Acta Med Per 23(3) 2006 185

1. Mdi co Onclogo Cl ni co.

. . . Gerente Mdi co Laboratorios Roche.
2. Mdi co Internista Nefrlogo. Profesor de medi cina UNMSM
. . .y Director mdi co de Laboratorios Roche.
Tema de revisin
Genmica y protemica: Un paso ms
F ranklin Aldecoa Bedoya
1
y Carlos Battilana Guanilo
2
Genomics and proteomics: one further step
RESUMEN
I NT RODUC C I N
En el ao 2001 l a humani dad f ue t est i go de un
acontecimiento que acapar la atencin no solamente de
t odos l os medi os de comuni caci n, si no de l as
organi zaci ones ci ent f i cas, gremi os prof esi onal es,
instituciones, etc. La noticia se esparci rpidamente hasta
el ltimo confn del planeta: se haba completado la
secuenciacin del genoma humano
1
. Desde que se inici
el desarrollo de la gentica con Mendel, la influencia de
esta rea fue grande, pero contribuy en los cuidados de
la salud de pocas personas, la mayora no tuvo el beneficio
directo de la gentica
2
. La percepcin que actualmente se
tiene de la genmica es mucho ms ambicioso, ya que
sta descansa en el acceso experimental directo del
genoma total y su aplicacin a condiciones comunes que
incluyen muchos mi l lones de personas en el mundo:
cncer, SI DA, tuberculosis, enfermedad de Parkinson y
de Alzheimer entre otras patologas.
En la presente publicacin pretendemos dar una mirada
muy rpida y superficial a los aspectos que se relacionan
di rect ament e con el desarrol l o de l a genmi ca y
protemica; no podemos abarcar cada uno de los tpicos
en forma completa, porque la cantidad de informacin
en cada una de sus partes es compleja y desbordante.
Iniciamos con una visin histrica de los eventos que
condicionaron la evolucin del conocimiento de los genes
haci a el descubrimi ento de l a estructura del ADN,
acontecimientoque sinduda es una de las piedras angulares
en la rpida y sorprendente secuenciacinde la informacin
gentica de una serie de organismos, hasta llegar al ser
humano. Inmediatamente, incidimos en los procesos
bsicos para generar la informacin gentica y que durante
muchos aos fue el dogma central de l a biolog a
molecular; la simplificacin de estos procesos no es
sencilla y muchos de los aspectos finos no son tomados
en cuenta, por lo cual resultan decididamente incompletos.
La derivacindel conocimientocientficoa la forma aplicada
podr evidenciarse a travs de una somera revisin de
algunas de las principales tecnologas sobre las cuales se
basan actualmente la genmica y protemica, las cuales
apuntan a ser de notabl e uti l idad, cuando al f i nal ,
ABSRACT
El desarrollo de la genmica y protemica descansan sobre los
descubrimientos fundamentales que constituyen hitos histricos
sin los cuales no hubiera sido posible el hallazgo de nuevos
paradigmas, teoras, tecnologa, que han cambiado drsticamente
el enfoque de la ciencia mdica. El descubrimiento de la estructura
del ADN y sus funciones bsicas: replicacin, transcripcin y
traduccin, asociadas a la manipulacin del material gentico
celular a travs de las enzimas de restriccin, ligasas, polimerasas,
secuenciacin de las bases nucleotdicas, nos llevaron a la
ingeniera gentica, el develamiento del genoma humano, la
creacin de nuevas herramientas para el estudio y diagnostico de
las enfermedades, como el PCR (reaccin en cadena de la
polimerasa), microarray, y al mejor entendimiento acerca del
comportamiento de nuestro organismo frente a los medicamentos
(farmacogenmica). Ahora nos toca un reto superior: entender
mejor el comportamiento de las protenas como elementos bsicos
de vida, el alfabeto a travs del cual el DNA genera vida. Estos
nuevos conceptos traen consigo nuevas responsabilidades,
problemas ticos y morales y obviamente la necesidad de una
nueva legislacin para este desarrollo.
Palabras clave: protemica, genmica, geneterapia, biologa
molecular, clonacin.
The de ve l opment of genomi cs and prot eomi cs depends on
fundamental discoveri es that resul ted in new paradigms, theori es
and technologies, that have drastically changed the focus of medical
sci ences. The di scovery of the structure of DNA and the basi c
funct ions of repl i cat ion, transcript ion and transl at ion, associ ated
to the manipulation of cel lular genetic material through restriction
enzymes, ligases, polymerases, nucleotide base sequences, etc., lead
us to genet i c engineering, the disclosure of the human genome,
the creation of new tools for the study of diseases and di agnosis,
such as PCR (Pol ymerase Chain Reaction), microarray technology,
and the better understanding of the behavior of our organism in
rel at i on t o medi cat i on (pharmacogenomi cs). Now we have a
greater chal l enge: to improve our understanding of the behavior
of proteins as basi c el ements, the machinery through whi ch DNA
generates life. These new concepts carry new responsibilities, bring
up et hi cal and moral probl ems and t he need f or appropri at e
l egisl at ion for their development .
