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2013

PROFESOR: Luis Briceo


INTEGRANTES:
- Alczar Vilca, Francis
- Bartolini Aguirre, Stefani
- Salgado Cabada, Renato
- Sotomayor Quispe, Karen
10/06/2013
Espectrofotometra
I. Introduccin

La espectrofotometra se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una
muestra, en funcin de la longitud de onda. Cada componente de la solucin posee un patrn de
absorcin de luz caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de
absorcin de luz de una muestra versus soluciones estndar, es posible determinar la identidad y
la concentracin de componentes disueltos en la muestra (solucin incgnita). Las ventajas de la
espectrofotometra sobre otros mtodos analticos de laboratorio son varias: es rpida, precisa,
verstil, fcil de usar y eficiente en costo. Los espectrofotmetros se han mejorado en precisin y
versatilidad en los ltimos aos con los avances de tecnologa, y hoy se consideran indispensables
en un laboratorio.
En el control de calidad de los alimentos se utilizan con mucha frecuencia las tcnicas fotomtricas
los que permiten establecer concentracin de determinados componentes en solucin, en base a la
intensidad de la luz absorbida por dicha solucin, previo tratamiento bajo condiciones especiales.
En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacridos (azucares simples),
oligosacridos (contienen de dos a diez unidades monosacridos) y polisacridos (glcidos
polimricos ms grandes). Los monosacridos se clasifican en aldosas si tienen grupo aldehdo y
cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los monosacridos, aldosas o cetosas y la mayora de los
disacridos son azucares reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos
anomricos no est formando enlace glucosdico.
El mtodo del DNS es una tcnica colorimtrica que emplea cido 3,5 dinitrosalislico para la
hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la determinacin
espectrofotomtrica a 550nm de los azcares reductores.

El objetivo del presente laboratorio es conocer uno de los mtodos de espectrofotometra para
alimentos como la mermelada, nctar de durazno y miel de abeja; para determinar su contenido de
azucares reductores por el mtodo del DNS.











II. Materiales y Mtodos

2.1. Materiales

Muestras de alimentos: miel de abeja, mermelada de fresa Gloria y nctar de durazno
Frugos.
Embudo Buchner
Fiola
Tubos de ensayo
Pipetas y propipetas
Espectrofotmetro

3.2 Reactivos

Solucin de DNS (cido 3,5 dinitrosaliclico)
Sal de Rochelle
Solucin estndar de glucosa

3.3 Procedimiento

3.3.1 Preparacin de la curva estndar

Se pesaron 0,2 g de glucosa anhidra.
Se coloc la glucosa en una fiola de 100 ml la cual se enras con agua destilada.
Se tomaron alcuotas de 7, 9, 11, 14.5, 18 y 22 ml. Estas se colocaron en fiolas de 25 ml,
las cuales se enrasaron con agua destilada.
Se colocaron 0,5 ml de cada solucin de glucosa en tubos de ensayo, se adicionaron 3 ml
de la solucin de DNS a cada tubo y se calentaron a ebullicin durante 5 minutos.
Se adicionaron 1 ml de sal de Rochelle y 10 ml de agua destilada. Acto seguido se mezcl.
Para realizar la curva estndar se tom por triplicado cada solucin y se incluy un blanco.
Se leyeron las absorbancias de cada solucin en el espectrofotmetro y se efectu un
anlisis de regresin lineal.
3.3.2 Anlisis de la muestra

La muestra se diluyo usando agua destilada, para dar una concentracin final de 2.5 a 9 x

gr de glucosa anhidra/ 0.5 ml de solucin y se procedi al igual que para las soluciones de la
curva estndar.
Fig. N1 Fig. N2
Fig. N3 Fig. N4
Fig. N5
Con la absorbancia que se obtuvo, se fue a la curva estndar y se determin la
concentracin de azcares reductores expresados como glucosa.

