Métodos Rápidos

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MTODOS RPIDOS PARA ANALISE

MICROBIOLOGICA DE ALIMENTOS
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2
- Tcnica de epifluorescncia em filtros;
- Tcnica de filtrao em membranas de grade
hidrofbica
-Reidratao de filmes secos
-Mtodo de Redigel
-Mtodo Simplate
-Mtodos fsicos, imunolgicos e qumicos
3
TCNICA DE EPIFLUORESCNCIA DIRETA EM FILTROS (TEDF)
Amostra de alimento diludo - filtra em membrana de
nylon de 5 m filtrado tratado com Triton X 100 e tripsina
(lise de clulas) filtra em membrana de policarbonato de
0,6 m o filtro corado c/ laranja de acridina contagem
de clulas em microscpio de fluorescncia.
Resultados em 25 a 30 minutos.
Uso: contagem de bactrias gram + e gram no leite
Estimar nmero de microrg em carnes e aves
4
MEMBRANA FILTRANTE COM GRADE HIDROFBICA
-Filtro especial com 1600
compartimentos de cera em
uma membrana;
-Deteco - mnimo 10 clulas/g;
Resultado em NMP
-Resultados em 24 horas ou menos;
-O filtro colocado sobre um gar apropriado;
-Uso especificamente para microg. Indicadores, fungos,
Pseudomonas e Salmonelas.
Membranas Isogrid usa o gar SD-39.
Isogri
d
5
Membrana Noegrid
6
Procedimento de filtrao
Sistema de filtrao
Coloca-se a membrana
Ajuste do filtro
Adio do diluente
1)
2)
3)
4)
5)
7
6)
Adio da amostra
7)
Aplica-se o vcuo
8)
Remove-se a membrana
E coloca-se em meio gar
adequado
8
Bactrias totais
leveduras
Salmonella
9
Sistema Isogrid
10
PETRIFILME 3M Reidratao de filmes secos
-2 filmes plsticos (polipropileno e polietileno) unidos
por um lado, um dos filmes coberto com meio de cultura
onde adiciona-se a 1 mL amostra diluda.;
-Aps incubao (24 h) aparecem mi crocol nias
vermelhas
Deteco de coliformes totais e E.coli. Contagem
bactrias aerbias
11
Coliformes totais e fecais em Petrifilm EC
12
A faixa de contagem de 15 a 150
Contagem de E.coli = 13
Contagem de Coliformes Totais = 28
incontveis
13
Contagem de
Coliformes Totais = 3
Coliformes Totais = 69
(colnias com gs).
14
Contagem de Aerbios colnias vermelhas
Contagem de coliformes colnias vermelhas com gs
Contagem de E. coli colnias azuis com gs
Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azul
esverdeada;
Bolores = colnias grandes , colorao variada.
PETRIFILME 3M - USOS
15
Silva et al., (2006) Avaliao do padro coliformes a 45C e comparao da eficincia
das tcnicas dos tubos mltiplos e Petrifilm EC na deteco de coliformes totais e
Escherichia coli em alimentos
Amostras de lingia
Coliformes a 45C
tubos mltiplos (NMP/g) Petrifilm E. coli (UFC/g)
18 9,0.10
2
1,0.10
4
42 1,1.10
3
1,6.10
4
37 2,8.10
3
6,0.10
3
38 7,0.10
2
1,3.10
4
45 2,3.10
3
1,4.10
4
39 3,0.10
2
1,2.10
4
4 Ausente 1,0.10
5
14 Ausente 2,0.10
4
15 Ausente 2,0.10
4
47 Ausente 3,7.10
4
48 Ausente 2,8.10
4
25 Ausente 7,3.10
3
26 Ausente 6,0.10
3
16
REDIGEL
-O meio (no contem gar- pectinato de clcio) misturado
com alimentos diludos ;
-Deixado em repouso por 30 minutos ;
-Incubados por tempo e temperaturas adequados ;
-Atrativo para microrg. psicotrficos - sensvel ao calor
Usado para a contagem de coliformes totais
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MTODOSIMPLATE
- Baseado na atividade de enzimas comuns em microrganismos de
origem alimentar;
-O meio contm substratos que so hidrolisados pelas enzimas;
-Libera um composto fluorescente visvel em luz UV;
-- possui 84 ou 198 poos de incubao
-mesfilos totais e Coliformes 35 C/24h
-Bolores e leveduras 25C/72h
-Pode ser usado C. jejuni
-Conta o numero de cavidades positivas
-e converte para NMP
18
MTODOSIMPLATE
C jejuni 48 h
24 h
Microrg. totais, 24 h
Leveduras
56 a 72h
19
N. de cavidades positivas = NMP/mL ou g
1= 2
2=4
3=6
4=8
.
