Anda di halaman 1dari 20

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh :
Nama : Rani Wulandari
NIM : B1J011010
Kelompok : 3
Rombongan : V
Asisten : Roman Bramandita









LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER









KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Sebuah sel memiliki DNA yang
merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme
dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan,
manusia, maupun pada tumbuhan (Faatih, 2009).
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus
yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA
kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan
DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal,
berupa DNA sirkuler yang terdapat di sitoplasma, beruntai ganda serta mampu
secara independen bereplikasi. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi
DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa molekul DNA
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Penggunaan plasmid dalam DNA
rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting
untuk DNA kloning, yaitu, replication origin, marker yang memungkinkan
adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu
disisipi oleh fragmen DNA dari luar. Salah satu karakteristik plasmid, yaitu
memiliki ORI (Origin of replication). Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah
menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar (Jusuf,
2001).
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Hasil dari berbagai
manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis
yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan
meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis
didasarkan pada perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau
kombinasi antara keduanya. Karena elektroforesis merupakan pergerakan dari
molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik maka molekul bermuatan
negatif akan bergerak ke elektroda bermuatan positif (kutub positif) dan molekul
bermuatan positif akan bermigrasi ke arah kutub negatif.
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan
fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah
pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui
ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu,
elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk
mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari
fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan.
Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan
jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu.
Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan
RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk,
dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya
secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik
diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju
elektroda positif. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan
didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode
tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi,
disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam
ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan
untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.

B. Tujuan
Praktikum kali ini bertujuan untuk melihat cara kerja dan prinsip
elektroforesis gel agarosa.
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi DNA sampel
(DNA kromosom bakteri dan DNA kromosom buah), DNA marka (DNA yang
dipotong dengan Hind III), Agarosa, Larutan buffer TAE 50x (tris-base, asam
asetat glacial dan EDTA), Akuades, Loading dye (Bromophenol blue, xylene
cyalol) dan Larutan Etidium Bromid (EtBr).
Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi Gelas ukur 1000
ml, Labu erlenmeyer 50 ml, Mikropipet beserta tip, Sarung tangan, Kertas
parafilm, Seperangkat alat elektroforesis, UV transiluminator dan Kamera digital.

B. Metode
1. Dibuat 500 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 10 ml
TAE 50x ke dalam 490 ml akuades.
2. Dibuat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,6 g untuk
dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 60 ml. Larutan agarosa
dididihkan hingga larut sempurna.
3. Disiapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa
(pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-
masing ujung baki).
4. Dipasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan
posisi hampir menyentuh dasar baki.
5. Diperiksa suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke
tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60
O
C, tambahkan 1 l
etidium bromid.
6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke
dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang
padat.
7. Diambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
8. Dimasukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki
elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa
gel terendam seluruhnya dalam TAE).
9. Disiapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
10. Dikeluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung
kaca hitam di atas UV transluminator).
11. Dinyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
12. Didokumentasikan dengan kamera digital.


