1

Modulao da funo
cardiovascular pelo
Nitroxilo
Prova de Valorizao Complementar

Emmanuel Neves

Orientador: Dr. Ricardo Ladeiras
Abril de 2013
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Fisiologia II
2

Resumo
Os derivados do xido Ntrico (NO) suscitam grande interesse cientfico e durante os
ltimos anos surgiu muita evidncia cientfica relacionada com a modulao da funo
cardiovascular pelo nitroxilo (HNO), que conferem interesse redobrado nesta substncia.
Esta uma reviso elaborada com recurso a artigos cientficos que se debruam sobre o
mecanismo de aco do HNO e o seu efeito no sistema cardiovascular, salientando-se o seu
efeito inotrpico positivo e possvel utilizao na teraputica da insuficincia cardaca.
Os efeitos do HNO sobre o sistema cardiovascular so vrios, desde os efeitos
vasodilatador e anti-plaquetrio at aos efeitos inotrpico e lusitrpico positivos, passando pelo
efeito anti-hipertrfico. Esta aco e a sua relao com a insuficincia cardaca sugerem que
novos estudos devero explorar o papel do HNO na teraputica desta patologia.


Introduo
Desde o surgimento de evidncias da produo endgena de xido Ntrico (NO) em
mamferos, h cerca de 30 anos atrs [1] que o papel do NO e espcies azotadas/nitrogenadas
dele derivadas na fisiologia e fisiopatologia humanas recebeu intensa ateno por parte de
investigadores e da comunidade mdica. A grande parte da pesquisa tem sido efectuada em
espcies que so derivados oxidados do NO, como por exemplo o Peroxinitrito (ONOO-),
Dixido de Azoto (NO2), Trixido de Diazoto (N2O3) e o Nitrito (NO2-). A profusa
investigao neste campo poder estar relacionada, por um lado, com a facilidade com a qual o
NO oxidado em sistemas aerbicos e, por outro, com a toxicidade dos fortes oxidantes
resultantes.[2]
Recentemente, alguns estudos que descreveram o efeito biolgico e farmacolgico
singular do Nitroxilo (HNO, nitroxyl ou nitrosyl hydride) no sistema cardiovascular[3-8],
despoletaram um interesse aumentado neste parente do NO reduzido em apenas 1 electro.[2, 9,
10]
O objectivo deste trabalho descrever o efeito do HNO no sistema cardiovascular no
que diz respeito, particularmente, ao inotropismo cardaco e, com isso, inferir acerca da sua
possvel utilizao teraputica.[11]




3

Qumica bsica do HNO
Os relatos mais antigos referentes ao comportamento cido-base do HNO indicaram que
era um cido razoavelmente forte (pKa 4,7). Posto isto, pensava-se que a espcie predominante
a pH fisiolgico era o anio correspondente, NO-. Contudo, estudos mais recentes mostraram
que o HNO , na verdade, um cido fraco (pKa > 11), sugerindo que o HNO a espcie quase
exclusiva a pH fisiolgico.[12]
O HNO, como foi referido na introduo, a forma reduzida em 1 electro do NO e
pode ser produzido desta maneira. (Equao 1) O potencial de reduo do NO a HNO foi
determinado como sendo menor que -0,4V.[12] Assim sendo, a probabilidade de o HNO ser
formado a partir da reduo directa do NO por um electro, sob condies biolgicas, baixa.
[2]


Uma das mais prevalentes reaces do HNO a sua dimerizao, com a formao de
cido hiponitroso (H2N2O2), que se decompe para formar xido Nitroso (N2O) e gua.[2]
(Equao 2) A constante de segunda ordem desta reaco elevada [12], o que dificulta o
trabalho com o HNO, motivo pelo qual se recorrem a dadores de HNO. [2]

Um outro aspecto importante acerca das propriedades do HNO a sua neutralidade.
Tratando-se de uma pequena e neutra molcula, o HNO dever ser capaz de atravessar
livremente as membranas celulares, o que poder ter importncia biolgica. [12]
O HNO parece ser bastante reactivo perante os grupos tiol (SH) de aminocidos e
protenas.[13, 14] A reaco do HNO com um grupo tiol produz inicialmente uma N-
hidroxisulfinamida. A N-hidroxisulfinamida pode depois reagir com outro grupo tiol excedente
(ou um grupo tiol de uma protena na vizinhana) para produzir disulfide (ligao dissulfido) e
hydroxylamine. [15] Competindo com esta ltima reaco, est outra pela qual a N-
hidroxisulfinamida sofre um rearranjo para formar sulfinamida. [15] (Fig. 1) O futuro da
associao entre HNO e o grupo tiol pode depender do destino do aducto intermedirio. Se a N-
hidroxisulfinamida reagir com um segundo tiol, o produto dissulfido pode ser convertido de
Equao 1 - Reduo do NO por um electro, com obteno de HNO.
Equao 2 - Dimerizao do HNO.
4