..
.
.
.
50 =150
.
.
.
.
83 =738
84 >738
20
MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA
IMPEDNCIA-CONDUTNCIA
(impedncia(Ohms) relao entre diferena de potencial (U emVolts) entre
os terminais de um determinado Circuito eltrico dividido pela corrente eltrica
(amperes)
Condutncia inverso da resistnciaeltrica
- Baseado na alterao da corrente eltrica do meio
devido a atividade metablica de microrganismos;
- Bactometer instrumento que mede mudanas de
condutncia;
A quantidade de microrganismos presentes definida pela
determinao do TEMPO DE DETECO tempo para que a
curva de impedncia comece a se elevar- em conc de 10
6
-
10
7
/mL
Ex: detecta coliformes em carnes 10
3
/g em 6,5 h
21
BACTOMETER
64 a 512 AMOSTRAS
Mtodo convencional Bactometer
Contagem total 48 hrs. 6-24 hrs.
Coliformes 24 hrs. 6-14 hrs.
Leveduras e mofos 5 dias 24-48 hrs.
Bactrias lcticas 3-5 dias 24-48 hrs.
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MICROCALORIMETRIA
- Baseado na gerao DE CALOR durante a multiplicao
dos microrganismos;
- O calor produzido proporcional quantidade de
microrganismos presentes na amostra;
- Estimar bactrias em carne moda, estudo da
deteriorao em alimentos enlatados.
-Carne moda com 10
5
a 10
8
UFC/g gerao de calor
com 24 hs.
-S. aureus em 2 hs com 10
7
a 10
8
UFC/g.
MTODOS FSICOS CONTAGEM INDIRETA
23
Aparelho de Calvet
Sensvel a um fluxo de calor
De 0,01 cal/h para uma amostra
De 10 mL.
24
Estudos do efeito de
agentes antifngicos
em
Microrganismos
atravs da
microcalorimetria
(Montanari et al.,
1993)
25
CITOMETRIA DE FLUXO
MTODOS FSICOS
- Mede componentes e propriedades de clulas
individuais (fluorescncia, absorbncia ou disperso da
luz) em uma suspenso lquida.
-Utiliza fontes como argnio, criptnio ou laser e
corantes fluorescentes.
- Deteco de S. typhimurium em ovos e leite em 40 min-
sensibilidade de 10
3
/mL.
26
MTODOS QUMICOS
SUBSTRATOS FLUOROGNICOS
- Substrato adicionado nos meio de placas, NMP e em
mtodos de filtrao em membranas;
- O substrato fluorognico libera um composto
fluorescente detectado por luz ultravioleta
Substrato MUG (4-metilumbeliferil--D-glucurondeo) por
ao de B-D glucuronidase libera o composto
fluorescente 4-metilumbeliferil;
- Usado para a determinao de E. coli;
-Tempo de deteco varia entre 4-16 horas;
27
SUBSTRATO CROMOGNICO
- ONPG o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo hidrlise pela -
galactosidase- produz cor amarela deteco a 420 nm.
Mnimo de 10
7
clulas.
Azul E.coli
Transparente - coliformes
Meios cromognicos em placas
28
Prpura salmonela
Azul - enterobacter
Meio - Salmonella Chromogenic CM1007
29
Mtodo COLITAG (Hexis cientfica) substrato cromognico
ONPG-MUG
deteco de coliformes totais e E.coli em gua
Incubao a 35-37 C por 24 horas.
Mudana de cor- amarelo - +para coliformes totais
365 nm UV se apresenta fluorescncia positivo
p/ E. coli ausncia de fluorescncia negativo p/ E.coli
30
MTODOS IMUNOLGICOS
Baseados em reaes entre antgenos e anticorpos
especficos.