III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil

Gambar 1. Visualisasi DNA Hasil Elektroforesis

B. Pembahasan
Berdasarkan hasil visualisasi DNA setelah dielektroforesis diperoleh bahwa
pita DNA sampel buah tidak muncul, sedangkan DNA sampel menghasilkan pita-
pita DNA. Hal tersebut dapat terjadi karena pada saat sampel DNA buah
dimasukkan ke dalam sumuran baki elektroforesis terdapat gelembung sehingga
sampel DNA buah melebur setelah dimasukkan ke dalam sumuran. Menurut
Standfield et al. (1996), kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA
telah mengalami depolarisasi. Perlu diperhatikan bahwa pemberian arus listrik
pada gel agarosa tidak boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat
mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA. Beberapa
kemungkinan yang menyebabkan pita-pita DNA tidak terbetuk seperti seharusnya,
diantaranya adalah DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga
DNA hilang karena larut, perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat
elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarosa. DNA terus menembus gel
tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang
muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang
sebenarnya adalah 30 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA. Pita-pita
DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear,
circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda
sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak
DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya (Sambrook &
Russel 2001).
Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis merupakan proses bergeraknya
molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak
pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Klug and
Cummings (1994) menambahkan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik yang
mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam
suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan
partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang
bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan
positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat
dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000 pasang basa (pb). Prinsip dasar tekhnik elektroforesis ini adalah
DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
tekhnik preparatif (Standfield, 1996).
Menurut Rachmaniar (1998), agarosa merupakan polimer dari 3,6-Anhidro-
L-galaktosa dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak
bermuatan. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut,
rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum atau bisa juga dari jenis
golongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika dilarutkan
dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang
digunakan untuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan denga agar yang
digunakan untuk kultur bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai
dengan konsentrasi agarosa.
Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandung
larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik
untuk DNA. Gel agarosa mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapat
memisahkan fragmen DNA antara 100 bp50 kb tergantung dari konsentrasi gel
agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal.
Fungsi dari masing-masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikum
elektroforesis adalah:
1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada medium
karena keringat mengandung DNAase dan melindungi toksik dari EtBr.
Selama pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit
mungkin (Faatih, 2009).
2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA.
3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah
dirunning.
4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampel
DNA dengan loading dye.
5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA.
6. EtBr, digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan
menunjukan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda.
7. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai
penanda jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya
elektroforesis.
8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat
glasial sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim
perusak DNA yaitu DNAase).
9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.
10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70
V selama 35 menit.
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar (Davis
et al., 1994).
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen
kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran
dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarosa. Mobilitas/pergerakan
DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi
agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan
buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi
melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum,
molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari
molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju
elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi
yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih
besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel
yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen
panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada
fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010). Namun, fragmen yang lebih besar
dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena
tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang
konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor
utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan
bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen
DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8
V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb
dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman,
2010).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan
secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA
pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik
yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul
protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan
penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan
listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G.,
2010).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-
molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(katoda) (Klug and Cummings, 1994). Analisis kemiripan dengan klasifikasi
sampel elektroforesis adalah cara untuk mengevaluasi hasil elektroforesis gel satu
dimensi (Skutkova, 2013).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan
makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul
DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell et al., 2002).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb : digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber : digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik : digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
(Birren and Lai, 1993).
Elektroforesis menggunakan bahan-bahan seperti Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida
dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas,
sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau
kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu,
elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya
ada dua macam elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan
dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan
yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di
antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak
digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat,
agarosa atau poliakrilamid (Biosciences, 1999).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen
DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain
membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan
sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-
gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan
jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama
perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah
diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui
variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi
berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa
fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan
perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang
diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen,
1999).
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama
proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil
percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah
percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat
dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain
kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan
pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel
ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarosa
0,6%. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarosa 0,6% karena dilakukan
oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarosa 0,6%
dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE,
yang kemudian dipanaskan di dalam hotplate and stirer, selanjutnya dituangkan
ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan sisirannya dan tunggu sampai
mengeras. Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 0,6 gr dan larutan running
buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 60 mL yang berperan untuk
memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik
(Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang
elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running
buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan
pemanasan (Gardner et al., 1991). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA
dengan loading day yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well
dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung
karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading day 2l dengan DNA
sampel sebanyak 10l dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada sumur/well
yang telah dibentuk pada gel. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai
mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan
loading day tidak meluber ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan
negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak
menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.
Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.
Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-
marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga
tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda
HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb
hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan
diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada
tegangan 100 Volt selama 40 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi
oleh tegangan listrik dan arus listrik yang diberikan oleh power supply ke tangki
elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan
dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarosa nantinya akan
dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna (Davis
et al., 1994).
Tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel
agarosa hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit.
Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari
sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan
Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah
divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc. Gel doc adalah alat yang digunakan
untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel
doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi
menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil
elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat
bantuan software (Davis et al., 1994).
Menurut Fachiyah (2006) terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa,
sebagai berikut:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier
lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah
laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.
2. Konsentrasi gel agarosa
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai
dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya adalah:
log=log-Kr
T
dimana adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah
retardation coefficient, dan
T
adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic
mobility DNA.
Tabel 1. konsentrasi gel agarosa dan ukuran molekul DNA
No Konsentrasi Gel
Agarosa (%)
Effisiensi range Pemisahan
pada DNA linier (kb)
1 0.3 60-5
2 0.6 20-1
3 0.7 10-0.8
4 0.9 7-0.5
5 1.2 6-0.4
6 1.5 4-0.2
7 2.0 3-0.1
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu
bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened
(II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama
tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini
karena:
Konsentrasi gel agarosa
Kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
Densitas kembaran superheliks pada bentuk I
Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,
pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh
untuk bentuk I
Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg.
Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju migrasinya
dan semakin basar berat molekul DNA maka laju migrasinya pun semakin lambat.
Berdasarkan ukuran, semakin berat molekul DNA maka semakin lambat laju
migrasinya, begitu juga sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan
struktur molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk
covalently closed circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang paling
lambat adalah bentuk open circular (OC).
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarosa bergerak 5v/cm. Arah dari bidang
elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan
berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
5. Komposisi basa DNA atau temperature
Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,
mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan
pada suhu kamar
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent Ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen
untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa
DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit
DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada
media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau
double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye
ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen
minimum.
Beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA
dalam proses elektoforesis menurut Wolfe (1993), yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel
karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul
berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga
sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih
tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa
yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan
densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan
densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan
molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan
molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA
Elektroforesis gel memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi
amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama
pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping
itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost
atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit
diinterpretasikan (Tarigan, 2011).


IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut:
1. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan
listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya.
2. Semakin padat gel agarosa dan berat molekul DNA maka akan semakin lambat
laju migrasinya.

B. Saran
Pelaksanaan praktikum lebih bekerja secara aseptis dan teliti. Penggunaan
sampel DNA yang digunakan lebih diperhatikan agar tidak terjadi denaturasi.
Selanjutnya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya demo dalam penggunaan
alat agar semua praktikan dapat mengetahui secara detail penggunaan alat.











DAFTAR REFERENSI
Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences,
USA.

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed Field Gel Electrophoresis: A Practical Guide.
Academic Press, Inc., San Diego.

Boffey, S. A. 1984. Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in
Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana,
Totowa, NJ.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Erlangga,
Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular Biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi, 10 (1):61 67.

Fachiyah. 2006. Electroforesis Migration Rate. Laboratorium Sentral Biologi
Molekuler & Seluler Universitas Brawijaya Malang, Malang.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The Continuity of Life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of Genetics 8th ed.
John Wiley & Sons Inc., New York.

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).

Jusuf M.2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi gen. Jakarta: Sagung Seto.

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill
Publishing Co.: Columbus, Ohio.

Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified Gel Preparation For Distinct DNA
Fragment Analysis In Agarose Gel Electrophoresis. Tropical Biomedicine
27(2): 351-354 (2010).

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA.
Warta Biotek, Bogor.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher Rijeka, Croatia.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers
Ltd., Oxford.

Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed,
Purwokerto.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI.
Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.

Rachmaniar. 1998. Pemisahan Agarosa dari Polisakarida Agar. Buku Produk
Alam Laut I. Puslit Oseanografi LIPI, Jakarta.

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of Genetics. Harper Collins College Publishers,
New York.

Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. Wartazoa Vol 21 (1).

Sambrook, J., Russel D. W. 2001. Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Skutkova, Helena, Martin Vitek, Sona Krizkova, Rene Kizek, Ivo Provaznik.
2013. Preprocessing and Classification of Electrophoresis Gel Images Using
Dynamic Time Warping. International Journal of Electrochemical Science,
8 (2013) 1609 1622.

Standfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996. Molecular and Cell Biology. Mc
Graw-Hill, New York.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. Wardworth
Publishing Company, Belmont.