III. Revisin de Literatura

3.1. Espectrofotmetro

Es un instrumento sencillo, tambin conocidos como absorcimetros refinados, diseados
para la deteccin sensible de bandas muy angostas de longitudes de onda en el rango que
va desde UV hasta el infrarrojo cercano, esto es, de 190 a 1000mm. Las lmpara de
deutrio se usan como fuentes luminosas para UV y las lmparas de tungsteno y de haluros
de tungsteno para la luz visible; por otro lado, las compuertas ajustables, cuas de
interferencia, primas y rejillas de difraccin permiten limitar el paso de la radiacin (2-
14nm). Los tubos fotoemisores, los diodos y lo tubos fotomultiplicadores de electrones se
emplean para detectar la radiacin transmitida por la muestra en solucin (Kirk et al, 1996).

Los instrumentos de un solo rayo tiene solamente una trayectoria para la luz desde la
fuente hasta el detector. Sin embargo, los avances modernos en el diseo de instrumentos
y la tecnologa de los componentes han conducido a obtener espectrofotmetros muy
exactos y estables, de uno o de doble canal, de lectura directa con medidor de aguja o
indicador digital y facilidades de expansin de la escala para poder trabajas con soluciones
que son capaces de absorber mucho o muy poco (Kirk et al, 1996).

3.2. Espectrofotometra visible y ultravioleta

La absorcin en estas regiones del espectro involucra transformaciones de las molculas en sus
electrones externos o de valencia, pasando del estado fundamental a estados excitados. Estas
tcnicas se aplican, fundamentalmente, a especies en disolucin, midindose la radiacin
transmitida (no absorbida) por las mismas. La regin visible del espectro se extiende entre 400 y
700nm; en ella se integran la luz blanca y las distintas radiaciones visibles que la componen. Como
los espectros visibles y ultravioleta estn provocados por cambios electrnicos moleculares,
dependen, como el color transmitido o reflejado, del tipo de combinacin qumica de los tomos
(Burriel et al, 2008).

3.3. Ley de Beer

Segn Beer, la absorbancia presentada por una sustancia es funcin directa de su espesor y de su
concentracin:
A = a.b.c
Siendo b el espesor (longitud de paso ptico), c la concentracin y a una constante de
proporcionalidad caracterstica del sistema absorbente. Si la concentracin se expresa en
gramos/litro y el espesor en centmetros, la constante a se denomina absortividad. El valor de a
es constante para cada sistema absorbente a una longitud de onda determinada (Burriel et al,
2008).

3.4. Cumplimiento de la ley de Beer

En realidad no hay excepcin al cumplimiento de la ley de Beer, pero en la prctica muchos
sistemas qumicos se apartan de ella. Las causas de estas desviaciones pueden ser qumicas,
fsicas o instrumentales. La ley est enunciada con la condicin de que la radiacin sea
monocromtica, que slo haya procesos de absorcin y que no se modifique la especie qumica
absorbente. Si estas condiciones no se cumplen puede haber desviaciones a la ley. Por
consiguiente:
El haz de luz incidente ha de ser monocromtico. Si es policromtico hay desviaciones a la
ley que dependen del margen de longitudes de onda y de la amplitud de la banda
policromtica.
Para evitar procesos diferentes a la absorcin el haz incidente debe ser perpendicular a la
muestra y las disoluciones han de ser diluidas, homogneas, exentas de turbidez y no
fluorescentes.
La especie absorbente no debe modificar su naturaleza al variar su concentracin. Esta
suele ser la causa ms frecuente de desviaciones a la ley ya que a veces es imposible
mantener estrictamente esta condicin.
Para evitar errores en el anlisis, tambin es muy importante controlar en las disoluciones
diversos parmetros que pueden afectar a las medidas, como son la presencia de posibles
interferentes, el pH del medio, el tipo de disolvente, la temperatura, etc.

Las asociaciones inicas o moleculares, la disociacin de complejos y cidos poco estables, la
solvatacin de especies, etc., pueden ocasionar desviaciones aparentes a la ley de Beer (Burriel et
al, 2008).

