RELATRIO TA 514

Bioqumica de Alimentos


ESTUDO DA ESPECIFICIDADE DAS ENZIMAS QUANTO AO
SUBSTRATO



Professora Hlia H. Sato

Grupo 6 Turma A
Millena Dias ..................................................... 122158
Juliana Erbolato ............................................... 117466
Juliana Albernaz .............................................. 121062


Campinas, 07de maio de 2014.
2

INTRODUO

Enzimas so protenas, formadas por uma longa cadeia de
aminocidos, com atividade cataltica. Sua principal funo consiste
em tornar possvel a atividade celular, quebrando molculas a fim de
formar novos compostos, e isso devido a sua capacidade de diminuir
a energia necessria para que tais reaes ocorram. [1]

Tais protenas apresentam caractersticas notveis, e entre elas
destaca-se a sua especificidade em relao ao substrato. Isto
significa que as enzimas so capazes de modificar seletivamente
compostos individuais sem afetar outros e isso as distinguem em
relao aos catalisadores qumicos. Em alguns casos, a enzima
especfica para uma ligao em particular, que est adjacente a um
grupo especfico, o que chamado de especificidade de grupo. Em
outros casos ocorre a especificidade absoluta, na qual ela atua sobre
um nico substrato e catalisa uma nica reao. Tambm h os casos
em que ocorre a baixa especificidade, na qual a enzima no
descrimina os substratos, mas exibe especificidade somente em
relao ligao a ser rompida. E por ltimo, h a especificidade
estereoqumica, onde as enzimas apresentam especificidade em
relao a uma das formas dos ismeros. [2]

Em todos os modos de atuao das enzimas, a sua
especificidade se deve a presena de seu stio ativo, o qual capaz
de se ligar com o substrato, formando o complexo enzima-substrato.
Isso explicado pela teoria da chave-fechadura, demonstrada por
Emil-Fisher, no qual a chave (substrato) deve-se ajustar a fechadura
(enzima), de modo que a enzima atue sobre um nmero limitado de
compostos. [3]
3

Quando a ligao com o substrato ocorrer de forma
covalente, as enzimas sero chamadas de grupos prostticos. Da
mesma forma, tambm so classificadas de acordo com o tipo de
reao que realizar com o substrato em diversas classes:
oxidoredutases (reaes de xido-reduo), transferases
(transferncia de grupos), hidrolases (reaes de hidrlise), liases
(atuam sobre ligaes especficas, rompendo as molculas),
isomerases (atuam sobre a mesma molcula e a transforma atravs
do processo de isomeria) e, por ltimo, as ligases (atuam sobre as
ligaes qumicas, acrescentando grupos qumicos a uma molcula
pr-existente). [4]

MATERIAIS E MTODOS

MATERIAL
3 tubos com 5 mL de soluo 5% de gelatina em tampo
fosfato 0,05M pH 6,0 (item I)
Soluo de papana 2mg/mL (Item I)
3 tubos com 2 g de amido de batata (Item I)
Soluo de -amilase bacteriana 10L/mL
Tampo Fosfato 0,05Mol/L pH 6,0
Soluo 1% Amido em Tampo Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0
Soluo 1% Sacarose em Tampo acetato 0,1 Mol/L pH 5,0
Soluo 0,05% Lactose em Tampo Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,5
Soluo de Lactase comercial 2,5 mL/50mL
Soluo de -frutofuranosidase ou invertase comercial 0,12
mg/100mL
Soluo de -amilase bacteriana 0,1 mL/100 mL (grupos pares)
Reagentes SN I
Reagentes SN II



