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Breve historia del Microscopio

1608 Z. Jansen construye un microscopio con dos lentes


convergentes.
1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio
compuesto.
1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes
de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l
llam "clulas". Publica su libro Micrographia
1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios.
Observar bacterias por primera vez 9 aos despus.
1683 Leeuwenhoek observa bacterias por primera vez.
1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada.
1833 Brown publica sus observaciones microscpicas de orqudeas y describe claramente el
ncleo de la clula.
1849 J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio.
1838 Schleiden y Schwann proponen la teora de la clula y declaran que la clula
nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.
1857 Kolliker describe las mitocondrias en clulas del msculo.
1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el
microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio.
1879 Flemming describe con gran claridad el comportamiento de los cromosomas durante
la mitosis en clulas animales.
1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha sido
superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos dcadas l, Cajal y otros
histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y ponen los fundamentos de la anatoma
microscpica.
1882 Koch usa tinte de anilina para teir microorganismos e
identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. En las
siguientes dos dcadas, otros bacterilogos, como Klebs y Pasteur
identificarn a los agentes causativos de muchas otras enfermedades
examinando preparaciones teidas bajo el microscopio.
1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, diseo de Abb que
permiten al microscopista resolver estructuras en los lmites tericos
de la luz visible.
1898 Golgi ve y describe por primera vez el aparato de Golgi
tiendo clulas con nitrato de plata.
1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
1924 Lacassagne y colaboradores desarrollan el primer mtodo autoradiogrfico para
localizar polonium radiactivo en espcimenes biolgicos.
1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia.
1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio
electrnico.
1941 Coombs usa anticuerpos acoplados a tintes fluorescentes para estudiar antgenos
celulares.
1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para
el microscopio de luz.
1981 Aparece el microscopio de efecto tnel (MET).


El Microscopio

Hay dos grandes problemas que dificultan la observacin de las microestruturas biolgicas: las
pequeas dimensiones de las clulas y de sus organelas y su transparencia a la luz visible, lo
cual tiene como consecuencia inmediata la falta de contraste entre las diferentes estructuras y
entre estas y el propio medio que las rodea. Para superar el primer problema, se construyeron y
se perfeccionaron instrumentos capaces de aumentar significativamente las imgenes, revelando
los pormenores de las estructuras (microscopios); para resolver el segundo problema, se
desarrollaron tcnicas, fundamentalmente del tipo de las tinciones, que permitan aumentar el
contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su entorno, hacindolas claramente
visibles y diferenciables. (Nuno G. Dias)

Microscopio, del griego: "mikro" = pequeo y "scope" = mirar (para mirar cosas pequeas)
Un microscopio es un instrumento ptico compuesto de varias lentes que sirve para observar
objetos muy pequeos. En el microscopio electrnico, los rayos luminosos del microscopio
convencional son reemplazados por un haz de electrones (el aumento puede alcanzar en este
caso hasta 100 veces el del microscopio convencional).
Aunque la existencia de criaturas demasiado pequeas para ser vistas con el
ojo haba sido sospechada desde tiempo atrs, su descubrimiento real est
ligado a la invencin del microscopio.
La primera persona que vio los microorganismos con algn detalle fue el
constructor de microscopios aficionado Antoni van Leeuwenhoek (1632-
1723); este holands us microscopios simples construidos por l mismo (se
dedicaba a pulir lentes para fabricar sus microscopios que, como mucho,
alcanzaran unos 300 aumentos). En 1677 escribe una carta a la
Philosophical Transactions of the Royal Society of London en la que
comunicaba sus recientes observaciones con los microscopios de su
fabricacin.
Desde ese momento, el microscopio ptico se ha transformado en uno de los
medios ms importantes para el diagnstico de las infecciones. Aun hoy, a pesar del nfasis en
los mtodos rpidos de diagnstico, muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o
reactivos inmunolgicos, la simple observacin visual de la muestra clnica obtenida de un
paciente es la forma ms rpida y especfica de apoyar el diagnstico clnico realizado por el
mdico.
Muchos agentes infecciosos pueden ser identificados en forma fiable con slo unas pocas
coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual mas
eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de una infeccin bacteriana.
Por definicin, toda la informacin y los conocimientos relacionados con el microscopio son
piedra angular en el estudio de la microbiologa. (imagen superior: El primer microscopio de
Leeuwenhoek)