Key words: porteomi c, genomi c, genotherapy. mol ecul ar biology,
Cl oni ng.
Acta Med Per 23(3) 2006 186
la experiencia y simplificacin lleven estas tecnologas al
consultorio mdico.
El otro aspecto que enfocamos, es el contexto teraputico:
Cmo influirn los nuevos conocimi entos sobre l as
posibilidades de bsqueda de nuevos lineamientos y blancos
teraputicos?; existen ya algunos nuevos medicamentos que
han roto los moldes tradicionales de enfocar el tratamiento y
a futuro esperamos mayor progreso; pero adems, debemos
entender mejor, qu sucede con la variacin farmacocintica
y farmacodinmica de muchos de los medicamentos que
actualmente disponemos, en el contexto de la variabilidad
gentica de cada persona.
Post eriorment e, abrimos una pequea vent ana para
explorar algunos nuevos conceptos de la protemica, rea
ms reciente y con mayores dificultades por diferentes
razones, muy rpi dament e esbozadas aqu , que
constituyen un verdadero reto para los investigadores
actual es y para aquel l as nuevas generaciones que se
introduzcan en esta importante arista de la biologa. La
funcionalidad de las protenas es ampliamente conocida
por los mdi cos, sin embargo, muchas funciones no
puede ser previ si bl es por l os actual es si st emas de
i nformaci n, debi do a l as di f erent es vari abl es que
condicionan este comportamiento. Finalmente, se registra
una l i st a de l as posi bi l i dades de l a l cance de l a
investigacin genmica a futuro: Qu debemos esperar
en los sigui ent es aos en rel acin al conocimi ento
genmico?, Cul es la orientacin de la investigacin
ci ent f i ca?, Cmo i nf l uenci ar sobre l os aspectos
biolgicos, en la salud y en la sociedad?; preguntas que
obviamente solo el tiempo podr determinar.
BASES MOL E CUL ARES DE L A GEN TI CA
1. Los hitos histricos ms importantes del ADN
Juan Gregorio Mendel, un monje agustino alemn (1822-
1884) es el padre de la gentica. Utilizando el Pisumsativum
o guisante de color hizo probablemente la contribucin
ms grande de la iglesia a la ciencia. La planta elegida por
Mendel se autofecunda obligatoriamente, y su polen, en
condiciones normales, no puede alcanzar el estigma de
otra flor. Sin embargo, abriendo la flor inmadura y retirando
l a ant era que proporci onar a el pol en y cubri endo
posteriormente el estigma con polen de otra planta con
distintas caractersti cas, se produce una fecundacin
absolutamente experimental, cruzada, y controlada. Las
conclusiones finales de sus estudios se conocen como
las leyes de la gentica de Mendel, son el modelo terico
sobre las cuales se basa an mucho de lo que sabemos
actualmente en l a transmisin de los caracteres por
herenci a
3,4
. En 1902 Wal t er Sut ton, correl acion l a
asociacin de los cromosomas maternos y paternos en
pares y su posterior separacin durante la divisin celular,
con las leyes mendelianas de la herencia
5
.
Posteriormente Thomas Morgan encontr en 1910 que el
F ranklin Aldecoa Bedoya, Carlos Battilana Guanilo
rasgo del color blanco de los ojos poda transmitirse junto
a un factor que determinaba el sexo, en el cromosoma X de
la mosca de la fruta (Drosophila)
6
, demostrando ms tarde,
que durante la meiosis existe un intercambio de material
entre cromosomas homlogos (crossing-over) y que la
probabi l idad de un entrecruzamiento entre dos genes
asociados, es proporcional a la distancia entre ellos en el
cromosoma; por t anto, cont ando l a frecuenci a de
entrecruzamientos entre alelos de un par de genes es
posible mapear aquellos genes en el cromosoma
7
(Morgan
recibi el premio Nobel en 1933 por este trabajo).
Basados en un experimento de Griffith en 1928, en el cual
infectando con Streptococcus pneumoni ae a un grupo
de rat ones en l os cual es l a bact eri a con cpsul a
(neumococo S) causaba la muerte en menos de 24 horas y
que al usar la misma cepa de Streptococcus sin cpsula
(neumococo R) no letal, asociada al neumococo virulento
previamente muerto por calor, mataba nuevamente los
ratones, Avery, Mac Leod y McCarty condujeron en 1944
su clsico experimento del principio transformante en el
cual encontraron que el ADN purificado de las bacterias
letales S transformaban a las bacterias no virulentas R a la
forma letal
8
. Hasta ese entonces la opinin mayoritaria era
que el ADN, aun siendo un importante constituyente de
los cromosomas, era una molcula montona y ms bien
estructural , y que de ni nguna manera pod a ser
portadora de la informacin hereditaria. Sin embargo, a
pesar de esta nueva evidencia, algunos suponan que dicha
informacin posiblemente vena de las protenas asociadas
a los cromosomas y se tuvo que esperar casi diez aos,
hasta que Hershey y Chase confirmaron el rol de ADN en
su clsico experimento con bacterifagos de virus
9
.