volta ao tiol inicial em condies biolgicas. Esta via levaria a modificao reversvel da
estrutura e funo do grupo tiol, por parte do HNO. Em contraste, espera-se que a isomerizao
da N-hidroxisulfinamida a sulfinamida leve a uma modificao irreversvel do grupo tiol. [2]
Existem actualmente estudos que apontam para uma possvel reversibilidade destas reaces,
sob condies muito especficas.[16] Ainda assim, o papel sinalizador da sulfinamida
permanece por determinar. [2]
Posto isto, presume-se que o efeito das modificaes sobre os grupos tiol
provavelmente dependente da identidade do tiol e do meio envolvente. [2] aqui que importa
introduzir o conceito de redox switch. Este consiste em dois resduos de cistena sensveis ao
ambiente redox e na ligao dissulfido entre eles. [17] A oxidao das cistenas para formar a
ligao dissulfido influenciada pelo pH e temperatura, reflectindo mais uma vez a influncia
do meio. As ligaes dissulfido indutoras de alteraes conformacionais e/ou funcionais, podem
ser revertidas por factores redutores celulares pertencentes aos sistemas da Tioredoxina (Trx) e
da Glutationa reduzida (GSH). [17]
Tendo isto em conta, compreende-se que o mecanismo de aco do HNO possa, sob
determinadas condies, ter significado funcional.
Dada a concentrao de GSH no compartimento intracelular, seria de esperar que um
dos principais alvos de aco do HNO seria mesmo este, resultando num scavenging do HNO.
De facto, elevados nveis de HNO podem reduzir quase por completo os nveis de GSH
intracelular. [18] No entanto, o que se verifica que a aco do HNO no depende s da
concentrao intracelular de GSH, mas tambm da localizao intracelular do tiol-alvo e do pKa
deste. Um bom exemplo a inibio da Desidrognase do Gliceraldedo-3-Fosfato (presente no
citoplasma), por parte do HNO, sem alterao significativa do estado redox da GSH e, portanto,
do estado redox celular.[19] Isto pode ser explicado pela alta reactividade (baixo pKa) de um
resduo de cistena da GADPH.[19]
Assim sendo, provvel que o pKa de uma dada cistena e a localizao do alvo
intracelular, compartimentalizem a actuao do HNO, conferindo-lhe especificidade de aco.
[2, 9]
Para alm da interaco com os grupos tiol, o HNO tem tambm como alvo metais de
elevado estado de oxidao [Fe(III), Cu(II) e Mn(III)], em metaloprotenas. [14, 20]



5

Evidncia de produo de HNO
A formao endgena de HNO permanece especulativa. [10] Foram debatidas vias que
so ou dependentes ou independentes da Sntase do Oxido Ntrico (NOS). Esta funciona atravs
da converso da L-arginina a

e L-citrulina, consumindo O2 no processo e NADPH,

utilizando como cofactor a tetrahidrobioterpina (BH4). No entanto, este processo tambm
produz o intermedirio

-hydroxy-L-arginine (NOHA), na oxidao da arginina, assim como

perxido e superxido, quando est no estado desacoplado (induzido quer pela ausncia de
arginina quer pela de BH4). Um possvel mecanismo para a produo de HNO atravs da
oxidao directa da NOHA pela NOS desacoplada. O HNO tambm pode ser produzido pela
catlise da arginina a citrulina, na ausncia de BH4.[21, 22]
Estas eram possveis vias dependentes da NOS. Como vias independentes existem a
decomposio dos nitrosothiols [15], a dismutao do

a nitrosonium (NO+) e HNO [23] a

reduo do

pela enzima xantina oxdase [24], pelo ubiquinol [25], citocromo C [26] e
dismtase do superxido de Mangansio. [27]
Uma outra via ocorre atravs da oxidao da hydroxylamine (NH2OH), mediada por
grupos heme, na presena de perxido. [28]
Particularmente interessante a sugesto de que o HNO pode ser gerado por um
mecanismo envolvendo a interaco entre o H2S (cido Sulfdrico) e o

. Isto baseia-se na
observao de que quando um dador de H2S (NaHS) combinado com um dador de

(nitroprussiato) em micitos ventriculares isolados de rato, a contraco celular aumentada de
um modo semelhante ao modo de actuao do HNO. [29] Mais recentemente foi provado que a
reaco entre SNP (nitroprussiato de sdio) e H2S produz efectivamente, como anteriormente
especulado, HNO. [30]
Estas concluses baseiam-se no facto de a conjugao do H2S com o SNP produzir
fluorescncia do detector de HNO CuBOT1 [31-33] quando os reagentes, em separado, no
produzem.[30] Por outro lado, sabe-se que um outro marcador da aco do HNO o CGRP
(calcitonin gene-related peptide) [7]. Na mesma experincia, os investigadores descobriram que
a conjugao do H2S com o SNP fez aumentar significativamente a libertao de CGRP quando
a administrao de H2S apenas no teve efeito e a de SNP produziu apenas um pequeno
aumento no CGRP. Estes dois factores confirmam a formao de HNO a partir de H2S e SNP.
Estes dados so indicadores de um mecanismo que no tinha sido descrito previamente, com
caractersticas fisiolgicas importantes, nomeadamente a ocorrncia a pH de 7,4. [30]

6

Dadores de HNO
Pelo facto de a sua reaco de dimerizao ser extremamente favorvel, o seu
armazenamento dificilmente ocorre. [2, 12] Posto isto, os investigadores recorrem a dadores de
HNO. O dador de HNO mais usado em investigao e o que conhecido h mais tempo o Sal
de Angeli (Angelis salt). Outro dador bastante conhecido o cido de Piloty (Pilotys acid).
[34] A grande maioria da investigao sobre HNO foi feita com recurso a estes dois compostos.
[34] Como desvantagens do primeiro contam-se a rpida decomposio e libertao de HNO e a
produo acessria de Nitrito (NO2-) ao passo que, como desvantagem do segundo salienta-se o
facto de s libertar HNO a elevado pH. [34, 35]
Estas desvantagens impulsionaram a investigao de novos dadores de HNO, com
alguns resultados promissores. Um dos recentes dadores de HNO o 1-Nitrosocyclohexyl
Acetate (NCA). Este composto apresenta um maior tempo de hidrlise a pH neutro, comparado
com o Sal de Angeli e cido de Piloty, produzindo uma concentrao constante de HNO
durante horas. Para alm disso, produz mnimas quantidades totais de NO e de nitrato/nitrito
(factores que podem causar efeitos inespecficos). [36]

Efeitos cardiovasculares do HNO
Por se tratar de um sistema, abordar os efeitos do HNO na funo cardiovascular sem
referir tambm o efeito inotrpico parecer incorrecto. No entanto, sendo esse o tpico
principal, ser abordado mais frente.
Estudos [36, 37] comprovaram que o HNO, semelhana do NO, inibe a agregao
plaquetria. Num desses estudos[37], a adio de Cistena reduziu o efeito anti-agregante
produzido pelo Sal de Angeli. Daqui se poder inferir um possvel processo de scavenging de
HNO, por parte de uma quantidade extra de Cistena. No outro [36], o NCA reduziu a aco
agregante produzida por um anlogo do Tromboxano A2, o U-46619. (Fig. 2)
Por outro lado, o HNO pode actuar (em leveduras) como antioxidante atravs da doao
de um tomo de hidrognio a radicais oxidantes, com a subsequente gerao de