4

MTODO
I) Especificidade da -amilase e protease
IA Teste de hidrlise de gelatina

IB Teste de hidrlise do amido



Numerar e identificar
3 tubos contendo
5mL de soluo de
gelatina em tampo
fosfato 0,05Mol/L
pH6,0 (G-1, G-2 e G-
3)
Pipetar 1mL
de soluo
2mg/mL de
papana no
tubo G-1
Pipetar 1 mL de
soluo
10L/mL de -
amilase
bacteriana no
tubo G-2
Pipetar 1 mL de
gua destilada
no tubo G-3
Homogeinizar as
misturas e
incubar os tubos
G-1, G-2 e G-3
em banho-maria
a 50C por 30
minutos
Aps
incubao,
colocar os
tubos em
banho de
gelo por 10
minutos.
Verificar em quais
tubos ocorreu
gelificao ou
hidrlise da
gelatina.
Adicionar 10 mL de
Tampo fosfato
0,05Mol/L pH 6,0
em 3 tubos de
ensaio (25x200mm)
contendo 2g de
amido de batata
Numerar os
tubos em AM-
1, AM-2 e AM-
3
Pipetar 1mL de
soluo
2mg/mL de
papana no
tubo AM-1
Pipetar 1 mL de
soluo 10/mL
de -amilase
bacteriana no
tubo AM-2
Pipetar 1mL de
gua destilada
no tubo
controle AM-3
Homogeinizar as
misturas de
reao com auxilio
da baqueta de
plstico e incubar
os 3 tubos em
banho-maria a
90C
Resfriar os
tubos em gua
corrente e
observar em
quais tubos
ocorreu
geleificao ou
hidrlise do
amido
5

II) Especificidade das enzimas -galactosidase, invertase
e -amilase bacteriana quanto ao substrato
Determinao de acares formados na hidrlise de lactose,
sacarose e amido, respectivamente, pelas enzimas -
galactosidase, -frutofuranosidade e -amilase pelo mtodo
colorimtrico de Somogyi-Nelson
a) Preparar as misturas de reao em tubos de ensaio
numerados como descrito a seguir na tabela 1
b) Incubar os tubos L1 e L2 em banho-maria durante 20
minutos a 40C
c) Incubar os tubos S1 e S2 em banho-maria durante 20
minutos a 50C
d) Incubar os tubos A1 e A2 em banho-maria durante 20
minutos a 60C
e) Resfriar em banho de gelo
f) Determinar os acares redutores formados, pelo mtodo de
Somogyi-Nelson, nas misturas de reao L1, L2, S1, S2, A1
e A2, usando 0,5mL de cada mistura de reao, como
descrito no fluxograma 1.
g) Calcular as atividades enzimticas de -galactosidase, -
frutofuranosidade e -amilase como: mol de acares
redutores formados por minuto por mL ou mg de enzima
comercial
h) Anotar nas cpias dos papis de cromatografia os acares
redutores detectados, nas misturas: L1, L2, S1, S2 (papel de
cromatografia 1), A1 e A2 (Papel de cromatografia 2)









6

Tabela 1 Estudo da especificidade da -galactosidase, -
frutofuranosidade e -amilase.
TUBOS
SOLUES L1 L2 S1 S2 A1 A2
Soluo 0,05% de lactose
em tampo fosfato 0,1
Mol/L pH 6,5

2 mL

2 mL

-

-

-

-
Soluo 1% de sacarose
em tampo acetato 0,1
Mol/L pH 5,0

-

-
2 mL 2 mL
-

-
Soluo 1% amido em
tampo fosfato 0,1 Mol/L
- - - - 2 mL 2 mL
Enzima -galactosidase ou
lactase (2,5mL / 50mL)
- 1 mL - - - -
Enzima -
frutofuranosidase ou
Invertase (0,12 mg /
100mL)

-

-

-

1 mL

-

-
Enzima -amilase
bacteriana (0,1mL/100mL)
- - - - - 1 mL
H
2
O destilada 1 mL - 1 mL - 1 mL -
Incubar a 40C Incubar a 50C Incubar a 60C


Fluxograma 1 determinao de acares redutores pelo mtodo
de Somogyi-Nelson
Pipetar 0,5 mL de amostra + 1 mL de reagentes SNI em tubos de
ensaio numerados

Agitar os tubos e colocar em banho-maria em ebulio por 6 minutos

Retirar os tubos e colocar no banho de gelo at resfriar a temperatura
ambiente

Retirar os tubos do banho de gelo e adicionar 1 mL de reagente SNII

Agitar os tubos e depois deixar em repouso por 5 minutos
7


Adicionar 10 mL de gua destilada e misturar por inverso

Calibar o espctofmetro, ajustando o zero de absorbncia a 540 nm
com a soluo Tubo branco (fluxograma 2)

Medir a absorbncia das solues a 540 nm

Fluxograma 2 Preparao do tubo branco (ajuste do zero de
absorbncia)