El microscopio ptico compuesto

El microscopio compuesto, que se ha
hecho de uso general a partir de
mediados del siglo XIX y que fue de
importancia crucial para la evolucin de
la microbiologa como ciencia, es todava,
con ciertas variaciones, el principal apoyo
de la investigacin microbiolgica
rutinaria.
Este tipo de microscopio est formado
bsicamente por una parte mecnica y
una parte ptica y es capaz de conseguir
aumentos considerablemente mayores
que el microscopio construido con una
sola lente. Este ltimo, llamado
microscopio simple, se usa
principalmente en el formato de lupa.
Los elementos mecnicos bsicos son el
pie (7), que es el soporte del
microscopio, la columna (3), en la que
se apoyan las restantes piezas, el tubo, que es el elemento de unin entre el ocular y el
revlver (pieza giratoria que soporta los objetivos), la platina, sobre la que se apoya la
preparacin a observar, y los tornillos Micromtrico y Macromtrico que se utilizan para
enfocar la preparacin (el primero es de pequeo recorrido, para movimientos de pequea
amplitud, y el segundo de largo recorrido, para movimientos de gran amplitud.
En cuanto a la parte ptica, un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el
objetivo (4), situado cerca del objeto que se observa, proyecta una imagen ampliada del objeto
observado en direccin al ocular (1), que est colocado cerca del ojo y acta, a modo de lupa,
ampliando la imagen que produce el objetivo, y el condensador (5), cuya misin es concentrar
la luz sobre la preparacin y permitir manipular su intensidad.
La ampliacin total aportada por el conjunto objetivo-ocular es igual al producto de multiplicar la
capacidad de aumento del objetivo por la del ocular; as: la mayor parte de los microscopios
usados en microbiologa tienen oculares de diez aumentos (abreviadamente, x10) y objetivos de
aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total, x100), x40 (total, x400), y x90 x100
(objetivos de inmersin en aceite; x900 x1000 total).
Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la
preparacin buscando objetos de inters, el objetivo de 40
aumentos permite la observacin detallada de los
microorganismos grandes tales como algas, protozoos y
hongos, y los objetivos de 90 100 aumentos se emplean
para ver las bacterias y los pequeos microorganismos
eucariotas.
Adems del aumento, una propiedad importante de un
microscopio es su poder resolutivo. Este es la capacidad de mostrar distintos y separados dos
puntos muy cercanos; y por tanto, cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la
definicin con que podremos observar un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son
especialmente buenos para ver pequeas estructuras.
El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la
longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente
conocida como apertura numrica. Como la longitud de onda
habitualmente est fijada, la resolucin de un objeto es funcin
de la apertura numrica; cuanto mayor sea la apertura, el
objeto resuelto ser ms pequeo. Hay una correspondencia
aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura
numrica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos
habitualmente tendrn mayores aperturas numricas. (El valor
de la apertura est marcado al lado de la lente)
El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de
considerable importancia, especialmente cuando se utilizan
grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe
enfocarse sobre la preparacin para que la imagen se traslade
de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad
posible al ojo del observador a travs del ocular. En los microscopios antiguos, la fuente de luz
era externa, y se utilizaba un espejo, situado en el propio microscopio, para reflejar esa luz
externa hacia la preparacin y los objetivos. Actualmente se utiliza un sistema de lentes,
incorporado al propio microscopio, llamado condensador (5). Elevando o bajando el condensador
puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El
condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo de luz que
pasa por el sistema.
Lo que se busca con este diafragma iris no es
controlar la intensidad de la luz que alcanza el
objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el
sistema condensador ocupe justamente el objetivo.
Si el diafragma iris es demasiado grande, parte de la
luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor
de l, y no se utilizar. Si la luz es demasiado
brillante, no deber reducirse alterando la posicin
del condensador o del diafragma iris sino usando
filtros de neutralizacin, o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente
en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopa, especialmente a los
mayores aumentos.
Los tornillos macro/micromtrico (2) estn engarzados con la platina que soporta las muestras
por medio de un mecanismo de cremallera y se utilizan para subir y bajar dicha platina
(acercarla o alejarla del objetivo) con el fin de enfocar la imagen que se forma en el ocular. El
tornillo macromtrico maneja un engranaje de paso largo, diseado para efectuar movimientos
de gran amplitud y largo recorrido, mientras el tornillo micromtrico controla un engranaje de
paso corto, especial para movimientos de pequea amplitud y pequeo recorrido y se utiliza
para el enfoque fino de la imagen.



Mi croscop a
Gal er a de i mgenes > Mi croscop a pt i ca


Staphylococcus aureus


Streptococcus beta
hemoltico


Escherichia coli





Clostridium perfringens


Mycobacterium tuberculosis


Strepcococcus pneumoniae




Salmonella typhi


Aspergillus nidulans


Aspergillus niger




Candida albicans


Brucella abortus


Bordetella pertussis




Clostridium tetani


Haemophylus ducreyi


Mycoplasma pneumoniae




Leptospira spp.