En 1950 el bioqumico Erwin Chargaff demostr que
aunque la composicin del ADN varia de especie en
especie (sobre todo en lo relacionado a la cantidad de
cada nucletido), el nmero de bases adenina (A) era
Figura 1. Gregorio Mendel (1822-1884).
Estableci su teora basndose en 3
principios: dominancia, segregacin y
orden independiente
Acta Med Per 23(3) 2006 187
igual al de timinas (T) y el de citosinas (C) al de guaninas
(G)
10
. Poco tiempo despus Rosalind Franklin trabajando
en el grupo de Wilkins en Londres obtuvo una excelente
fotografa por medio de la difraccin de rayos X de las
fibras deL ADN. Sobre estos hallazgos Watson y Crick
dedujeron que el ADN estaba formado por una doble
hlice regular constituida por azucares (desoxirribosa)
y fosfatos con l as bases nucl eotdi cas en forma de
pel daos f ormando enl aces A- T y C- G
11
.
Lamentabl emente, Rosal ind Frankl in muri de una
enfermedad leucmica y no pudo compartir el premio
Nobel con Watson y Crick en 1962.
2. Dogma central de la biologa molecular
La t eor a de Wat son y Cri ck f ue conoci da
posteriormente como el Dogma Central de la Biologa
Molecular, basado en que el ADN codifica los genes de
un modo lineal estricto a travs de un mediador: el ARN,
el cual es una plantilla para la sntesis de protenas.
- 2.1. Replicacin del ADN
En las clulas procariotas la replicacin comienza en un
punto definido y avanza a la misma velocidad en ambas
direcciones hasta finalizar con la duplicacin del material
gentico. En los eucariotas en fase S del ciclo celular se
inicia la dupl icacin en distintos puntos (repl icones),
en ambas direcciones. Sin embargo, en cada repl icn
la insercin de nucletidos es continua en la direccin
5 -3 , pero en la cadena antiparalela (3 -5 ) se forma
por segmentos pequeos (fragmentos de Okasaki) de
1 000 a 2 000 bases; este proceso complicado implica
muchos compl ej os enzi mt i cos, que permi t en el
desenrollar el ADN, regular procesos, como las ciclinas
entre otros. La repl i caci n semi conservat i va fue
demostrada por Meselsonn y Stalh en 1958
12
. Este
mecani smo ha si do expl ot ado en el proceso de
secuenci acin del A DN actual , usando compl ejos
enzimticos bacterianos.
Genmica y protemica: un paso ms
- 2.2. Transcripcin
Para que l a cl ul a pueda usar l as i nstrucci ones de
l a i nformaci n gent i ca, st a debe trasl adarse del
ncl eo al ci t opl asma, donde l as prot e nas sern
construi das. El ARN de t i po mensaj ero ( ARNm) es
el intermedi ario, que real i za esta l abor. El ARNm esta
conformado por una cadena ni ca que no forma
dobl e hl i ce, con mucha menos est abi l i dad que el
A D N ( v i da medi a en mi nut os) . E l proc eso de
transcri pci n es si mi l ar a l a repl i caci n del A DN,
pero en l a incorporacin de nucl et idos se reempl aza
l a t i mi na por el uraci l o. El proceso es comandado
por l a enzima ARN pol imerasa y sol amente se copi an
sectores que codi f i can genes, dependi endo del t i po
cel ul ar en l a cual se l l eve a cabo est e proceso en el
t i empo. Est a f ase es muy compl ej a y al i gual que l a
transcri pci n t i ene vari as enzi mas que regul an su
funci onami ento. La exi st enci a en l os eucari ot as de
l os e xones e i nt rones compl i c a aun ms est e
proceso; ahora sabemos que pueden exi st i r vari as
formas de recort e a est e ni vel , de t al forma que un
gen conf ormado por di versos exones e i nt rones
t i ene formas al t ernat i vas de cort ado a ni vel RN Am,
de t al forma que un gen puede generar ms de un
t i po de prot e na
13
.
- 2.3 Traduccin
Para que un gen sea expresado el ARNm debe ser
traduci do a prot e na. El probl ema era codi f i car 20
di f erent es ami noci dos, cont ando para el l o con sol o
4 nucl et i dos; no pod a haber una correspondenci a
uno a uno, ni si qui era uno a dos, el nmero m ni mo
debi era ser al menos 3 nucl et i dos por ami noci do
(codn), pero l as posibi l idades de combinacin eran
(4 x 4 x 4) 64, de l o que se deduj o que hab a
secuenci as de codones redundant es o que exi st an
codones si n sent i do. En 1961 Ni remberg y Mat thaei
demost raron que un pol mero si nt t i co de bases
uraci l o, aadi do a una mezcl a de ri bosomas, ARNt
( ARN de transf erenci a), ami noci dos, ATP (como
fuent e de energ a) y otras enzi mas, daban ori gen a
una prot ena montona de feni l al anina, conf irmando
que el tri pl et e UUU generaba di cho ami noci do
14
, a
part i r de entonces comenzaron a descri bi rse nuevos
t ri pl et es l i gados a sus ami noci dos respect i vos,
const i tuyendose f i nal ment e en 1964 l a t abl a de l a
c l a v e ge n t i c a . E l pr oc e so de t r a duc c i n e s
cat al i zado por un el emento mol ecul ar compl ej o: el
ri bosoma, el cual t i ene un ARN ri bosomal (RNAr) y
prot e nas.
