Anda di halaman 1dari 13

ACARA III

UJI HASIL ISOLASI DNA


A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
DNAadalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan.
DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di
antara ketiga lokasi DNA ini, yaitu: DNA nucleus berbentuk linear dan
berhubungan sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria
dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berhubungan dengan protein
histon. DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung
komponen-komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan
basa. Satu sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan
diturunkan pada keturunannya.
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini
bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan.
Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan
kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan
dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik
dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan
dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.
Penghitungan DNA sangat penting sebagai prosedur dalam banyak
penelitian biologi molekuler. Namun, penentuan konsentrasi DNA atau RNA
yang akurat bisa menjadi sulit, terutama ketika kemurnian sampel tidak pasti.
Di banyak kasus, pendekatan yang paling cepat dan akurat untuk menentukan
konsentrasi asam nukleat yang relatif murni dan protein adalah dengan
membaca absorbansi pada spektrofotometri. Jumlah cahaya yang diserap oleh
sampel berbanding lurus dengan konsentrasi protein dan / atau asam nukleat
dalam sampel.
24
25


2. Tujuan Praktikum
a. Mengetahui teknik uji hasil isolasi DNA
b. Mengetahui procedure uji hasil
c. Mengetahui karakteristik DNA yang baik melalui uji hasil
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum bioteknologi acara uji hasil isolasi DNA dilaksanakan pada
Senin, 17 Maret 2014 bertempat di Laboratorium Bioteknologi Fakultas
Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.
B. Tinjauan Pustaka
Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu :
elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis
daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar
tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur
dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di
dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu
bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan
penyangga (Rianta 2006).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk 2007).


26

Tiga jenis spektrofotometri yang telah dikenal yaitu
1. Single beam (berkas sinar tunggal) spektrofotometri.
Spektrofotometri jenis ini banyak digunakan karena cukup murah
teteapi memberikan hasil yang memuaskan . Spektrofotometri jenis ini terdiri
hanya satu berkas sinar sehingga dalam praktek pengukuran sampel dan
larutan blanko atau standar harus dilakukan bergantian dengan sel yang sama.
2. Double beam (berkas ganda) spektrofotometri
Spektrofotometri jenis ini biasa ditemui pada spektrofotometri ysng
telah memakai automatis absorbansi sebagai fungsi panjang gelombang.
Spektrofotometri jenis ini mempunyai dua buah berkas absorbansi tidak perlu
bergantian antara sampel dan larutan blanko, tetapi dapat dilakukan sacara
parallel.
3. Gilford spektrofotometri
Spektrofotometri jenis ini banyak dipakai di laboratorium biokimia
dan mempunyai beberapa keuntungan disbanding spektrofotometri biasa
karena mampu membaca absorbansi sampai satuan 3 (spektrofotometri biasa
0,1-1,0) (Kusuma 2008)
Beberapa jenis larutan yang dianjurkan untuk electro phoresis DNA
adalah;TAE (Tris-acetate-EDTA) and TBE (Tris-borate-EDTA). Fragmen DNA
akan migrasi dengan kecepatan yang berbeda dalam kedua dapar tersebut dan
sangat tergantung kekuatan ion. Buffer tidak saja untuk mempertahankan pH,
tetapi memberikan ion yang membantu sifat konduktivitas. Bila digunakan kadar
dapar 10 x lebih kuat dari larutan stok, suhu dapat naik pada proses
elektroforesis gel dapat meleleh (Anonim 2013).
Penilaian keragaman genetik tanaman secara morfologi dilakukan melalui
uji progeni, uji provenan dan pengujian lainnya dengan mengamati penampilan
fenotipik tanaman. Pengujian ini dilakukan pada lingkungan yang berbeda dengan
fokus utama adalah ciri kualitatif dan kuantitatif yang bernilai ekonomi serta ciri
yang secara biologi penting seperti kemampuan hidup (survive), sifat toleran
27

terhadap stres lingkungan, sifat produksi dan resistensi terhadap hama dan
penyakit. Sebagian diantara ciriciri tersebut bersifat poligenik dan ekspresinya
dipengaruhi oleh lingkungan. Studi secara tradisional dengan metode genetika
kuantitatif, penilaian keragaman dan distribusi keragaman dikelompokkan ke
dalam beberapa kelas pengaruh, seperti pengaruh fenotifik, genotipe, lingkungan
dan interaksi antara lingkungan dan genotipe. Penentuan keragaman genetik
tanaman secara konvensional ini membutuhkan waktu yang lama, relatif mahal,
dipengaruhi oleh lingkungan dan keragaman yang diperoleh terbatas dan tidak
konsisten (Zulfahmi 2013)
C. Metode Praktikum
1. Alat
a. Spektrofotometer
b. Kuvet
c. Hot Plate Stirer
d. Cetakan Agarosa
e. Sisir Elektroforesis
f. Elektroforesis Unit
g. Mikropipet
h. Tip
2. Bahan
a. Etidium Bromide/ Floresafe
b. DNA
c. Agarose
d. Loading Dye/Bromtimol Blue
3. Cara Kerja
a. Uji Spektrofotometer UV-Vis
1) Menyiapkan spektrofotometri UV-Vis, alcohol dan aquades, tip blue,
yellow dan DNA yang telah diisolasi
2) Menghidupkan spektrofotometri serta mengatur program
28