Em microbiologia de alimentos:
Imunocaptura;
Imunoenzimtico;
Imunofluorescncia.
Sondas de DNA Mtodo molecular
31
TCNICA DE IMUNOCAPTURA OU IMUNOSSEPARAO
MAGNTICA isolamento de um microrganismo especfico
- Baseia-se na capaci dade do microrgani smo aderir
superfcie de partculas metlicas magnticas revestidas de
anticorpos especficos.
-As partculas so colocadas em suporte que contm um m;
-O material concentrado pode ser usado para plaqueamento;
-Apli cao : Listeria monocytogenes, Salmonell a spp., toxina
do Clostridium perfringens.
-Incubao at 24 horas.
32
TCNICA IMUNOENZIMTICA
-Baseado na reao entre um antgeno (PATGENO
PROCURADO) com um anticorpo especfico, sendo um deles
marcado com uma enzima.
- O antgeno ou anticorpo esto aderidos superfcie de uma
matriz slida (poliestireno)
- A quantidade de enzima presente identificada por reao
colorimtrica com o substrato da enzima;
-Ampl amente usada para detectar e quantificar
microrganismos em alimentos
-Usados para Salmonella, Listeria, aflatoxinas, enterotoxinas
de S. Aureus
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ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) um teste imunoenzimtico
que permite a deteco de anticorpos especficos
Microplacas para teste ELISA
Contendo anticorpos
Anti-bactria - Os anticorpos possuem Enzimas que reagem com substratos
Produzindo compostos fluorescentes que sero visualizados no leitor de
Placas ELISA
34
Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA
substrato
(incolor)
Ac marcados
com Enzimas
+
+ = COR
Microrg
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
35
Leitora de placas
ELISA
36
- A presena do PATGENO detectada pela ligao um
anticorpo marcado com um composto flourescente;
TCNICA DE IMUNOFLUORESCNCIA
- Observao em microscpio de fluorescncia
- Usado amplamente para a deteco presuntiva de
Salmonellas;
-Resultados falso positivos devido a reaes com outras
bactrias.
37
SONDAS DE DNA
1) Os microrganismos so fixados em um suporte slido
(membrana de celulose, nitrocelulose ou acetato de
celulose) ou em soluo lquida;
-segmentos de DNA de fita simples DO PATGENO DE
INTERESSE, capazes de reconhecer e formar hbridos com
fitas complementares de DNA OU RNA.
-As sondas so marcadas radioativamente ou colorimtricas.
2) Os microrgani smos so tratados para expor seu DNA e
separar em duas fitas simples;
MTODOS GENTICOS
38
3) O suporte colocado na soluo que contm a sonda
gentica;
4) Aps a lavagem, os filtros so revelados por auto-
radiografia ou tcnicas colorimtricas;
Identificao de patognicos com Listeria, Salmonella,
S aureus, E. coli enterotoxignica)
Limite de deteco 10
6
a 10
7
clulas.
C/ 10
8
clulas resultado em 10 a 12 horas.
39
REAO DE POLIMERASE EM CADEIA (PCR) identificao
de microrganismos em alimentos
Permite a multiplicao de um fragmento
de DNA em milhes de cpias em poucas
horas atravs da ao da enzima DNA polimerase;
MTODOS GENTICOS
ETAPAS
-Desnaturao do DNA em fita simples a 95 C por 1 min;
-Ligao dos oligonucleotdeos iniciadores a 37 C por 2 min;
-Polimerizao com formao de fita complementar a 72 C por
3 min;
-Permite 10
5
a 10
6
cpias de cada fragmento do DNA original
40
A amplificao do nmero de cpias de DNA do microg
permite que os testes de hibridizao sejam feitos com maior
eficincia;
Vrios microg. Importantes em alimentos tem sido estudados
por esta tcnica.