[38] Para
alm disso, pode tambm actuar como antioxidante na vasculatura.[39] Estes resultados, em
conjunto com os de estudos que sugerem que o HNO induz a expresso do mRNA da heme-
oxignase-1 [40] (esta tem um papel na oposio ao dano endotelial, aterognese e oxidao de
lipoprotenas de baixa densidade [41]), sugerem um papel do HNO como antioxidante.
Para alm disso, h tambm estudos que sugerem um papel anti-hipertrfico do
HNO[42, 43]. O primeiro a comprov-lo [42] refere que na base do efeito anti-hipertrfico est
7

a supresso, dependente do cGMP, da NADPH oxdase dos cardiomicitos. (Fig. 3)

Os primeiros relatos do efeito vasodilatador (em aorta de coelho e artrias
intrapulmonares de bovino) do HNO foram efectuados h j alguns anos. [44] O mecanismo
proposto era dependente da guanil-cclase, o que levou a inferir uma relao do HNO com o
factor de relaxamento derivado do endotlio (NO). [44] Mais recentemente foi proposto que o
HNO tambm exercia efeito vasodilatador nas artrias coronrias de rato, via libertao de
CGRP (calcitonin gene-related peptide) e activao de canais de potssio dependentes de ATP,
como consequncia da aco da guanil-cclase solvel (sGC). [45] A estas aces junta-se a
activao de canais de potssio dependentes de voltagem no msculo liso de pequenas artrias
mesentricas de rato [46, 47]. Sobre este aspecto, provou-se que o HNO hiperpolariza as VSMC
(vascular smooth muscle cells) a partir do repouso e que repolariza vasos pr-contrados e
despolarizados.[47] Permanece por determinar se a activao dos canais de potssio
dependentes de voltagem directa ou indirecta, por aco da sGC. [36]
Particularmente interessantes so as concluses de estudos que referem que em aortas isoladas
de rato e ratinho, os dadores de HNO no desenvolvem tolerncia [48] e que as suas aces
relaxadoras se mantm, mesmo em quadros de leso vascular e hipertenso induzidos pela
diabetes [49] , angiotensina II [50] e aterosclerose [36].
Os mecanismos descritos e a hipottica produo endgena de HNO (via eNOS
desacoplada, por exemplo) permitiram propor para o HNO um papel como factor de
hiperpolarizao derivado do endotlio.[51]

Papel do HNO na modulao do inotropismo cardaco
Um dos primeiros estudos a referir o efeito inotrpico positivo do HNO data de 2001.
[7] Nesse mesmo estudo, a administrao de Sal de Angeli (SA) em ces conscientes teve como
consequncia um aumento da contractilidade do ventrculo esquerdo e reduziu,
concomitantemente, a pr-carga e a presso diastlica devido a um efeito venodilatador, sem
mudana na resistncia arterial. (Fig. 4) A administrao de cistena inibiu o efeito do SA,
sugerindo um processo de scavenging, estando de acordo com os relatos de que a aco do
HNO sensvel ao ambiente redox. Para alm disso, o efeito inotrpico positivo do SA foi
atribudo libertao de CGRP, dado que o inotropismo (mas no o efeito vasodilatador) foi
abolido na presena de antagonistas do receptor do CGRP, sugerindo um mecanismo diferencial
para a actuao do HNO ao nvel do corao e para a actuao a nvel vascular. Outro dos dados
importantes deste estudo foi a manuteno dos nveis de cGMP, ao contrrio do que foi obtido
8

com administrao de um dador de NO, que causou o aumento dos nveis plasmticos de
cGMP. Este resultado em particular sugere que as aces cardacas do HNO podem ser
independentes do cGMP, ao contrrio do que acontece a nvel vascular. tambm de referir que
se verificou que o efeito inotrpico positivo se mantinha em coraes com Insuficincia
Cardaca.[6] (Fig. 5)
No seguimento deste estudo, outro estudo dos mesmos autores comprovou que a aco
do HNO era independente da estimulao beta-adrenrgica, como se comprovou pela
manuteno do efeito inotrpico positivo e vasodilatador aquando da administrao de
propranolol. [6] Mais tarde descobriu-se que a aco inotrpica positiva do CGRP atribuvel
estimulao simptica do miocrdio.[52] Posto isto, o mecanismo de actuao do HNO a nvel
cardaco permanecia por desvendar.
Em estudos mais recentes, comprovou-se que o efeito inotrpico positivo do HNO no
era mediado por uma via de sinalizao dependente do cAMP. Isto baseia-se na manuteno do
inotropismo positivo aquando da aplicao de inibidores da protena cnase A (PKA) e no facto
de o sinal do cAMP pela tcnica de FRET no se alterar com a aplicao de dadores de HNO.
[8] De modo semelhante, a administrao de inibidores da sGC no teve impacto no
inotropismo positivo causado pelo HNO, o mesmo se verificando com a administrao de
inibidores da PKG. [8] (Fig. 6)
Algumas destas concluses e o conhecimento de que os resduos tiol de determinadas
protenas so alvo do HNO, impulsionaram a investigao dos efeitos deste sobre protenas
fundamentais na regulao do ciclo do Clcio dos cardiomicitos e sobre os miofilamentos.
O aumento do contedo intracelular de resduos tiol para provocar uma hipottica
reaco com o HNO antes mesmo de este reagir com protenas estratgicas, conjugado com uma
subsequente atenuao do seu efeito inotrpico positivo foram dados apoiadores desta
hiptese.[8] (Fig. 6)
No mesmo estudo [8], os autores comprovaram que o HNO tem efeito sobre o receptor
rianodnico dos cardiomicitos (RyR2), aumentando a sua probabilidade de abertura (open
probability), sem alterar a sua condutncia unitria. No menos importante o facto de esta
aco ser reversvel aquando da administrao de equivalentes redutores, sugerindo uma
competio entre os resduos tiol livres (da GSH) e os resduos das protenas crticas no ciclo do
Clcio. Para alm disso, a descoberta de que o aumento da fraco libertada de Clcio a partir
do Retculo Sarcoplasmtico era acompanhado de uma tambm aumentada entrada para o
mesmo compartimento, sem variao significativa da quantidade total de Clcio intracelular,
levou a supor um efeito sobre a SERCAa2. (Fig. 7) Contudo, uma das grandes limitaes deste
9

