suprimindo o desenvolvimento de outros
gar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentrao de glicose (seletivo para
fungos)
gar verde brilhante: seletivo para enterobactrias Gram - (Salmonella) ; o
corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactrias Gram + do TI
Adio de antibiticos: seletivos para os m.o. resistentes estes agentes
antimicrobianos
gar Sabouraud
Peptona (fonte de C e N) .......... .....10 g
Glicose (fonte C e energia) ............40 g
gar (agente solidificante) ..............15 g
gua ...........................................1000 mL
pH 5,6
2. Meios diferenciais : permitem a distino entre diferentes grupos de m.o.
Produo de enzimas: adio substrato e verificao halo hidrlise
Hemlise em gar sangue: Streptococcus e Staphylococcus hemolticos
3. Meios Seletivos/Diferenciais : agem como seletivos e diferenciais
muito teis no diagnstico de patognicos (coliformes fecais)
Ex: gar MacConkey - contm sais biliares e corante cristal violeta, que
inibem o crescimento de Gram + e permitem o desenvolvimento de Gram -
e ainda lactose e o indicador vermelho neutro, que distingue as Gram
negativas produtoras de cido (vermelhas) das Gram negativas no
produtoras de cido (amarelas) identificao de coliformes
E. coli em MacConkey
4. Meios de Enriquecimento: usados para selecionar microrganismo presente
em pequenas quantidades em relao populao de um ambiente.
favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das
outras espcies presentes em uma populao mista
Ex: isolamento de bactrias que oxidam o fenol - podem ser isoladas de
amostras do solo, utilizando meio de enriquecimento, contendo sais de
amnia, e fenol como nica fonte de carbono e energia
somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estaro presente
em grande nmero depois de vrios cultivos
5. Meios de Estocagem : utilizado para a manuteno da viabilidade e das
caractersticas fisiolgicas de uma cultura
meio diferente do timo para o crescimento - desenvolvimento rpido:
morte rpida
a glicose favorece o crescimento, prefervel omiti-la na preparao de um
meio de estocagem.
Conservao das Culturas Puras
microrganismos isolados em cultura pura devem ser mantidos viveis
Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas
em geladeira (4-10C) em tubos de ensaio com meio d e estocagem
Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas em
nitrognio lquido (-196C) ou em ultrafreezers (-7 0 a -120C), ou ainda
liofilizadas (mais comum).
Mtodos de conservao de microrganismos:
- transferncia peridica para meios novos
- sob camada de leo mineral
- liofilizao
- ultracongelamento
Coleo de culturas:
mantm banco de culturas puras de microrganismos
fornecem microrganismos na forma liofilizada
tempo viabilidade muito longo (pode chegar a 100 anos)
ATCC (americana)
Fiocruz (Brasil)
Liofilizao de microrganismos
Fatores fsicos que influenciam o crescimento:
1. TEMPERATURA
2. pH
3. PRESSO OSMTICA
4. ATMOSFERA GASOSA
EXIGNCIAS AMBIENTAIS PARA CULTIVO DE MICRORGANISMOS
1. TEMPERATURA:
Um dos principais fatores que influenciam o desenvolvimento microbiano
aumento de T: acelera as reaes na clula e aumenta taxa crescimento
a partir de certa T : desnaturao de protenas e AN : morte celular
Temperaturas de crescimento: temperaturas cardeais
Temperatura mnima: menor T que m.o. capaz de crescer
Temperatura tima: aquela que m.o. apresenta melhor crescimento
Temperatura mxima: maior T onde ainda possvel o crescimento
Relao entre a taxa de crescimento e a temperatura de cultivo
Classes de microrganismos de acordo com a temperatura
1) Psicrfilos: crescem em baixas temperaturas (0 - 20C tima 15C)
2) Mesfilos: crescem em temperaturas moderadas (12-45C tima 37C)
3) Termfilos: crescem em temperaturas elevadas (42 - 68C tima 62C)
4) Hipertermfilos: crescem temp. muito elevadas (80-113C tima 105C)
Psicrotrficos ou psicrotolerantes:
temperatura tima 20 a 30 C
mas so capazes de crescer em temperatura de refrigerao (4C)
Envolvidos na deteriorao de alimentos refrigerados e congelados
Tb patgenos de alimentos: Listeria monocytogenes
Crescimento a baixas temperaturas: mares polares, geleiras
Psicrfilos possuem membrana rica em AG insaturados: maior fluidez
enzimas possuem maior quantidade de estruturas secundrias
2. pH:
pH timo: valor mediano de variao de pH onde ocorre crescimento
para o melhor crescimento do microrganismo num meio cido ou bsico,
ele deve ser capaz de manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, no
importando qual o valor do pH externo
para manter o pH interno , a clula expulsa ou absorve ons hidrognio
variaes de pH podem ser letais por isto adiciona-se tampo ao meio
Bactrias: geralmente pH timo prximo da neutralidade
- Bactrias acidfilas: alta tolerncia acidez (Thiobacillus pH timo 2- 3,5)
- Bactrias alcaliflicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 11).