3.5. Curva de calibracin (estndar)

La preparacin de una recta de calibrado permite relacionar el valor de la absorbancia del analito
con su concentracin. En primer lugar, se elige la longitud de onda ms adecuada para realizar las
medidas que correspondern a un mximo de absorbancia. A continuacin, se mide en el
espectrofotmetro la absorbancia de disoluciones patrn del analito con concentraciones
crecientes y conocidas. Estas disoluciones deben tener unas caractersticas similares a la
disolucin problema de la muestra que se quiere analizar. (Sierra, 2009)

Para obtener la recta de calibrado, se procede a representar los valores obtenidos de absorbancia
frente a la concentracin de las disoluciones patrn, ajustndose los valores experimentales
obtenidos, mediante el mtodo de los mnimos cuadrados, a una lnea recta (Sierra, 2009).

Si el compuesto a analizar se encuentra en una matriz compleja en la que otros componentes
absorben a la misma longitud de onda, es posible recurrir a una reaccin de derivatizacin
mediante la cual se transforma el analito, de manera especfica y total, en un derivado que
presenta absorcin en una regin del espectro libre de cualquier interferencia por efecto de la
matriz (Sierra, 2009).

3.6. Determinacin de azcares reductores por el mtodo del DNS

El mtodo del DNS se basa en la reduccin del cido 3,5 dinitrosaliclico (amarillo) a cido 3-amino,
5-nitrosaliclico (rojo) por el grupo carbonilo libre de los azcares reductores. El complejo formado
es medido espectrofotomtricamente a 550nm, siendo la densidad ptica proporcional a la
concentracin de azcares reductores (Bello et al, 2006).
No se recomienda utilizar este mtodo para la determinacin de azcares reductores en muestras
intensamente coloreadas como mieles y caldos de fermentacin que la contengan. Estudios de
Otero y colaboradores muestran dispersin en la determinacin de azcares reductores en mieles
por el mtodo del DNS (Bello et al, 2006).

3.7. Nctar

El contenido de azcares reductores en el nctar est determinado por el promedio del aporte que
realiza cada fruta que lo constituye (Camacho, 1992).

Cuadro N1: Contenido porcentual de azcares reductores de algunas variedades de durazno.
Variedad
Azcares reductores
(%)
Promedio (%)
Okinawa 2.155
2.136 Amarillo Rojo Moqueguano 2.131
Blanquillo 2.123
Fuente: Lazo (1973)
En el Cuadro se presentan los contenidos porcentuales de azcares reductores de 3 variedades de
durazno: Okinawa, Amarillo-Rojo Moqueguano y Blanquillo.
Cuadro N2: Composicin en azcares reductores y no reductores de la pulpa de durazno.
Azcares reductores
Azcares no
reductores
Fruta Glucosa Fructosa Sacarosa
Durazno 1.5 % 0.9 % 6.7 %
Fuente: Gil (2010)
En el Cuadro se muestra la composicin en azcares de la pulpa de durazno. Se observa que esta
contiene un 2,4% de azcares reductores (1.5% de glucosa y 0.9% de fructosa) y un 6.7% de
sacarosa (azcar no reductor).

Durante el tratamiento y almacenamiento de los zumos se va hidrolizando la sacarosa en azcares
reductores: glucosa y fructosa. Cuando la sacarosa se hidroliza el sabor dulce aumenta porque los
monosacridos (glucosa y fructosa) libres aportan ms dulzor que la sacarosa (Gil, 2010).

3.8. Miel de abeja

Factores adicionales de composicin y calidad
La miel podr tener los siguientes factores de composicin y calidad:

i. Contenido de azcares

Contenido aparente de azcar reductor
Calculado como azcar invertido:
a) Mieles no indicadas a continuacin no menos de 65g/100g.
b) Miel de mielada, mezclas de miel de mielada con miel de flores no menos de
45g/100gr.
c) "Grass Tree" no menos de 53g/100g.
(Xanthorrhoea preissii)

ii. Mtodos de anlisis

Determinacin del contenido de azcar reductor

Principio del mtodo
El mtodo es una modificacin del procedimiento de Lane y Eynon (1923) que
consiste en reducir la modificacin de Soxhlet de la solucin de Fehling titulndola,
al punto de ebullicin, con una solucin de los azcares reductores de la miel,
utilizando azul de metileno como indicador interno.
Para lograr la mxima exactitud en este tipo de determinacin es preciso que la
reduccin de la solucin de Fehling se realice a volumen constante durante el
proceso de normalizacin y en la determinacin de los azcares reductores en la
solucin de miel. Por tanto, es esencial proceder a una titulacin preliminar para
determinar el volumen de agua que debe aadirse antes de realizar las
determinaciones (Codex, 1981).