estudo foi no ter considerado o efeito acoplado da corrente de Clcio sobre a libertao deste a
partir do RS, nem se a mesma era afectada pelo HNO.
No entanto, veio a ser comprovado pelo mesmo grupo de investigadores que a aco
inotrpica positiva do HNO no depende da corrente de Clcio extracelular e que este actua
apenas no ciclo de entrada e sada do Clcio do RS. [53] Neste mesmo estudo, a inibio da
funo do RS aboliu por completo os efeitos positivos do HNO no transiente de Clcio sistlico.
A confirmar a hiptese levantada sobre o efeito do HNO na actividade da SERCAa2
esto dois importantes trabalhos. [5, 54] Um deles [5] aponta um efeito directo do HNO sobre a
SERCA2a. Os investigadores referem que este efeito se deve a uma modificao oxidativa
reversvel de um resduo de tiol, comprovada pela ausncia de efeito sobre a actividade da
SERCA aquando da administrao de DTT (dithiothreitol), um scavenger do HNO. A
reversibilidade est, de resto, em concordncia com anteriores observaes do efeito do HNO
sobre o corao.[8] Posto isto, os autores determinaram que a modificao induzida pelo HNO
se dava por S-glutatiolao (S-glutathiolation) da cistena 674 da SERCA2a. A comprovar isto
est a ausncia do efeito (nem inotrpico nem lusitrpico) caracterstico do HNO, quando um
composto (iodoacetamida) se liga a essa mesma cistena, ou quando existe glutaredoxina-1
(GRX) no meio. O mecanismo pelo qual o HNO causa a glutatiolao da cistena 674
permanece por explicar [5], mas os autores propuseram que o HNO poderia actuar pela
formao de um intermedirio N-hidroxisulfinamida, seguido de uma reaco com um tiol da
GSH.[2] (Fig. 1) A demonstrao de que a SERCA no era activada pelo HNO na ausncia de
Fosfolambam (PLN) [55] levou os autores a admitir que a aco do HNO sobre a SERCA
poder no ser apenas directa, mas tambm indirecta, via PLN.
O outro estudo [54] demonstrou que, na presena de PLN, o HNO fez descrescer a
mobilidade da SERCA2a, aumentando os contactos oligomricos preferenciais entre as
unidades da SERCA2a, tendo isto levado a uma afinidade aumentada para o Clcio e a uma
eficincia cataltica da ATPase. Na ausncia de PLN, as clulas no apresentaram
contractilidade mediada pelo HNO e a amplitude do transiente de Clcio estava tambm
diminuda, assim como a sua libertao do RS. Por outro lado, o HNO acelerou a entrada de
Clcio em clulas cujos RS estavam preservados, mas no teve efeito naquelas que eram knock-
out para o PLN.
Os autores atribuem como explicao para o sucedido o desacoplamento do PLN da SERCA2a,
por parte do HNO, atravs da modificao dos resduos de cistena 41 e 46 do PLN, dado que o
efeito podia ser abolido aquando da substituio destes dois resduos por alanina. Para alm
disso, referem tambm que o mecanismo de alterao do PLN por via redox independente da
fosforilao do PLN.
10

Ainda que o HNO tenha um efeito comprovado sobre o ciclo intracelular de Clcio, a
hiptese de que este afecta tambm a interaco entre o Clcio e os miofilamentos no foi
totalmente descartada. Com objectivo de investigar esta hiptese, obtiveram-se alguns
resultados interessantes.
Usando o SA como dador de HNO, a fora e os transientes de Clcio intracelulares
aumentaram de forma dependente da dose (dose-dependent), tendo a fora aumentado mais do
que a quantidade de Clcio intracelular, em percentagem. [3] Durante a activao provocada
pelo HNO, a fora mxima desenvolvida tambm aumentou, sem ser afectada a quantidade de
Clcio requerida para 50% de activao nem o Coeficiente de Hill. Por outro lado, o HNO no
alterou a actividade da ATPase miofibrilar, apoiando um efeito nos prprios miofilamentos.
Acrescenta-se o facto de o DTT ter inibido e revertido a aco do HNO, confirmando a
sensibilidade ao ambiente redox. [3] Estes factores levaram os autores a por a hiptese de que o
HNO actua como sensibilizador, aumentado a fora mxima desenvolvida sem alterar a
actividade de ATPase da miosina.
Um outro estudo que apoia a teoria da sensibilizao dos miofilamentos, por parte do
HNO (via dadores), baseia-se na recuperao da capacidade contrctil e inotrpica dos
cardiomicitos, aps sua inibio com Isoflurano (ISO), quando lhes foi administrado 1-
nitrosocyclohexyl acetate (NCA). [4] (Fig. 8)
Neste estudo, o NCA restabeleceu a fora na presena de ISO, sem afectar a
concentrao de Clcio intracelular.[4]
Muito recentemente foi elucidada uma parte do mecanismo de aco do HNO sobre os
miofilamentos.[56] Assim, proposto que o aumento de sensibilidade dos miofilamentos
provocado pelo HNO se deve formao de uma ligao dissulfido entre o resduo de cistena
257 do subdomnio 4 da actina e o resduo de cistena 190 da tropomiosina.[56]
Quando o Clcio se liga Troponina C, a Tropomiosina move-se do seu estado inactivado
(estado B de blocked) sobre os domnios 1 e 2 da actina, para o seu estado activado pelo Clcio
(estado C de closed) sobre os domnios 3 e 4.[57] Esta mudana de posio faz aumentar a
probabilidade da miosina se ligar actina, fazendo a tropomiosina passar, consequentemente,
para o seu estado totalmente aberto (estado M). A posio mdia e movimento da Tropomiosina
sobre o filamento de Actina reflecte a distribuio equilibrada entre os 3 estados referidos, B, C
e M. Na ausncia de Clcio, a distribuio aproximadamente 70%, 25% e 5% [58, 59]
respectivamente, mudando em resposta ao Clcio ou com a presena de cabeas de miosina.
Os autores especulam que a formao de uma ligao dissulfido entre os dois resduos
de cistena referidos poder localizar uma populao de Tropomiosinas sobre os domnios 3 e 4
11

da Actina, simulando os estados C e M naturais. Este movimento poderia influenciar o
equilbrio da associao entre a Tropomiosina e a Actina para um estado mais permissivo
ligao da Miosina.[56]