Tecnologa en biologa molecular y genmica
A part i r de l as observaci ones de Watson y Cri ck,
l os cua l es deduj eron bri l l ant ement e que ambas
cadenas de l a dobl e hl i ce eran compl ementari as, una
cadena sirve de pl ant i l l a para l a sntesis de una nueva
copia, reteniendo por tanto la informacin original. Esto
expl ica como la informacin gentica
Figura 2. En 1950 Rosal ind Frankl in produjo esta fotografa del
DNA por di fraccin de los rayos X, que fue uno de los puntos claves
en el descubrimiento de la doble hl ice.
ADN ARN PROT E NA
Traduccin Transcripcin
Repl i cacin
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es guardada en l os cromosomas y como pasa a una
cl ul a que est en di vi si n. Por t ant o, si ambas
c adenas compl ement ar i as son separ adas en e l
l aboratori o por cal ent ami ento (desnatural i zaci n),
e l l a s pue de n v ol v e r a uni r s e por l a
compl ement ari edad de sus nucl et idos. Est e proceso
de separaci n y nueva uni n es conoci do como
hi bri di zaci n y es l a pi edra angul ar de un gran
sector de l a t ecnol og a de l a bi ol og a mol ecul ar.
L a t e cnol og a genmi c a es l a apl i c a c i n de l a
automat i zaci n de l a t ecnol og a mol ecul ar bsi ca a
un si st ema paral el o masi vo. Met afri cament e, si l a
bi ol og a mol ecul ar provee l as operaci ones de cort e,
copi ado y pegado para un det ermi nado t exto (gen),
l a t ecnol og a genmi ca opera sobre ml t i pl es genes
al mismo t i empo
13
. Por t anto, para ent ender bi en est a
nueva t ecnol og a de al to rendi mi ento, es necesari o
conocer sobre l as t cni cas de l a bi ol og a mol ecul ar
bsi ca.
3. Tcnicas de la biologa molecular
3.1. Enzimas de restriccin (cortar)
Son enzimas que cortan el ADN. Son obtenidas de algunas
bacterias que las usan como proteccin a invasin de
ADN forneo. El primero en obtener y purificar estas
enzimas fue Hamilton Smith a principios de los 70
15
. Estas
enzimas reconocen secuenci as espec f i cas de 4 a 8
nucletidos lugar donde producen el corte. Se conocen
actualmente ms de 400 diferentes tipos.
3.2. Clonaje del ADN (copiar y pegar)
Es un proceso mediante el cual se usan bacterias como
hospederos, para insertar en su material gentico o en
los llamados plsmidos un segmento de ADN de inters
y hacer que dicha bacteria se replique ilimitadamente.
Fue Stanley Cohen quien logr insertar plsmidos que
transportaban genes de resistencia a antibiticos de una
bacteria a otra y posteriormente incluir material gentico
de otras especies en bacterias
16
.
El proceso comienza con el aislamiento de un fragmento
de ADN de inters mediante las enzimas de restriccin; al
mismo tiempo se asla y abre el ADN circular de un
plsmido con la misma enzima de restriccin usada;
inmediatamente se junta ambos materiales permitiendo
que los fragmentos se peguen usando una ADN ligasa y
se tenga un nuevo crculo de material plasmdico (plsmido
quimrico). Las bacterias se dividirn rpidamente con el
consiguiente aumento del gen insertado y la produccin
de la protena de inters dentro de la bacteria, la cual ser
purificada para su uso posterior. Toda este proceso tiene
el nombre de Tecnologa del ADN recombinante o
Ingeniera Gentica.
3.3. PCR: Clonacin sin bacterias
Mediante esta tcnica, mltiples copias de un segmento de
ADN especfico pueden producirse por amplificacin,
usando un sistema de sntesis consecutiva que no requiere
clulas vivas. Esta incluye una serie de reacciones a partir
de la enzima ADN polimerasa, por lo cual toma el nombre de
Reaccin de la polimerasa en cadena o PCR (iniciales en
ingls). Mediante un segmento iniciador o primer de
nucletidos complementarios a un extremo de la secuencia
deseada en una de l as cadenas, y otro i ni ci ador
complementario en el otro extremo de la otra cadena,
lograremos insertar los nucletidos complementarios
mediante la polimerasa y obtener millones de copias del
segmento deseado en aproximadamente 20 ciclos. Mullis
logr el premio Nobel por esta tcnica en 1993
17
.