Fuente: (Codex, 1981)
Tabla 1. Composicin fisicoqumica de mieles de erica (M. favosa) y guanota (M. compressipes) de
Venezuela. Se presentan medias y (desviacin estndar) entre parntesis.
Tipo de mieles
Erica Erica comercial Guanota Guanota
comercial
Azucares
reductores
(g/100g de
miel)
75.20 (

70.73 (

75.06 (

71.39 (


Mtodo: el mtodo de Lane y Eynon, segn se indica en la norma COVENIN (1984a).
Fuente: (Vit; 2008)

3.9. Mermelada de fresa
En el etiquetado de la mermelada de fresa el contenido de azucares es de 6.8gr de
azcar en 10gr de mermelada.
IV. Resultados y Discusiones

a. Curva estndar
Cuadro N3: Datos experimentales para la elaboracin de la curva estndar
Concentracin
(g/ml)
Absorbancia Absorbancia
promedio Lectura 1 Lectura 2
5.6x10
-4
0.104 0.101 0.1025
7.2x10
-4
0.150 0.133 0.1415
8.8x10
-4
0.185 0.177 0.1810
11.6x10
-4
0.266 0.248 0.2570
14.4x10
-4
0.393 0.313 0.3530
17.6x10
-4
0.448 0.495 0.4715

Figura N6: Curva estndar

En la Figura se muestra la curva de calibracin obtenida por regresin lineal a partir de la relacin
entre la concentracin conocida de los estndares de glucosa anhidra y sus respectivas
absorbancias (ver Cuadro) medidas a una longitud de onda de 550nm.
Cuadro N4: Resultados del anlisis espectrofotomtrico.
Muestra Dilucin A 1 A 2
Absorbanci
a promedio
Concentraci
n
(g/ml)
y = 0.0032x + 0.0003
R = 0.9926
0
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0.001
0.0012
0.0014
0.0016
0.0018
0.002
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

(
g
/
m
l
)


Absorbancia
Series1
Linear (Series1)
Mermelada de fresa
Gloria
0.0032 g/ml 0.444 0.289 0.3665 1.4728x10
-3

Miel de abeja 0.0022 g/ml 0.435 0.480 0.4575 1.764x10
-3

Nctar de durazno
Frugos
0.05 ml/ml 0.154 0.146 0.15 0.78x10
-3


(a) Conversiones Usadas

o En 1ml de dilucin hay 0,0032g de mermelada









o En 1ml de dilucin hay 0,0022g de miel de abeja






Para la mermelada de fresa

De acuerdo al etiqueta de la mermelada, esta contiene 6.8 gr de azcar (glucosa
+fructosa) en 10gr de mermelada, lo cual equivale a una concentracin de 0.68 gr de
azcar/gr de mermelada o 68% de azucares reductores. En la determinacin del
laboratorio la concentracin es de 1.5 x10
-3
gr/ml, lo que equivale a 4.6 gr de azcar en 10
gr de mermelada. La concentracin sali ms baja de lo especificado en el empaque, ello
pudo deberse a un mal manejo de la muestra o que el producto contiene menos azucares
que lo especifica en la etiqueta; y para comprobar ello se podra hacer un nuevo anlisis.