Discusso
Os efeitos do HNO sobre o sistema cardiovascular so vrios, desde os efeitos
vasodilatador e anti-plaquetrio at aos efeitos inotrpico e lusitrpico positivos, passando pelo
efeito anti-hipertrfico.
O mecanismo de acoplamento excitao-contraco dos cardiomicitos est largamente
afectado num quadro de Insuficincia Cardaca, com bvias consequncias ao nvel do
inotropismo cardaco. A teraputica da Insuficincia Cardaca representa actualmente, um
desafio.
neste contexto que o HNO pode surgir como uma alternativa aos habituais
tratamentos. A evidncia de que o efeito vasodilatador do HNO se mantm num ambiente de
disfuno vascular caracterstico (stress oxidativo, disfuno endotelial, aterosclerose e
hipertenso) e o facto de para este efeito no ocorrer desenvolvimento de tolerncia[60],
conjugado com o efeito inotrpico positivo (inalterado num quadro de insuficincia cardaca) e
o efeito anti-hipertrfico do HNO, so argumentos slidos a favor da sua utilizao numa
abordagem de preveno e/ou atenuao de algumas causas que cursam, a longo-prazo, com
Insuficincia Cardaca. [61]
A toxicidade provocada pelos digitlicos [62] e o down-regulation dos receptores beta-
adrenrgicos cardacos [63] coloca o HNO em vantagem face s teraputicas mais utilizadas
para manter o inotropismo cardaco neste contexto, uma vez que o HNO actua por mecanismos
independentes dos referidos. [64]
No entanto, h algumas limitaes a referir sobre a possvel administrao de HNO para
efeitos teraputicos. Primeiro, deve referir-se o facto de todos os estudos sobre o efeito do HNO
terem sido realizados em animais e no em humanos, pelo que no organismo humano a sua
aco pode produzir efeitos algo diferentes dos documentados. Segundo, o efeito do HNO em
outros sistemas que no o cardiovascular, quase desconhecido. De acordo com esta
perspectiva, torna-se particularmente importante determinar os efeitos do HNO sobre o sistema
renal e o sistema pulmonar, intimamente envolvidos na instalao e progresso de patologias
cardacas agudas e crnicas.
Dado o rico leque de efeitos desejveis a nvel do sistema cardiovascular e o grande interesse
investigacional que se tem desenvolvido nos ltimos anos, de esperar que se obtenham
algumas respostas para as perguntas que ficam em aberto sobre a aco do HNO.
12

Referncias

1. Ignarro, L.J., et al., Endothelium-derived relaxing factor produced and released from
artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(24): p. 9265-9.
2. Paolocci, N., et al., The pharmacology of nitroxyl (HNO) and its therapeutic potential:
not just the Janus face of NO. Pharmacol Ther, 2007. 113(2): p. 442-58.
3. Dai, T., et al., Nitroxyl increases force development in rat cardiac muscle. J Physiol,
2007. 580(Pt.3): p. 951-60.
4. Ding, W., et al., Reversal of isoflurane-induced depression of myocardial contraction
by nitroxyl via myofilament sensitization to Ca2+. J Pharmacol Exp Ther, 2011. 339(3):
p. 825-31.
5. Lancel, S., et al., Nitroxyl activates SERCA in cardiac myocytes via glutathiolation of
cysteine 674. Circ Res, 2009. 104(6): p. 720-3.
6. Paolocci, N., et al., Positive inotropic and lusitropic effects of HNO/NO- in failing
hearts: independence from beta-adrenergic signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003.
100(9): p. 5537-42.
7. Paolocci, N., et al., Nitroxyl anion exerts redox-sensitive positive cardiac inotropy in
vivo by calcitonin gene-related peptide signaling. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001.
98(18): p. 10463-8.
8. Tocchetti, C.G., et al., Nitroxyl improves cellular heart function by directly enhancing
cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ cycling. Circ Res, 2007. 100(1): p. 96-104.
9. Irvine, J.C., et al., Nitroxyl (HNO): the Cinderella of the nitric oxide story. Trends
Pharmacol Sci, 2008. 29(12): p. 601-8.
10. Tocchetti, C.G., et al., Playing with cardiac "redox switches": the "HNO way" to
modulate cardiac function. Antioxid Redox Signal, 2011. 14(9): p. 1687-98.
11. Hasenfuss, G. and J.R. Teerlink, Cardiac inotropes: current agents and future
directions. Eur Heart J, 2011. 32(15): p. 1838-45.
12. Shafirovich, V. and S.V. Lymar, Nitroxyl and its anion in aqueous solutions: spin
states, protic equilibria, and reactivities toward oxygen and nitric oxide. Proc Natl
Acad Sci U S A, 2002. 99(11): p. 7340-5.
13. Doyle, M.P., et al., Oxidation and reduction of hemoproteins by trioxodinitrate(II). The
role of nitrosyl hydride and nitrite. Journal of the American Chemical Society, 1988.
110(2): p. 593-599.
14. Fukuto, J.M., et al., The physiological chemistry and biological activity of nitroxyl
(HNO): the neglected, misunderstood, and enigmatic nitrogen oxide. Chem Res
Toxicol, 2005. 18(5): p. 790-801.
15. Wong, P.S., et al., Reaction between S-nitrosothiols and thiols: generation of nitroxyl
(HNO) and subsequent chemistry. Biochemistry, 1998. 37(16): p. 5362-71.
16. Woo, H.A., et al., Reversing the inactivation of peroxiredoxins caused by cysteine
sulfinic acid formation. Science, 2003. 300(5619): p. 653-6.
17. Nagahara, N., Intermolecular disulfide bond to modulate protein function as a redox-
sensing switch. Amino Acids, 2011. 41(1): p. 59-72.
18. Wink, D.A., et al., The cytotoxicity of nitroxyl: possible implications for the
pathophysiological role of NO. Arch Biochem Biophys, 1998. 351(1): p. 66-74.
19. Lopez, B.E., D.A. Wink, and J.M. Fukuto, The inhibition of glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase by nitroxyl (HNO). Arch Biochem Biophys, 2007. 465(2): p.
430-6.
20. Farmer, P.J. and F. Sulc, Coordination chemistry of the HNO ligand with hemes and
synthetic coordination complexes. J Inorg Biochem, 2005. 99(1): p. 166-84.
21. Adak, S., Q. Wang, and D.J. Stuehr, Arginine conversion to nitroxide by
tetrahydrobiopterin-free neuronal nitric-oxide synthase. Implications for mechanism. J
Biol Chem, 2000. 275(43): p. 33554-61.
13