3) Mengisi kuvet dengan 1998 l aquades
4) Menekan tombol kalibrasi untuk membuktikan bahwa pengencer
benar-benar air
5) Masukkan 2 l DNA dari hasil isolasi menggunakan tip yellow
6) Menekan tombol pengukuran
7) Mencatat hasil yang Nampak pada alat spektrofotometri
b. Uji Elektroforesis
1) Pembuatan Media
a) Menuang agarose kedalam Erlenmeyer, tutup dengan aluminium
foil, kemudian lubangi
b) Memanaskan Erlenmeyer berisi agarose dengan microwave selama
1 menit
c) Mengeluarkan dan gojok perlahan.
d) Mengulangi sebanyak 3-4x hingga agarose benar-benar larut dan
larutan homogen
e) Pada pemanasan terakhir, larutan digojog dengan hati-hati agar
tidak terbentuk gelembung udara pada larutan.
f) Mendiamkan hingga gel mengeras.
2) Pengujian dengan Elektroforesis
a) Menuangkan buffer TBE 1x ke dalam tangki elektroforesis hingga
setengahnya.
b) Meletakkan gel ke dalam tangki dengan posisi sumuran pada kutub
negatif tangki.
c) Menambahkan buffer TBE 1x hingga gel tenggelam ke dalam
buffer.
d) Mengambil loading dye dengan volume sesuai sampel DNA yang
akan dielektroforesis yaitu 1l loading dye untuk 5 l DNA
kemudian dicampur.
29

e) Masukkan ke dalam loading dye dan DNA kedalam sumuran gel
dengan hati-hati agar tidak menusuk gel tepat pada lubang sumuran
sampel untuk menghindari kontaminasi sampel yang satu dengan
yang lainnya.
f) Masukkan DNA marker pada sumuran tepi kanan dan kiri gel.
g) Menutup tangki elektroforesis.
h) Sambungkan alat ke listrik dan setting alat sesuai dengan voltase
dan waktu yang digunakanj





















30

D. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan
a. Bagan Cara Kerja Spektrofotometer UV


























1. Sterilisasi Alat dan Bahan 2. Membersihkan Kuvet 3. Mengisi aquadest ke
dalam kuvet sebanyak
1998 ul
Aquadest

Alkohol 70%

4. Memasukkan aquadest
pada kuvet ke dalam
spektrofotometer
melakukan kalibarasi goto
K/L L 260 nm enter
5. Menambahkan 2 ul DNA ke
dalam pengencer (aquadest) dan
di buat homogen.
Dibuat
Homogen

8. Melakukan uji
spektofotometer seperti diatas
(tahap 2-7) dengan panjang
gelombang 280 nm
7. Mencatat Nilai hasil absorbs
DNA dengan l 260 nm
6. Melakukan uji absorbsi DNA
dengan panjang gelombang 260
nm
260 nm
0,009

9. Melakukan analisis data
untuk konsentrasi dan
kemurnian DNA
31

b. Bagan Cara Pembuatan Agarose







v


c. Bagan Cara Uji Elektroforesis

















3. Menuangkan agarose ke
dalam cetakan elektroforesis
dan di tunggu sampai padat
2. Memasukkan 4 ul Etidioum
bromide saat sudah homogen
& bening
1. Memanaskan TAE 100 ml
+ 1 gram agarose dengan
hotplate stirrer
4 ul Etidioum
bromide
TAE 100 ml
+
1 gram agarose

Dituangkan dalam
cetakan elektroforesis
Suhu 100
o
C
Putaran 8-9 rpm

4. Ditunggu sampai padat
3. Mengambil DNA
sebanyak 5 ul, 2 kali
2. Meletakaan loading dye
pada plester yang
ditempel pada meja
1. Mengambil loading dye
sebanyak 2 ul dua kali
3. Mencampur DNA dengan
Loading dye dengan
mikropipet.
2 ul mikropipet

Loading dye

Campuran Loading
dye + DNA

Pencampuran
DNA dengan
menaruh DNA
di loading dye
kemudian di
sedot kembali
4. Memasukkan loading
dye + DNA pada cetakan
di Agarose pada lekukan
cetakan sisir /sumuran.
DNA

Loading dye

5. Menaruh agar yang terisi campuran loading dye +
DNA pada alat Elektroforesis dengan campuran TAE
dengan tegangan 80 volt. Warna kabel harus
dipastikan benar. Hitam (-) dan Merah (+)
Tunggu 30 Menit