Mucor circenelloides






Microscopio electrnico

Para estudiar la estructura interna de los
procariotas es esencial el uso del
microscopio electrnico. En este
microscopio se utilizan electrones en vez de
rayos de luz, y como lentes funcionan unos
electroimanes. Cuando los electrones pasan
a travs de la preparacin algunos son
difractados creando entonces una imagen
que se hace visible en una pantalla sensible
a los electrones. La longitud de onda de la
radiacin de los electrones es mucho ms
pequea que la de la luz visible y, como el
poder resolutivo de un microscopio es
inversamente proporcional a la longitud de
onda utilizada, la resolucin obtenida con el
microscopio electrnico es mucho mayor
que la conseguida con el microscopio
ptico.
Mientras que con el microscopio ptico
ordinario o el de contraste de fases las
estructuras ms pequeas que pueden
observarse tienen unos 0,2 m, con el
microscopio electrnico pueden verse
fcilmente objetos de 0,001 m. Con el
microscopio electrnico es posible ver muchas sustancias incluso de tamao molecular. Sin
embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy
delgados: si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es
demasiado gruesa para ser observada directamente.
Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas
especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y
deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente
orgnico. Despus de la deshidratacin, la muestra es incluida en plstico y en este plstico se
cortan secciones finas utilizando un ultramicrtomo, por lo general equipado con una cuchilla de
diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy
finas, que son examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener
suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia
electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales
estn compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los
electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan un contraste
muy aumentado y; por tanto, se ven mejor.
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin negativa. Se aplica
el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio ptico. Se utiliza una sustancia que
no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas ms
comnmente utilizadas en la microscopia electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico
(fosfotngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono
evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se adapta a los
contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada
para poder observarse directamente al microscopio electrnico.
Otra tcnica de la microscopa electrnica recientemente desarrollada es la de criocorrosin que
evita la formacin de artefactos al eliminar la fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a
examinarse es congelada sin tratamiento qumico, y el bloque congelado se corta con una
cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las clulas. Se
hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose observar
estructuras superficiales o internas de las clulas. La mayora de las estructuras celulares vistas
en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en material
congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.





Mi croscop a
Gal er a de i mgenes > Mi croscop a el ectr ni ca



Staphylococcus
aureus


Streptococcus beta
hemoltico


Escherichia coli



Clostridium
perfringens


Mycobacterium
tuberculosis


Strepcococcus
pneumoniae



Salmonella typhi


Aspergillus niger


Candida albicans



Brucella abortus


Bordetella pertussis


Clostridium tetani





Mycoplasma


Leptospira spp.
Haemophylus ducreyi pneumoniae



Pseudomona
aeruginosa


Klebsiella pneumoniae





Otros microscopios



El microscopio de contraste de fases:
Hace posible visualizar fcilmente pequeas clulas incluso sin teir. Las clulas tienen un ndice
de refraccin distinto del medio que las rodea, y esta diferencia puede utilizarse para crear una
imagen de mucho mayor contraste que el que puede obtenerse con el microscopio ptico
normal. La microscopia de contraste de fases hace posible observar clulas en estado vivo ms
fcilmente, ayudndonos as a evitar la creacin de condiciones artificiales tales como las
introducidas por la tincin (aparicin de artefactos que interfieren con la correcta visin y
alteracin de las estructuras naturales de las clula). En muchos laboratorios de bacteriologa, el
microscopio de contraste de fases ha reemplazado prcticamente el microscopio ptico comn
como instrumento de investigacin.
Esta tcnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares introducen pequeas
variaciones de fase en las radiaciones, retrasndolas ligeramente, siendo estos retrasos
diferentes segn el tipo de estructura. Con este microscopio, el bajo contraste existente se
refuerza por medio de un sistema ptico especial, que transforma las diferencias de fase, que no
son captadas por el ojo humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que s son
detectables.

El microscopio de campo oscuro:
Se le llama tambin ultramicroscopio y es un
microscopio ptico ordinario cuyo sistema
condensador ha sido modificado para dirigir
la luz a la preparacin desde los lados, de tal
modo que slo la luz difractada por la
preparacin pasa al ocular y se hace visible.
A causa de esta disposicin, la muestra
aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
La microscopa de campo oscuro hace posible la observacin en estado vivo de partculas y
clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de resolucin del microscopio
ptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha
sido ampliamente usada en el estudio de pequeas clulas mviles tales como Treponema
pallidum, la espiroqueta causante de la sfilis, que es invisible con la microscopa ptica
ordinaria.

El microscopio de fluorescencia:
Algunos colorantes denominados fluorocromos
tienen la propiedad de ser excitados (pasar a
un nivel superior de energa) cuando absorben
luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
A medida que las molculas excitadas regresan
a su estado normal liberan el exceso de energa
en forma de luz visible de mayor longitud de
onda que la radiacin excitante. Esta propiedad
se denomina fluorescencia. Se han desarrollado
mtodos microscpicos modernos que aprovechan la mayor deteccin que posibilita este
sistema.
Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones ultra-violeta, en el
lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de de la misma forma en
que lo hace un microscopio ptico comn. Las lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio
absorbe la radiacin ultra-violeta. A continuacin del objetivo lleva unos filtros que retienen la
radiacin ultra-violeta, que es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la
radiacin visible, que no es peligrosa.
Hoy da se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba
del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la longitud de onda deseada para
excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo protege al ojo del observador de la
radiacin fluorescente. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un
fondo oscuro, segn el color del colorante usad
El microscopio invertido:
En el laboratorio de virologa se utiliza muchsimo el microscopio
invertido que no es ms que una variante del microscopio
convencional que, tal y como indica su nombre, tiene invertida la
posicin normal de los objetivos, que estn, en el revlver, por
debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminacin,
a travs del condensador y del diafragma, llega desde encima de la
platina, lo que facilita cierto tipo de trabajos como el control del
estado de las monocapas celulares cuando se trabaja con botellas o
tubos de cultivo