22. Rusche, K.M., M.M. Spiering, and M.A. Marletta, Reactions catalyzed by
tetrahydrobiopterin-free nitric oxide synthase. Biochemistry, 1998. 37(44): p. 15503-
12.
23. Stojanovic, S., et al., Iron catalyzed conversion of NO into nitrosonium (NO+) and
nitroxyl (HNO/NO-) species. Nitric Oxide, 2004. 11(3): p. 256-62.
24. Saleem, M. and H. Ohshima, Xanthine oxidase converts nitric oxide to nitroxyl that
inactivates the enzyme. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 315(2): p. 455-62.
25. Poderoso, J.J., et al., The reaction of nitric oxide with ubiquinol: kinetic properties and
biological significance. Free Radic Biol Med, 1999. 26(7-8): p. 925-35.
26. Sharpe, M.A. and C.E. Cooper, Reactions of nitric oxide with mitochondrial
cytochrome c: a novel mechanism for the formation of nitroxyl anion and peroxynitrite.
Biochem J, 1998. 332 ( Pt 1): p. 9-19.
27. Niketic, V., et al., Exposure of Mn and FeSODs, but not Cu/ZnSOD, to NO leads to
nitrosonium and nitroxyl ions generation which cause enzyme modification and
inactivation: an in vitro study. Free Radic Biol Med, 1999. 27(9-10): p. 992-6.
28. Donzelli, S., et al., Generation of nitroxyl by heme protein-mediated peroxidation of
hydroxylamine but not N-hydroxy-L-arginine. Free Radic Biol Med, 2008. 45(5): p.
578-84.
29. Yong, Q.C., et al., Hydrogen sulfide interacts with nitric oxide in the heart: possible
involvement of nitroxyl. Cardiovasc Res, 2010. 88(3): p. 482-91.
30. Filipovic, M.R., et al., Beyond H(2)S and NO Interplay: Hydrogen Sulfide and
Nitroprusside React Directly to Give Nitroxyl (HNO). A New Pharmacological Source
of HNO. J Med Chem, 2013.
31. Rosenthal, J. and S.J. Lippard, Direct detection of nitroxyl in aqueous solution using a
tripodal copper(II) BODIPY complex. J Am Chem Soc, 2010. 132(16): p. 5536-7.
32. Royzen, M., J.J. Wilson, and S.J. Lippard, Physical and structural properties of
[Cu(BOT1)Cl]Cl, a fluorescent imaging probe for HNO. J Inorg Biochem, 2013. 118:
p. 162-70.
33. Apfel, U.P., et al., Detection of nitric oxide and nitroxyl with benzoresorufin-based
fluorescent sensors. Inorg Chem, 2013. 52(6): p. 3285-94.
34. Miranda, K.M., H.T. Nagasawa, and J.P. Toscano, Donors of HNO. Curr Top Med
Chem, 2005. 5(7): p. 649-64.
35. Switzer, C.H., et al., The emergence of nitroxyl (HNO) as a pharmacological agent.
Biochim Biophys Acta, 2009. 1787(7): p. 835-40.
36. Donzelli, S., et al., Pharmacological characterization of 1-nitrosocyclohexyl acetate, a
long-acting nitroxyl donor that shows vasorelaxant and antiaggregatory effects. J
Pharmacol Exp Ther, 2013. 344(2): p. 339-47.
37. Bermejo, E., et al., Effect of nitroxyl on human platelets function. Thromb Haemost,
2005. 94(3): p. 578-84.
38. Lopez, B.E., et al., Antioxidant actions of nitroxyl (HNO). Free Radic Biol Med, 2007.
42(4): p. 482-91.
39. Bullen, M.L., et al., Nitroxyl (HNO) as a vasoprotective signaling molecule. Antioxid
Redox Signal, 2011. 14(9): p. 1675-86.
40. Naughton, P., et al., Induction of heme oxygenase 1 by nitrosative stress. A role for
nitroxyl anion. J Biol Chem, 2002. 277(43): p. 40666-74.
41. Desmard, M., et al., Mitochondrial and cellular heme-dependent proteins as targets for
the bioactive function of the heme oxygenase/carbon monoxide system. Antioxid Redox
Signal, 2007. 9(12): p. 2139-55.
42. Lin, E.Q., et al., Nitroxyl (HNO) stimulates soluble guanylyl cyclase to suppress
cardiomyocyte hypertrophy and superoxide generation. PLoS One, 2012. 7(4): p.
e34892.
43. Ritchie, R.H., et al., Abstract 204: The NO Redox Sibling, Nitroxyl (HNO), Blocks
Cardiomyocyte Hypertrophy via Suppression of NADPH Oxidase. Circulation, 2007.
116(16 Supplement): p. II_19-II_20.
14