41
Equipamento para PCR
42
Amplificao de DNA
43
Cada ciclo envolve as seguintes etapas:
- Desnaturao do DNA e separao da fita simples, feita a 95 C
por 1 min;
-Ligao dos primers a 37 C por 2 min;
-Polimerizao com formao de fita complementar feita a 72 C por
2min;
44
Visualizao de bandas de DNA marcadas com sondas
Radioativas em gel de agarose
45
Anlise comparativa entre microbiologia convencional,
ELISA e PCR para deteco de Salmonella enteritidis,
S. typhimurium, S. gallinarum e S. pullorum em
carne de frango contaminada artificialmente
Elci Lotar Dickel, Laura Beatriz Rodrigues,Luciana Ruschel dos Santos, Stella de
Faria Valle, Fernando Pilotto,Carla
Rodembush, Vera Beatriz Wald,Cludio Wageck Canal, Vladimir Pinheiro do
Nascimento. R. bras. Ci. Vet., v. 12, n. 1/3, p. 5-10, jan./dez. 2005
foram coletadas 30 carcaas de frango em matadouro
de Inspeo Federal. As carcaas foram analisadas - negativas
para Salmonella
Contaminao artificial dos microrganismos
A metodologia utilizada para o isolamento de Salmonella sp.
foi baseada na Portaria no 08 de 23/1/1995 mtodo
convencional
A tcnica de ensaio imunoenzimtico (ELISA) foi realizada
conforme a indicao do fabricante do kit (Salmonella
Imunoensaio Visual (SALVIA)- TECRA).
46
Para a realizao da PCR, o DNA foi extrado
atravs do protocolo de tratamento trmico
Os ciclos constaram de uma desnaturao inicial de 94C por 1
minuto, seguida por 30 ciclos de desnaturao (93C/1 minuto),
anelamento (50C/ 30 segundos) e extenso (72C/1 minuto),
com uma extenso final de 72C por cinco minutos.
As amostras de DNA foram visualizadas por eletroforese sobre
luz ultravioleta.
47
Tabela 1 Resultados obtidos na recuperao de
Salmonella, atravs da Microbiologia Convencional (MC),
ELISA e PCR, em carnes de frango contaminadas
artificialmente. De 300 amostras
Parmetros MC ELISA PCR
Positivos 170a 213b 225b
Porcentagem (%) 56,6 71 75
48
Tabela 2 Resultados obtidos na deteco de Salmonella
typhimurium (ST), S. enteritidis (SE), S. gallinarum (SG) e S.
pullorum (SP), pelo microbiolgico convencional (MC),
ELISA e PCR, em amostras de carne de frango
contaminada artificialmente.
Tcnicas ST SE SP SG
(n=75) (n=75) (n=75) (n=75)
(MC 64 53 19 34
ELISA 72 71 24 46
PCR 71 66 39 49
O mtodo PCR foi mais eficaz
49
Exemplos de Aplicaes da tcnica PCR:
-Pode detectar de 1 a 5 colnias de E. coli em 100 mL de gua;
-Deteco de 1 a 10 colnias de L. monocytogenes;
-Deteco de Vibrio vulnificus em ostras, em 24 horas,
quantidades Inferiores a 10
2
UFC/g
50
CONSIDERAES FINAIS
A Escolha da metodologia a ser adotada depende :
Preciso pretendida;
Custo/tempo da anlise;
Simplicidade;
Treinamento do analista;
Disponibilidade de meios e reagentes;
Assistncia tcnica do fabricante
PR REQUISITO: MICROBIOLOGISTA TREINADO SEMPRE!
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Temas de cada aluno
- Tcnica de filtrao em membranas de grade hidrofbica- Beatriz
-Reidrataode filmes secos- Bianca
-Mtodo Simplate- laila
-Mtodos fsico CITOMETRIA DE FLUXO- erick
-Mtodo cromognico- fernanda
-Mtodo fluorognico- lary
-- Imunocaptura- alane
-Imunoenzimtico Elisa- yara
-- PCR - manuela
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Microbiologia aplicada ao
desenvolvimento de produto novo de
interesse para a indstria de alimentos
Ou aplicao de microbiologia preditiva
PROJETO TERICO PRTICO
GRUPO 3 ALUNOS
-INTRODUO
-OBJETIVO
-METODOLOGIA
-PRODUTO ESPERADO
-REFERNCIAS

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Judul Asli

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MTODOS RPIDOS PARA ANALISE

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