Pipetar 0,5 mL de gua destilada + 1 mL de reagente SNI em tubo de ensaio
Agitar o tubo e colocar em banho-maria em ebulio por 6 minutos
Aps tratamento trmico, transferir o tubo para banho de gelo e resfriar at a
temperatura ambiente
Adicionar 1 mL de reagente SnII
Agitar o tubo e deixar em repouso por 5 minutos
Adicionar 10 mL de gua destilada e misturar por inverso
Utilizar a soluo do tubo branco para ajustar o zero de absorbncia
8


RESULTADOS E DISCUSSES

1. Especificidade da -amilase e protease
Para analisar a especificidade da alfa-amilase e da protease
foram realizados testes de hidrolise. A partir dos testes de hidrolise
da gelatina (IA) e hidrolise do amido (IB) tivemos os seguintes
resultados:
Tabela 2- Estudo da especificidade da protease bacteriana e -amilase
bacteriana
Tubo Substrato

Sol.
Papana
2mg/mL
Sol. -
amilase
10L/mL
H
2
O Resultados
(gel ou
hidrolisado)
G-1 5 mL de sol. 5% de
gelatina em tampo
fosfato 0,05M pH 6,0

1 mL

-

-

Gel
G-2 5 mL de sol. 5% de
gelatina em tampo
fosfato 0,05M pH 6,0

-

1 mL

-

Gel
G-3
Controle
5 mL de sol. 5% de
gelatina em tampo
fosfato 0,05M pH 6,0

-

-

1mL

Gel
AM-1 2g amido de batata +
10 mL de tampo
fosfato 0,05M pH 6,0

1 mL

-

-

Gel
AM-2 2g amido de batata +
10 mL de tampo
fosfato 0,05M pH 6,0

-

1mL

-

Hidrolisado
AM-3 2g amido de batata +
10 mL de tampo

9

Controle fosfato 0,05M pH 6,0 - - 1mL Gel

Os resultados obtidos foram os esperados de acordo com a
literatura, exceto o do tubo G-1, que deveria ter hidrolisado.
A papana uma enzima encontrada no mamo, que provoca a
degradao das macromolculas da protena presentes na gelatina,
causando a no gelificao. J as amilases so enzimas que catalisam
a hidrolise de ligaes alfa-1,4 glicosdicas de polissacardeos, como o
glicognio, amido ou seus produtos de degradao.
De acordo com a especificidade enzima-substrato, a papana
deveria digerir as protenas, no caso a gelatina, e a alfa-amilase o
amido. Assim, no tubo G-1, como tnhamos a presena de gelatina e
papana, a soluo deveria ter sido digerida no formando gel. J nos
tubos G-2 e G-3, houve a formao de gel, pois no havia a papana
para ocorrer a digesto, apesar da presena da alfa-amilase, que s
digere amido e no protena.
No tubo AM-2, ocorreu a hidrlise pelo fato da alfa-amilase
estar em contato com seu substrato correspondente, o amido, assim
houve a digesto da soluo sem formao de gel. J nos tubos AM-1
e AM-3, houve formao de gel j que havia amido e no havia a
enzima correspondente a sua digesto, a alfa-amilase. A gua e a
papana no interferem na hidrlise, fazendo com que haja gelificao
das amostras.
2. Especificidade das enzimas -galactosidade, invertase e -
amilase bacteriana quanto ao substrato
Os resultados obtidos na leitura em espectrofotmetro (femto
III) de cada soluo so descritos na tabela abaixo:
Tabela 3 Absorbncias obtidas das solues testadas
Soluo Absorbncia
10

Tampo (540nm)
L1 0,187
L2 0,367
S1 0,032
S2 0,469
A1 0,073
A2 2,658
Para o clculo das unidades de atividade enzimtica de lactase,
invertase e alfa-amilase bacteriana necessrio saber a concentrao
de glicose em cada enzima testada. Primeiramente, deve-se subtrair
o valor 2 do valor 1 para obter a absorbncia de cada enzima. Assim,
segue os resultados:
Tabela 4 Absorbncias totais para cada enzima
Soluo
Tampo
Absorbncia
(540nm)
L (L2-L1) 0,18
S (S2-S1) 0,437
A (A2-A1) 2,585