44. Fukuto, J.M., et al., The pharmacological activity of nitroxyl: a potent vasodilator with
activity similar to nitric oxide and/or endothelium-derived relaxing factor. J Pharmacol
Exp Ther, 1992. 263(2): p. 546-51.
45. Favaloro, J.L. and B.K. Kemp-Harper, The nitroxyl anion (HNO) is a potent dilator of
rat coronary vasculature. Cardiovascular Research, 2007. 73(3): p. 587-596.
46. Irvine, J.C., J.L. Favaloro, and B.K. Kemp-Harper, NO- activates soluble guanylate
cyclase and Kv channels to vasodilate resistance arteries. Hypertension, 2003. 41(6): p.
1301-7.
47. Favaloro, J.L. and B.K. Kemp-Harper, Redox variants of NO (NO{middle dot} and
HNO) elicit vasorelaxation of resistance arteries via distinct mechanisms. Am J Physiol
Heart Circ Physiol, 2009. 296(5): p. H1274-80.
48. Irvine, J.C., et al., Nitroxyl anion donor, Angeli's salt, does not develop tolerance in rat
isolated aortae. Hypertension, 2007. 49(4): p. 885-92.
49. Leo, C.H., et al., Endothelium-dependent nitroxyl-mediated relaxation is resistant to
superoxide anion scavenging and preserved in diabetic rat aorta. Pharmacol Res, 2012.
66(5): p. 383-91.
50. Wynne, B.M., et al., Aorta from angiotensin II hypertensive mice exhibit preserved
nitroxyl anion mediated relaxation responses. Pharmacol Res, 2012. 65(1): p. 41-7.
51. Andrews, K.L., et al., A role for nitroxyl (HNO) as an endothelium-derived relaxing
and hyperpolarizing factor in resistance arteries. Br J Pharmacol, 2009. 157(4): p. 540-
50.
52. Katori, T., et al., Calcitonin gene-related peptide in vivo positive inotropy is
attributable to regional sympatho-stimulation and is blunted in congestive heart failure.
Circ Res, 2005. 96(2): p. 234-43.
53. Kohr, M.J., et al., Nitroxyl enhances myocyte Ca2+ transients by exclusively targeting
SR Ca2+-cycling. Front Biosci (Elite Ed), 2010. 2: p. 614-26.
54. Sivakumaran, V., et al., Abstract 15778: HNO Enhances SERCA2a Activity and
Cardiomyocyte Function by Altering Key Cysteine Residues 41 and 46 in
Phospholamban. Circulation, 2011. 124(21 Supplement): p. A15778.
55. Froehlich, J.P., et al., Phospholamban thiols play a central role in activation of the
cardiac muscle sarcoplasmic reticulum calcium pump by nitroxyl. Biochemistry, 2008.
47(50): p. 13150-2.
56. Gao, W.D., et al., Nitroxyl-mediated disulfide bond formation between cardiac
myofilament cysteines enhances contractile function. Circ Res, 2012. 111(8): p. 1002-
11.
57. Gordon, A.M., M. Regnier, and E. Homsher, Skeletal and cardiac muscle contractile
activation: tropomyosin "rocks and rolls". News Physiol Sci, 2001. 16: p. 49-55.
58. Xu, C., et al., Tropomyosin positions in regulated thin filaments revealed by
cryoelectron microscopy. Biophys J, 1999. 77(2): p. 985-92.
59. Bacchiocchi, C. and S.S. Lehrer, Ca(2+)-induced movement of tropomyosin in skeletal
muscle thin filaments observed by multi-site FRET. Biophys J, 2002. 82(3): p. 1524-36.
60. Irvine, J.C., B.K. Kemp-Harper, and R.E. Widdop, Chronic administration of the HNO
donor Angeli's salt does not lead to tolerance, cross-tolerance, or endothelial
dysfunction: comparison with GTN and DEA/NO. Antioxid Redox Signal, 2011. 14(9):
p. 1615-24.
61. Levy, D., et al., The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA,
1996. 275(20): p. 1557-62.
62. Yang, E.H., S. Shah, and J.M. Criley, Digitalis toxicity: a fading but crucial
complication to recognize. Am J Med, 2012. 125(4): p. 337-43.
63. Bristow, M.R., et al., Beta 1- and beta 2-adrenergic-receptor subpopulations in
nonfailing and failing human ventricular myocardium: coupling of both receptor
subtypes to muscle contraction and selective beta 1-receptor down-regulation in heart
failure. Circ Res, 1986. 59(3): p. 297-309.
15

64. El-Armouche, A., et al., The new HNO donor, 1-nitrosocyclohexyl acetate, increases
contractile force in normal and beta-adrenergically desensitized ventricular myocytes.
Biochem Biophys Res Commun, 2010. 402(2): p. 340-4.



16

Anexo























Figura 1 O Nitroxyl (HNO) reage com grupos tiol livres atravs de um intermedirio reactivo. Aps a
formao de N-hidroxysulfinamide, a reaco procede por uma de 2 vias: (A) isomerizao para formar um
grupo sulfinamide ou, na presena de um tiol adicional (B), formao de uma ligao dissulfido e
hydroxylamine. Adaptado de [56].
Figura 2 Efeitos dose-dependent do NCA na agregao plaquetria. Efeito do NCA na agregao
plaquetria induzida com 10 M de U-46619 (um anlogo do Tromboxano A2) em platelet-rich plasma
(PRP) anticoagulado com citrato de sdio. Os valores representam a mdia em relao ao controlo (100%)
erro-padro da mdia. Adaptado de [36].
17




























Figura 3 Mecanismo da aco anti-hipertrfica do HNO em cardiomicitos. O AS utiliza uma
sinalizao HNO/sGC/cGMP/cGK-I para suprimir pontos-chave da resposta hipertrfica, incluindo a
expresso e actividade da NADPH oxdase (subunidade Nox2, uma fonte major de espcies reactivas de
Oxignio, ROS) e a actividade da p38MAPK (esta possivelmente como resultado de uma actividade
aumentada da fosftase-1 das MAPK, MKP-1). A actividade da cnase de sobrevivncia celular (cell
survival kinase) Akt e do seu alvo a jusante, GSK-3 beta, permanecem intactos na presena de AS. A
resposta hipertrfica dos cardiomicitos, sntese proteica de novo e sobreexpresso da cadeia pesada da beta-
miosina so atenuadas pelo HNO. Tanto a aco anti-hipertrfica como a aco antioxidante do HNO so
mediadas pela activao da sGC, produo de cGMP e estimulaoo da cGK-I. As linhas a tracejado
indicam locais de inibio. Adaptado de [42].
18




