Fungos - tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).
3. PRESSO OSMTICA:
Os microrganismos retiram da gua a maioria dos nutrientes solveis
(contedo celular 80 90 % de gua)
Presso Osmtica - fora com a qual a gua se move atravs da
membrana citoplasmtica a partir de uma soluo de baixa concentrao
de soluto para uma contendo alta concentrao de soluto.
As clulas podem estar em um meio:
a) Isotnico - onde a concentrao de solutos em um meio igual quela
no interior da clula. No h movimento de gua para dentro e para fora
da clula
b) Hipertnico - concentrao de solutos fora da clula maior que no
interior. A gua flui para fora da clula resultando na desidratao e
contrao da clula - plasmlise
c) Hipotnico - a concentrao de soluto no interior da clula maior que
fora dela. A gua flui para dentro da clula: pode inchar (turgescncia) e
se romper (plasmoptise ou lise osmtica).
Em relao a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem ser
No Halfilos: no necessitam de sal e no toleram a presena no meio.
Halotolerantes: no necessitam de sal mas toleram a presena no meio.
Halfilos: necessitam de sal em uma concentrao moderada
Halfilos extremos: necessitam de sal em altas concentraes.
Os efeitos osmticos so de maior importncia em ambientes salinos
4. ATMOSFERA GASOSA
O
2
e CO
2
, so os gases principais que afetam o crescimento dos m.o.
- De acordo com resposta ao O
2
os microrganismos so classificados em:
AERBIOS
- Estritos (obrigatrios): necessitam de O
2
- Facultativos: no necessitam de O
2
mas crescem melhor na sua presena
- Microaerfilo: necessitam de O
2
em nveis menores que atmosfera
ANAERBIOS
- Aerotolerantes: no necessitam de O
2
mas podem tolerar sua presena
- Estritos (obrigados): no toleram O
2
(letal)
Classificao dos microrganismos de acordo com atmosfera gasosa
a) Aerbio estrito
b) Anaerbio estrito
c) Facultativos
d) Microaeroflicos
e) Aerotolerantes
Aerbios estritos:
requerem O
2
para crescimento (padro atmosfera 21% de O
2
)
aerbios podem crescer mais lentamente quando o O
2
limitado
Se m.o. crescem em meio lquido podem rapidamente utilizam O
2
dissolvido na camada superficial do meio
ento as culturas lquidas de m.o. aerbios so agitadas (shaker) para
aumentar o suprimento de O
2
dissolvido e favorecer o crescimento celular
Facultativos:
crescem na presena de O
2
ou podem crescer em anaerobiose
quando em condies de anaerobiose, obtm energia pelo processo
metablico chamado fermentao. Ex. Escherichia coli, Saccharomyces
cerevisiae
Anaerbios
aqueles que podem ser mortos pelo oxignio
no utilizam o O
2
para reaes de produo de energia
alguns podem tolerar presena de oxignio
Clostridium perfringens - altamente tolerantes ao O
2
Clostridium tetani - moderadamente tolerantes ao O
2
Methanobacterium - anaerbios estritos
Por que alguns microrganismos no toleram O
2
?????
ou
Por que alguns microrganismos toleram O
2
??????
Espcies reativas de oxignio txicas as clulas
clulas devem ser capazes de se proteger contra estas espcies reativas para
manter sua integridade
O
2
poderoso agente oxidante e excelente aceptor de eltrons na respirao
Processos celulares geram formas reativas de O
2
Espcies reativas so oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares
Enzimas que destroem formas txicas de oxignio
Superxido dismutase (SDO) e catalase so as enzimas mais importantes
Presena de catalase varivel
Aerbios, facultativos, microaeroflicos e aerotolerantes possuem SDO
Anaerbios estritos no possuem esta enzima
So muito sensveis a presena de espcies reativas de O
2
Teste de catalase
Como cultivar microrganismos anaerbios ???
As condies de anaerobiose podem ser conseguidas:
a) uso de agentes redutores nos meios de cultura
Ex: tioglicolato de sdio, que reage com oxignio, formando gua
b) remoo mecnica do oxignio, sendo substitudo por nitrognio e
CO
2
;
c) uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) que gera
hidrognio e CO
2
com um catalisador de paldio
d) uso de cmaras anaerbicas
O envelope contm borohidreto de sdio e bicarbonato de sdio e a
adio de gua gera H
2
e CO
2
Jarra fechada e O
2
presente removido por reao com o H
2
catalisada pelo paldio formando gua
Cmara de anaerobiose