La tecnologa moderna de secuenciacin del ADN est
basada en el mtodo de interrupcin controlada de la
replicacin del ADN desarrollada por Fred Sanger en 1977,
por el cual obtuvo el Nobel en 1980. Sanger combin la
maquinaria de replicacin natural de las bacterias con
algo de tecnologa ADN recombinante y bioqumica
inteligente para crear un sistema de clonacin in vitro.
1.4. Mtodo de Sanger: Secuenciacin del genoma
Us nucletidos especiales (dideoxinucletidos) para
F ranklin Aldecoa Bedoya, Carlos Battilana Guanilo
Figura 3. Proceso de transcripcin y traduccin del ADN.
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136
cortar la replicacin una vez que aleatoriamente una de
estas bases se asociaba al proceso. Para visualizar los
diferentes segmentos obtenidos eran radiomarcados y
luego separados por electroforesis obtenindose una
placa radiogrfica con la posicin de acuerdo al tamao
molecular de los distintos segmentos de ADN generados
se poda colegir los nucletidos en forma secuencial
18
.
4. Tecnolog a genmi ca
4.1. Secuenciacin automatizada del ADN.
La primera gran innovacin del mtodo de Sanger la hizo
Leroy Hood, al desarrollar nucletidos fluorescentes que
reemplazaron a los radioactivos en 1985. Estos podan
ser medidos directamente en el gel de acrilamida por un
detector l aser; adi cionalmente, cada nucl et ido fue
marcado con un col or di st i nto, l o cual f aci l i t su
identificacin. Luego Hood conect el proceso a una
computadora y fund Applied Biosystems, Inc. (ABI)
19
.
En esenci a todo el Proyecto Genoma Humano fue
realizado en mquinas de ABI. Sin embargo, uno de las
principales limitaciones del metodo de Sanger/ ABI, fue
que solo poda secuenciar fragmentos de 500 a 800 bases.
4.2. Subclonacin shotgun.
El proceso de secuenci acin de fragmentos grandes
de ADN requer a cortar con enzimas de restri ccin,
ingresar l a informacin a pl smidos (subclonacin) y
luego secuenci ar.
Para aumentar l a fidel idad, el proceso era dupl i cado.
Sin embargo, aparte del ti empo consumido en tal es
tareas, hab an muchos errores en los extremos de los
fragmentos que deberan empatar con su complemento.
Teri camente, si un fragmento de ADN es copi ado
muchas veces, luego fragmentando en forma al eatori a
(subc l ona c i n shot gun ) y post er i orment e
secuenci ados, si se t i ene una sufi ci ente cant idad de
muest ras, es posi bl e reest abl ecer nuevament e el
f r agment o or i gi na l a t r a v s de l os e x t r emos
coincidentes de cada mini fragmento.
A mediados de los 90 el Institute for Genomic Research
( T I GR) l ogr aut oma t i z ar t odo e l proc eso de
subclonacin shotgun y secuenci en un t i empo
realmente corto para l a tarea, l a secuenci a compl eta
del genoma del Haemophi l us i nf l uenzae
20
. Cel era
Genomics Corporation ms tarde, desarroll un sistema
de secuenci acin basado en este principio, con lo cual
impuls l a secuenci acin del genoma humano y lograr
obj eti vos ms tempranos de los esperados
21
.
GE NE T E RAPI A
La aplicacin ms evidente de este tipo de terapia es la
correccin de algn def ecto ni co de un gen, que
corresponda a una enfermedad heredada. Lo racional es
el reemplazo del gen daado o alterado, por un gen normal
trasladado a travs de una serie de vectores hacia el
contexto celular donde debiera funcionar. La introduccin
del material gentico de reemplazo debe cumplir varios
pasos: atravesar la membrana celular, cruzar el citoplasma
y llegar al ncleo donde debe generar transcripcin. De
hecho cada paso implica muchos obstculos que incluyen
los mecanismos naturales de proteccin del la clula contra
los elementos extraos, sobre todo a nivel nuclear. Los
vectores pueden ser clasificados como de tipo viral o no
viral.
Se han hecho al gunos trat ami entos experi ment al es
en enf ermedades como: l a def i ci enci a de deaminasa
de adenosina ( A DA), en el cual existe una disfuncin
de los l infoci tos T y B por acumul acin de productos
txi cos deri vados de l a ausenci a de l a enzi ma A DA;
f i brosi s qu st i ca ( F Q), una enf ermedad heredi t ari a
recesi va en l a cual exi st e una mut aci n del gen
regul ador de conduct anci a transmembrana de l a F Q,
el cual expresa un canal de cl oro al t erado y cuya
pri nci pal mani f est aci n es l a cont i nua i nf ecci n a
ni vel bronqui al ; hipercol esterol emi a fami l i ar, l a cual
e s una e nf e r me da d he r e di t a r i a domi na nt e
caract eri zada por un def ecto en el gen que codi f i ca
el receptor para l i poprot e nas de baj a densi dad a
ni vel hept i co.