Ento, foi construda uma curva padro de glicose com os
dados de concentrao de glicose comparados com a absorbncia de
540nm (Femto III), para obter os devidos valores para as unidades
de atividade. Os dados da tabela da curva de glicose se encontram
abaixo e o grfico tambm:
Tabela 5 Curva Padro de Glicose - Mtodo de Somogyi-Nelson
11

Concentrao de
glicose (mg/mL)
Absorbncia
540nm Femto III
0,025 0,043
0,05 0,108
0,1 0,195
0,15 0,305
0,25 0,479
0,3 0,618
0,4 0,810



Pela equao da curva padro (y=2,0273x 0,0038), calcula-
se a concentrao da glicose:
L: y = 0,180 x = 0,0906
S: y = 0,437 x = 0,2174
A: y = 2,585 x = 1,2769
y = 1900ralx - 1900ral
R = 1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral
1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral
A
b
s
o
r
b

n
c
i
a

5
4
0
n
m

F
e
m
t
o

I
I
I

Concentrao de glicose (mg/mL)
Curva Padro de Glicose - Mtodo de
Somogyi-Nelson
Curva Padro
de Glicose
12

Desta forma, com as absorbncias obtidas e os valores de
concentrao de glicose, o x da equao, podemos obter os valores
de unidades de atividade atravs dos seguintes clculos: o valor de
concentrao de glicose (mg de glicose/mL) encontrado para cada
tubo testado deve ser multiplicado por 3 j que as misturas das
solues enzimticas com as solues tampes esto diludas na
proporo 1:3. Como cada tubo testado contm uma enzima
diferente, os clculos para obter a atividade enzimtica sero
diferentes para cada enzima.
a) Para a Lactase (2,5mL/50mL) (L):
0,0906 mg ----- 1mL
A ------------- 3mL
A = 0,2718mg * 1000 = 271,8g de acar redutor

O resultado obtido atravs do clculo acima para a enzima
lactase (L) equivale a 0,05mL de enzima. Assim tal valor deve ser
dividido por 0,05 o que resulta num valor de miligramas de acar
redutor por mililitros de enzima. Para o clculo de unidade de
atividade enzimtica deve-se dividir o ltimo resultado obtido por
180g (equivalente a um mol de glicose) e por 20 minutos (tempo de
reao).

2,5mL lactase ----- 50mL
B ------------------- 1mL
B = 0,05mL de lactase

271,8g de acar redutor ---- 0,05mL de lactase
C ------------------------------- 1mL de lactase
C = 5436g de acar redutor/mL

5436g ------ 20min
D--------------- 1min
D= 271,8g de acar redutor/mL.min

13

(271,8g de acar redutor/mL.min)/180= 1,51mol/mL.min
b) Para a Invertase (0,12mg/100mL) (S):
0,2174 mg ----- 1mL
A ------------- 3mL
A = 0,6522mg * 1000 = 652,2g de acar redutor

O resultado obtido atravs do clculo acima para a enzima
invertase (S) equivale a 0,0012mg de enzima. Assim tal valor deve
ser dividido por 0,0012 o que resulta num valor de miligramas de
acar redutor por miligramas de enzima. Para o clculo de unidade
de atividade enzimtica deve-se dividir o ltimo resultado obtido por
180g (equivalente a um mol de glicose) e por 20 minutos (tempo de
reao).

0,12mg invertase ----- 100mL
B ------------------- 1mL
B = 0,0012mg de invertase

652,2g de acar redutor ---- 0,0012mg de invertase
C ------------------------------- 1mg de invertase
C = 543500g de acar redutor/mg de enzima

543500g ------ 20min
D------------------- 1min
D= 27175g de acar redutor/mg.min

(27175g de acar redutor/mg.min)/180= 150,97mol/mg.min
c) Para a -amilase (0,1mL/100mL) (A):
1,2769mg ----- 1mL
A ------------- 3mL
A = 3,8307mg * 1000 = 3830,7g de acar redutor

O resultado obtido atravs do clculo acima para a enzima
amilase (A) equivale a 0,001mL de enzima. Assim tal valor deve ser
dividido por 0,001 o que resulta num valor de miligramas de acar
redutor por mililitros de enzima. Para o clculo de unidade de
14

atividade enzimtica deve-se dividir o ltimo resultado obtido por
180g (equivalente a um mol de glicose) e por 20 minutos (tempo de
reao).