Figura 4 - (A) Resposta hemodinmica ao AS num co consciente. A abcissa dada em min. Houve um
rpido declnio na presso sistlica ventricular esquerda (LV ESP) e na pr-carga ventricular esquerda (LV
EDP, presso telediastlica ventricular esquerda; LV EDD, dimenso telediastlica ventricular esquerda) que
ocorreu dentro de 5-10 min aps infuso do bolus (B) e persistiu durante, pelo menos, 35 minutos de infuso
sustentada de AS. A resistncia vascular sistmica (SVR) no se alterou. A contractilidade ventricular (Ees,
declive da relao presso-volume telessistlica) tambm subiu rapidamente e marcadamente, mantendo-se
elevada durante a infuso do frmaco. (B) Ansas de presso-volume pr (esquerda) e ps-infuso de AS
(direita). Houve um aumento na Ees (linha pontilhada) e uma diminuio no volume da cmara. (C)
Resultados semelhantes para coraes com bloqueio autonmico induzido pelo hexamethonium (direita).
Adaptado de [7].
19
















Figura 5 Efeitos cardiovaculares do HNO/ NO no miocrdio insuficiente e vasculatura insuficiente.
(A) Exemplos de relaes presso-volume em controlos (superior) e aps HNO/NO (AS) (inferior). O ciclo
cardaco basal a ansa presso-volume mais direita de cada conjunto, com os dados subsequentes obtidos
durante a reduo da pr-carga por ocluso transitria da veia cava. O AS reduziu a pr-carga (dimenso tele-
diastlica, EDD; seta tracejada), desviando o conjunto de ansas para a esquerda, tendo tambm aumentado a
contractilidade (denotado pelo desvio superior e para a esquerda da relao presso-volume telessistlica;
seta curva). (B) Dados mdios comparando os efeitos inotrpico, lusitrpico e sobre a carga, do HNO/NO
(AS), DEA/NO e NTG (os dois ltimos so dadores de NO). DEDD, dP/dtmaxend-diastolic dimension
relation slope; Tau, constante de tempo de relaxamento; ESP, presso telessistlica; EDP, presso
telediastlica; Ea, elastncia arterial (ps-carga). Adaptado de [6].
20









Figura 6 As aces do AS/HNO na funo dos micitos so independentes do cAMP e cGMP, mas
moduladas pelo contedo de grupos tiol intracelulares. A, esquerda, Cintica do sinal cAMP-FRET
registado num nico cardiomicito (inset) ao qual foi adminitrado AS (1 mmol/L), seguido de noradrenalina
(10 mol/L) e do inibidor de largo-espectro da fosfodiestrase 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (100
mol/Los dados sumrios esto direita. *P< 10
6
vs. controlo. B, Inibio da PKA com 100 mol/L Rp-
CPT-cAMPs diminui a inotropia do ISO, mas no a do HNO. C, a inibio da sGC (soluble guanylyl
cyclase) pelo ODQ ou da PKG pelo Rp-8Br-cGMPs, diminui os efeitos do NO, mas no os do HNO. D, O
NO tem um impacto negativo na contractilidade -adrenrgica, enquanto os efeitos do HNO so aditivos. E,
o pr-tratamento com GSH reduz o encurtamento do sarcmero provocado pelo AS/HNO. P<0.05 vs.
controlo. ISO: isoproterenol. Adaptado de [8].
21

















Figura 7 Aumento do transiente de Clcio e da fraco de libertao de Clcio do RS em
cardiomicitos de rato. A, Registos representativos do transiente de Ccio em micitos controlo (Con) e
pr-tratados com AS (AS). B e C, Resultados mdios para a amplitude do transiente de Clcio e constant
do declnio de Clcio (n=30 -31 clulas provenientes de 4 coraes). D-F, Quantidade (load) de Clcio do
RS medida via rpida aplicao de 10 mmol/L cafena (n=11-14 clulas provenientes de 6 coraes). D,
Amplitude do twitch dividida pela amplitude de cafena, expressa em percentagem (fractional SR Ca2+
release). E, Fluxos de remoo de Clcio de acordo com a frmula 1/twitch=1/NCX+1/SR; NCX o
do declnio de Clcio na presena de cafena; a contribuio relativa do RS aumentou de 87.6% no controlo,
para 91.3% em clulas pr-tratadas com AS e a contribuio relativa do NCX (trocador sdio/clcio)
diminuiu de 12.4% para 8.7%, respectivamente. A quantidade total (load) de Clcio do RS no mudou (F).
Todos os dados correspondem a mdia erro-padro da mdia. *P<0.05 vs. controlo. Adaptado de [8].

22













Figura 8 Mecanismos propostos para o decrscimo na

e para o desenvolvimento
mximo de fora, induzidos pelo NCA. A) esquerda est o filamento fino com as posies
relativas da TM no estado inactivado (estado B, preto) e a posio activada pelo Clcio (estado C,
azul) (o estado M foi omitido para clarividncia). Os subdomnios da actina (1-4) relativos
posio da TM esto indicados a cinzento-claro, em conjunto com a posio aproximada dos locais
de ligao fraco (verde) e forte (vermelho) da miosina. O cruzamento de uma pequena proporo
de TM (Cys190) com o domnio mais interno da actina (subdomnio 4, Cys 257) induzido pelo
NCA, impe restries ao movimento da TM desviando a sua posio de equilbrio em direco a
um estado activado pelo Clcio (direita). Este efeito prontifica/prepara o filamento fino, conferindo
uma resposta aumentada dos miofilamentos ao Clcio. Adaptado de [56].