Figura 4. Mtodo de secuenciacin de ADN. Sanger us dideoxinucletidos en vez de los desoxinucletidos clsicos, ya que al usar
dideoxinucletidos no se puede establecer el enlace con la siguiente molcula de desoxirribosa a ni vel del C3 por el cambio de un O
por OH y se trunca l a s nt esi s nucl eot di ca, Por t anto de consi guen di st i ntos fragmentos que vi aj arn di st i nto en un campo
electrofortico y en base al lugar que ocupa cada fragmento dentro de la electroforesis podemos establecer la secuencia espec fica de
un fragamento de DNA. Si llevamos est mtodo a una forma automtica con participacin ciberntica, obtendremos los secuenciadores
actual es, que tanto ayudaron a que el Proyecto Genoma Humano fuera esbozado antes de su obj eti vo final .
Genmica y protemica: un paso ms
136 136 136
Acta Med Per 23(3) 2006 190
Los resul tados son aun irrel evantes y l a toxi cidad
producida en un par de casos, en uno de los cuales
hubo muerte del paci ente, han generado opiniones
adversas
22-24
. Sin embargo hay algunas publicaciones
ms recientes que muestran interesantes resultados en
estudios experimentales en perros con hemofilia B
25
,
amaurosis congnita de Leber y en cncer
26
.
T E CNO L O G A MI CRO ARRAY
La base de la tecnologa gene array radica en que un
gran nmero de ADN de genes conocidos son pegados
en l a superf i ci e de una mat ri z de pequeos
microespacios (generalmente una laminilla de vidrio),
sobre la cual se pone secuencias de ARN marcado,
extradas de algunas clulas de inters. Dicho RNA se
ligar por hibridacin RNA-DNA en la matriz. La cantidad
de RNA marcado que se liga al DNA fijado a la matriz
puede luego medirse
13
. Los experimentos array son
siempre conducidos comparando dos o ms muestras y
miden la expresin gentica, es decir la cantidad relativa
de RNAm al momento del estudi o y puede o no
correlacionar con los ni veles de transcripcin y los
niveles de protena en la clula (pero, generalmente
correlaciona bien).
El ensambladorobticopara utilizacinmasiva del array
toma el nombre de tecnologa microarray; en un solo
proceso se pueden evaluar mi les de genes y es una
herramienta flexible para medir la expresin gentica en
cualquier tejido del cual pueda aislarle el ARN. Las
apl icaciones inmediatas de esta tecnologa han sido
bsicamente en investigacin y desarrollo, enfermedad y
respuesta a drogas. Uno de los campos donde esta tcnica
puede colaborar es la patologa; existenmuchas neoplasias
que difcilmente pueden tener un diagnstico patolgico
seguro, mediante el uso del microarray podra hacerse un
diagnstico ms fino, incluyendo la posibilidad de agrupar
subtipos de cncer dentro de una misma neopl asi a
(prediccinde clase). As por ejemplo Goluby colaboradores
usaron esta tcnica para distinguir entre leucemias agudas
de tipo linftico y mieloide
27
, Alizadeh estableci grupos
pronsticos en linfomas de clulas grande B, basados en
el perfil de expresin gentica
28
.
Asimismo, el pronsticode otras enfermedades enel campo
oncolgico podran variar, como en el cncer de prstata,
en el cual muchas veces existen incrementos del antgeno
prosttico especfico asociado a un proceso inflamatorio
al que pueden diagnosticar como neoplasia sin serlo, e
incluso, la evaluacin de la agresi vidad en caso de
neoplasia y la correlacin con el tratamiento respectivo.
Sin embargo, antes de que esta tecnologa llegue a ser
ampliamente usada en el campo clnico, aun se requieren
algunas consideraciones:
1. Debemos est ar seguros que l o que est amos
midiendo es el material gentico de las clulas que
nos interesan y no de las clulas vecinas de soporte
u otra estirpe.
2. En los casos de tumor, lo ms probable es que
estemos midi endo sol amente una de l as tantas
variaciones celulares del mismo tumor.
3. La medida del contenido de RNAm es indirecta y
pueden haber varios factores de error en la prueba.
4. Existen genes muy similares en su conformacin
que compart en part e de su composi ci n
nucl eot di ca (homol og a) y podr an haber
respuestas cruzadas.
5. Los genes indi vidual es pueden t ener caminos
alternati vos de corte, en el momento en que el
RNAm conserva aun exones e intrones.
Figura 5. Hibridizacin de 6 genes humanos a travs del array de
oligonucletidos GeneChip. La tecnologa es un proceso complejo y
se hace con robots. En una lmina de vidrio se separan cientos de
miles de celdas dentro de los cuales fijamos el DNA de los genes que
nos interesa evaluar. Luego permitimos la hibridizacin de estos genes
con el RNA o DNAc del material biolgico obtenido y tendremos una
foto dimensionada de la funcionalidad de esa clula con respecto a
otras.