Para la miel de abeja

Por lo que la concentracin de azucares reductores en la miel de abeja es 80g de
azcar/100g de miel; comparando los resultados obtenidos con los del marco terico segn
CODEX STAN 12-1981 la cantidad de azucares reductores no debe ser menos que
65g/100g ; por lo cual se acepta el resultado obtenido; (segn Vit, 2008) en tres tipos de
miel (Erica 75.20 ( Erica comercial 70.73 ( ; Guanota 75.06 (
Guanota comercial 71.39 ( ) la concentracin obtenida se encuentra
muy cercana a estos ; si bien se debe tener en cuenta tres componentes principales para
un correcto anlisis de la miel los cuales son : actividad antimicrobiana, composicin
fisicoqumica y recursos florales de los que proviene. Con los cuales se podr obtener una
mayor exactitud de los resultados. Tambin se debe tomar en que el mtodo empleado
usado para la comparacin con el marco terico; en el laboratorio se emple el mtodo del
DNS a diferencia del mtodo que usan los autores citados (CODEX STAN 12-1981: El
mtodo modificado del procedimiento de Lane y Eynon (1923); Vit; 2008 el mtodo de
Lane y Eynon).

Para el nctar de durazno

De acuerdo al etiquetado del envase, el nctar de durazno Frugos contiene 30 g de
azcar (sacarosa) por porcin de 240 ml, que equivale a una concentracin de 0.125g/ml.
Segn Camacho (1992), el contenido de azcares reductores del nctar est determinado
por el aporte que realiza la fruta que lo constituye. La pulpa de durazno contiene 2.4%
segn Gil (2010) de azcares reductores y 2.136% segn Lazo (1973). Gil (2010) adems
afirma que durante el tratamiento de la pulpa, parte de la sacarosa se hidroliza en azcares
reductores tales como glucosa y fructosa. De acuerdo a lo afirmado, el contenido de
azcares reductores del nctar de durazno proviene de la fraccin aportada por el durazno
y por la fraccin de sacarosa que se hidroliza durante su elaboracin.

V. Conclusiones

El contenido de azcares reductores del nctar est determinado por la fraccin que aporta
la fruta y por la fraccin de sacarosa que se hidroliza durante su elaboracin.

Los resultados obtenidos para la miel de abeja nos indican que esta tiene un alto contenido
de azucares reductores.

El contenido de azcar en la mermelada resulto ser inferior a lo especificado en el
etiquetado en la determinacin.

VI. Bibliografa

CAMACHO G. 1992. Uso de las pulpas de frutas. Memorias del curso Obtencin y control
de calidad de pulpas de pulpas de frutas. ICTA, Univ. Nacional de Colombia. Bogot.
Disponible en: <http://www.virtual.unal.edu.com>
Codex Stan 12-1981; Codex norma para la miel
www.codexalimentarius.org/input/download/standards/310/cxs_012s.pdf
BELLO D.; CARRERA E. y DAZ Y. Determinacin de azcares reductores totales en jugos
mezclados de caa de azcar utilizando el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. ICIDCA.
Sobre los Derivados de la Caa de Azcar [en lnea] 2006, XL (Mayo-Agosto). Disponible
en:<http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664006> ISSN 0138-6204
BURRIEL F.; LUCENA F.; SIRO J. y HERNNDEZ J. 2008. Qumica Analtica Cualitativa.
18
va
edicin. Editorial Paraninfo S.A. Madrid (Espaa).
GIL A. 2010. Tratado de Nutricin: Composicin y Calidad Nutritiva de los Alimentos. 2
da

edicin. Editorial Mdica Panamericana. Madrid.
Kirk et al. 1996. Composicin y Anlisis de Alimentos de Pearson. Segunda edicin.
Compaa Editorial Continental, S.A. de C.V. Mxico.
LAZO R. 1973. Elaboracin de pulpas y nctares de durazno (Prunus persica). Tesis para
optar por el ttulo de Ingeniero en Industrias Alimentarias. UNALM, Per.
SIERRA I.; PREZ D.; GMEZ S. y MORANTE S. 2009. Anlisis Instrumental. Editorial
Netbiblo S.L. Espaa.
Vit Patricia 2008; la miel precolombina de abejas sin aguijn (meliponini), an no tiene
normas de calidad www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/26436/1/miel-precolombina.pdf