32



d. Bagan Cara Menggunakan Gel Doc System








Analisis Data
a. Konsentrasi DNA


= 9,5. 10
-2
= 950 ng/L
b. Kemurnian DNA


=


= 1,8

2. Pembahasan
Tujuan dan fungsi dilakukan uji hasil isolasi DNA adalah untuk
mengetahui keragaman DNA tanaman, uji kemurnian benih untuk uji
perlindungan varietas tanaman agar hak paten benih tidak dibajak oleh orang
lain. Uji hasil ini juga berfungsi untuk mengetahui karakteristik DNA yang
baik. Selain itu dapat menganalisa kualitas DNA.
3. Menekan tombol
release pada notebook
2. Memasukkan agarose
ke dalam GDS dan
menekan tombol TUV
1. Mengambil Agarose
dan alat elektroforesis
secara perlahan
Tekan
release

Agarose

4. Lalu akan terlihat
gambar DNA di layar
notebook
33

Tipe uji hasil isolasi DNA ada dua yaitu uji kualitas DNA dan uji
kuantitas DNA. Pengukuran secara kualitas, dilakukan pengecekan hasil
isolasi DNA pada gel agarose, horizontal elektroforesis. Sebanyak 4 ml DNA
sampel dan1 ml loading dye di running dalam tangki elektroforesis agarose
1% pada 80 volt selama 30 menit. Kemudian pola pita yang dihasilkan dilihat
dibawah UV transilluminator. Uji kuantitatif sampel DNA hasil ekstraksi
dilakukan dengan mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA menggunakan
Spektrofotometer.
Faktor yang mempengaruhi uji hasil isolasi DNA pada praktikum ini
dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan kurangnya
kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak munculnya
pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV. Selain itu uji hasil isolasi
DNA juga bisa disebabkan kurang murninya kadar DNA karena masih
tercampur dengan protein atau RNA. Faktor yang juga berpengaruh pada
kecepatan gerak ion dan molekul adalah besarnya voltase dan aliran listrik
atau besarnya tegangan medan listrik yang digunakan untuk elektroforesis.
Makin tinggi voltase dan aliran listrik maka akan makin cepat terjadinya
mobilitas. Meski pun demikian voltase dan aliran listrik yang tinggi dapat
menyebabkan timbulnya panas.
Alat utama dalam pengujian isolasi DNA adalah adalah
spektrofotometer dan alat elektroforesis. Kedua alat ini sangat penting untuk
mengetahui kualitas dan kuantitas DNA. Alat elektroforesis DNA merupakan
alat untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul)
dan struktur fisik molekulnya. Spektrofotometri adalah suatu metode
analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan kemampuan
senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.
34

Bahan utama dalam uji hasil DNA adalah DNA dan agarose dimana
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk
hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari
makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Gel
agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari
beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan
negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks
gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Selain itu ada buffer elektroforesis yang terdiri dari
TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar listrik, loading dye
berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran. Etidium bromida
sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida. TAE
: Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH Asam Asetat Glasial sebagai
elektrolit gram. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non
aktif DNA
Konsentrasi dan kemurnian DNA diukur menggunakan metode
spektrofotometri dengan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 260
nm dan 280 nm. Hasil pengukuran untuk rasio DNA dapat dilihat pada table
3.1 yaitu dapat disimpulkan bahwa kemurnian DNA yang didapatkan sekitar
1,18, sementara itu konsentrasi yang didapatkan sekitar 950 ng/l. Hasil ini
merupakan hasil yang optimal berdasarkan panjang gelombang DNA. Nilai
kemurnian 1,18 menandakan DNA kotor. Konsentrasi yang di dapat adalah
950 ng/l





35

E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
a. Uji hasil isolasi DNA dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara
kualitatif dan secara kuantitatif.
b. Kurang sterilnya alat dan bahan yang digunakan menyebabkan DNA tidak
terlihat.
c. Kadar kemurnian DNA adalah 1,18 yang berarti DNA kotor yang
tercampur protein maupun RNA
d. Konsentrasi DNA adalah 950 ng/l
2. Saran
Saran untuk praktikum bioteknologi pertanian acara uji hasil isolasi
DNA sudah baik, namun untuk praktikum nya seharusnya semua mahasiswa
dapat melihat semua proses tanpa terkecuali agar pratikan benar-benar paham
tiap proses.















36

DAFTAR PUSTAKA

Anonim 2013. Aplikasi Elektroforesis dalam farmasi.
http://farmasibhe2011.files.wordpress.com/ Diakses pada 3 April 2014.
Davis dkk. 2007. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in
agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Kusuma 2008. Spektrofotometer. http://digilib.unimus.ac.id/. Diakses pada 3
April 2014
Rianta 2007. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana, Volume XXVI, No 1
2007: 25-31
Zulfami 2013. Penanda DNA untuk Analisis Genetik Tanaman. Jurnal
Agroteknologi. Vol. 3 No. 2