FARMACOGENMICA
La frmacogentica es el estudio de cmo los diversos
genes afectan la respuesta de las personas a las drogas;
l a farmacogenmi ca es definida como el uso de l a
informacin secuenciada del ADN para medir, predecir
la respuesta de un individuo a las drogas
13
.
Existen varios ejemplos en relacin a interacciones de
las drogas por problemas genticos: durante la II guerra
mundial se descubri que cerca del 10% de poblacin
afroamericana tena alelos polimrficos de la glucosa 6
fosf ato deshi drogenasa que condi ci onaba anemi a
hemoltica cuando tomaban el antimalrico primaquina;
aproximadamente 0,04% de la poblacin general son
homocigotes para alelos de la pseudocolinesterasa, los
cual es no pueden i nact i var el rel aj ant e muscul ar
succinilcolina, lo cual termina en parlisis respiratoria;
cerca del 10% de personas caucsicas son homocigotes
para los alelos del gen CYP2D6 del citocromo P450 por
l o cual no met abol i zan l a droga ant i hi pert ensi va
debrisoquina; existen muchos alelos polimrficos del
gen N-acetiltransferasa, que pueden reducir o aumentar
l a acti vidad de l a isoni azida; finalmente, paci entes
homocigotes para los al elos del gen de l a enzima
convert idora de angiotensina con una del ecin del
intrn 16 no muestran beneficio cuando usan enalapril.
En los casos anteriores, conociendo el lugar de variacin
del nucletido en el gen, podemos establecer pruebas
simpl es de marcadores tipo SNP (singl e nucl eotide
polymorphism) para determinar que personas pueden
tener estos problemas; pero adems, podemos incluso
F ranklin Aldecoa Bedoya, Carlos Battilana Guanilo
Acta Med Per 23(3) 2006 191
cubrir una buena parte del genoma buscando SNPs que
podran asociarse con respuesta a drogas tanto en el
aspecto de seguridad como de eficacia. En algunos casos,
las diferencias entre las respuestas a una misma droga en
un grupo de paci entes ident i f i cado por screening
farmacogenmico podra indicar incluso, un mecanismo
diferente de enfermedad
13
. Por tanto, la farmacogenmica
puede proveernos con informacin confiable que puede
ayudar al mdico en la decisin teraputica apropiada, con
una dosificacin justa de acuerdo ya no al peso, edad o
sexo, sino basados en las caractersticas genticas de la
persona.
PRO T E MI C A
E s e l e s t udi o s i s t e m t i c o de l a s di v e r s a s
pr opi e da de s de l a s pr ot e na s pa r a pr ov e e r
det al l ada descri pci n de l a estructura, funci n y
control de l os si st emas bi ol gi cos, esto i ncl uye:
secuenci a, cant i dad, modi f i caci ones, i nt eracci ones
con otras prot e nas, et c. t anto en sal ud como en l a
enf ermedad
29
. Dent ro de l a versat i l i dad de l as
prot e nas encontramos que:
..1. Numerosas protenas cambian su forma deliberadamente
mientras realizan su funcion.
2. Pueden asoci arse sel ect i vamente con col aboradores
(cofactores) para llevar a cabo su tarea de forma ms
eficiente.
3. Numerosas transformaciones postraduccin afectan las
propiedades de numerosas protenas.
4. Tienen la capacidad de diversificarse en conglomerados
desde simples dmeros a cientos de subunidades
30
.
Cuantificacin de las protenas.
La medicin de la cantidad de diferentes protenas en un
extracto celular es tcnicamente ms difcil que medir el
ARNm con tecnologa microarray, debido a la diversidad
de las protenas. El mtodoms importante para cuantificar
protenas ha sido la electroforesis en gel de poliacrilamida
en2dimensiones (2-D PAGE), el cual ha sido el caballitode
batal l a de l a qumi ca prote ca por vari as dcadas:
inicialmente se separan las protenas por pH en una
direccin, usando su punto isoelctrico, posteriormente
se separan por tamao en la otra direccin en el mismo gel
y por electroforesis, finalmente se visualizan en gel con
tinciones especiales o por autoradiografa. Este mtodo
solopuede proveer un estimado aproximado. Sin embargo,
la protemica necesita un mtodo de alto rendimiento que
permita identificar y cuantificar un altonmerode protenas
a la vez; nuevas tecnologas como la espectrometra de
masa asociada a procedimientos que ionizan las molculas
protecas con laser enun campo elctrico, para luegomedir
la cantidad de tiempo hasta que los iones alcancen el
detector son actualmente las ms usadas; sin embargo,
an no es posible un mismo procedimiento para todo este
proceso.
Interacciones protena-protena.
Algunas protenas interactan con otras para formar
complejos moleculares multi-subunidades, para regular
la funcin de otras protenas o para ser reguladas. La
ext ensin y natural eza de est as int eracciones son
i mport ant es para ent ender l as v as regul atori as y
metablicas y para la caracterizacin funcional de muchas
otras que estn siendo descubiertas. Varias tecnologas
estn disponibles para evaluar estas interacciones, sin
embargo, ninguna ti ene capacidad para anal i zar el
conjunto completo de una clula u organismo.