0,1mL amilase ----- 100mL
B ------------------- 1mL
B = 0,001mL de amilase

3830,7g de acar redutor ---- 0,001mL de amilase
C ------------------------------- 1mL de amilase
C = 3830700g de acar redutor/mL de enzima

3830700g ------ 20min
D------------------- 1min
D= 191535g de acar redutor/mL.min

(191535g de acar redutor/mL.min)/180= 1064,083mol/mL.min










Em relao a este experimento, pode-se observar que houve mesmo
a degradao de substratos nos tubos de ensaio contendo enzimas
especificas, j que na leitura da absorbncia, os segundos valores
foram maiores que os primeiros. O valor de atividade foi maior para o
Soluo
Tampo
Absorbncia
(540nm)
Unidades de
Atividade
enzimtica
(mg ou mL)
L (L2-L1)
Lactase
0,18 1,51
S (S2-S1)
Invertase
0,437 150,97
A (A2-A1)
-amilase
2,585 1064,083
15

amido, mostrando que a alfa-amilase tem baixa especificidade,
comparada as outras enzimas utilizadas, que apresentaram menores
valores de atividade.
3. Cromatografia em papel dos acares formados na hidrolise
de lactose, sacarose e amido, respectivamente, pelas enzimas
lactase, invertase e alfa-amilase
Foi realizada cromatografia em papel com solues iguais as
elaboradas em laboratrio. Nesse teste, sabe-se que a deteco do
acar feita dependendo da afinidade do composto pela soluo
reveladora. Os acares solveis na soluo mvel so arrastados no
papel, originando as bandas observadas. No caso das solues L1, S1
e A1, que no receberam enzimas, pode-se ver que apenas a lactose
foi arrastada, sendo que a sacarose e o amido no aparecem no
papel por no serem redutores.
Na banda da soluo L2 possvel observar que houve
formao de glicose e galactose, provenientes da hidrlise de ligaes
glicosdicas. Alm disto, existiu vestgio de lactose na soluo, ento
se pode ver que a reao no foi completa.
Na banda da soluo S2 possvel observar a frutose e glicose,
acares redutores constituintes da sacarose, j que houve hidrlise
pela invertase.
A soluo A2, de amido, teve sua estrutura hidrolisada pela
alfa-amilase, produzindo acares com diferentes quantidades de
monmeros, como glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose,
maltopentaose. Os acares de menor peso molecular foram os mais
arrastados pelo papel.

16


CONCLUSO

Em relao especificidade da -amilase e da protease, a
primeira possui especificidade em relao ao amido, digerindo-o e a
segunda possui com as protenas. Logo, nas solues que continham
gelatina somente, sem a adio de papana (protease), no ocorreu
sua digesto, ocasionando a formao de gel. Na soluo que possua
a papana, tambm houve a formao de gel, e esse erro pode ter
ocorrido devido a no correta preparao da soluo. No tubo
contendo soluo de amido e -amilase, no houve a formao de
gel, devido a sua especificidade em relao ao substrato. J os que
no possuam a enzima especifica para o amido, ocorreu a formao
de gel.
J em relao especificidade da -galactosidade, invertase e
-amilase, pode-se concluir que a -amilase que possui menor
especificidade em relao ao substrato, ou seja, possui baixa
especificidade, pois a que menos digeriu seu substrato
correspondente, o amido, possuindo assim maior atividade. Logo,
quanto maior a atividade, menor a especificidade da enzima.


REFERENCIA BIBLIOGRFICA

[1] FURIGO, Agenor Junior. Tese: Enzimas e suas aplicaes cintica
enzimticas. Junho de 2001, disponvel em:
<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/cinet
ica_enzimatica.pdf>.Acesso em: 18 de maio de 2014.

[2] A constituio qumica e a actividade cataltica das enzimas.
Disponvel em: <http://pt.slideshare.net/catir/enzimas-
302665>.Acesso em: 18 de maio de 2014.
17

[3] Enzimas catalisadoras de reaes biolgicas. Enzimas. Disponvel
em:
<http://www.insumos.com.br/funcionais_e_nutraceuticos/materiais/8
6.pdf>.Acesso em: 18 de maio de 2014.

[4] Classificao das enzimas. Disponvel em:
<http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/classificacao.pdf>. Acesso
em 18 de maio de 2014.