Protemica estructural
Se espera conocer ms acerca de l as f unci ones
bi ol gi cas de l as prot e nas a part i r de su estructura
t ri demensi onal (3D), ms que de su secuenci a
aminoacdi ca o su peso mol ecul ar. Actualment e, no
es posi bl e predeci r l a estructura tri di mensi onal ,
basndonos sol ament e en su secuenci a pri mari a o
por l os datos de l a espectrometr a de masa. Est e
trabaj o pasa por l a puri f i caci n y cri st al i zaci n de
l a prot e na, l a cual ser post eri orment e somet i da a
cri st al ograf a por rayos X o resonanci a magnt i ca
nucl ear. Si n embargo, es posi bl e correl aci onar l a
i nf ormac i n conoc i da y acopi ada en bases de
datos especi al es, para predeci r l a conformaci n 3D
de prot e nas con secuenci as si mi l ares (hast a en
30%), proceso l l amado threadi ng.
Blancos de drogas
Hasta hace poco tiempo, las compaas farmacuticas
hab an creado cerca de 500 bl ancos t eraput i cos
dirigidos a protenas. Con la aplicacin de la genmica
al desarrol lo de nuevas drogas se espera que este
nmero crecer a cerca de 4 000 en los prximos aos.
Part i cul arment e, l a t ecnol og a mi croarray ser
fundamental para este crecimiento.
Visin de la genmica
Sobre la base del Proyecto Genoma Humano y contando
con pilares como: recursos, desarrollo de tecnologa,
biologa computacional, entrenamiento, educacin y
aspectos ticos y sociales, se configuran tres grandes
reas dentro de las cuales existen grandes retos a llevar
a cabo en los siguientes aos
31
.
I . La genmi ca hac a l a bi ol og a : el uci dar l a
estructura y funcin de los genomas.
( a) I de nt i f i c a r comp r e nsi vame nt e l os compone nt es
est r uc t u r al es y f unc i onal es codi f i c ados e n e l ge noma
h u ma no.
(b) Di l uci dar l a organi zacin de l a r ed gent i ca y l as v as
de l as p r ot e nas y como e l l as cont r i buye n al f e not i po
cel ul a r y del or gani smo.
(c) E nt ende r l as va r i aci ones he r edi t a r i as en el genoma
h u ma no.
( d) E nt e nde r l as va r i ac i ones e vol uc i ona r i as e nt r e l as
espec i es y l os mec ani smos subyace nt es.
(e) Desa r r ol l o de opci ones que f aci l i t en l a di semi naci n
de l a i nf or maci n genmi ca t ant o en el cont ext o cl ni co
como i nvest i gac i onal .
Genmica y protemica: un paso ms
Acta Med Per 23(3) 2006 192
I I . La genmi ca haci a l a sal ud: Tr asl adar el
conocimiento basado en el genoma hacia los beneficios
de la salud.
( a) Desa r r ol l a r f ue r t es est r at egi as pa r a i de nt i f i c a r
cont r i buci ones gent i cas a l a enf e r medad y l a r espuest a
a l as drogas.
(b) Desar rol l ar est r ategi as par a i dent i f i car l as var i aciones
ge n t i c as que cont r i buye n a l a bue na sal ud o a l a
r esi st enci a a l a enf e r medad.
(c) Desa r r ol l a r he r r ami ent as basadas en el genoma que
p r e di gan l a susce pt i bi l i dad a l a e nf e r me dad y l a
r espuest a a l as dr ogas, det ecci n t empr ana y t axonom a
mol ecul a r de l a enf emedad.
( d) Usa r e l conoc i mi e nt o de l os ge nes y sus v as pa r a
desa r r ol l a r nue vos y pode r osos e nf oques t e r ap ut i cos
cont r a l a enf e r medad.
(e) I nvest i ga r cmo es comuni cado el r i esgo gent i co en
el cont ext o cl ni co, cmo i nf l uenci a esa i nf or maci n en
l as est r at egi as de l a sal ud y e n e l compor t ami e nt o,
asi mi smo, cmo i nf l uye n est os e n l os r esul t ados y l os
cost os.
(f) Desar r ol l ar he r r ami ent as basados en el genoma, par a
me j or a r l a sal ud de todos.
III. La genmica hacia la sociedad: Promover el uso
de la genmica para maximizar beneficios y minimizar
daos.
(a) Desar rol l ar opci ones par a el uso de l a genmi ca en el
cont ext o mdi co y no mdi co.
(b) E nt ende r l a r el aci n ent r e genmi ca, r aza, et ni ci dad
y l as consecuenci as de no est abl ece r est as r el aci ones.
(c) E nt e nde r l as consec ue nc i as de no desa r r ol l a r l as
cont r i buc i ones ge n t i c as a l os r asgos humanos y e l
compor t a mi e nt o.
(d) Pol i t i cas ef ect i vas pa r a def i ni r l o asoci ado a l a t i ca
en el uso del genoma
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Correspondencia:
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