SIGUIENDO A UNA PROTEINA FUERA DE LA CELULA

La aparicin del microscopio electrnico permiti a los investigadores ver la clula y sus
estructuras, a un nivel de detalles sin precedentes. George Palade utilizando esta herramienta,
no slo para mirar los detalles finos de la clula, sino tambin para analizar el proceso de
secrecin. Mediante la combinacin de la microscopa electrnica con los experimentos
de pulso-caza, Palade descubri el camino a seguir para dejar la clula.
TRASFONDO
Adems de la sntesis de protenas para llevar a cabo funciones celulares, muchas clulas
tambin deben producir y secretar protenas adicionales que ejercen sus funciones fuera
de la clula. El mecanismo de secrecin de protenas ha fascinado a muchos bilogos
celulares, incluyendo Palade. En las primeras investigaciones sobre la secrecin, clulas se
rompieron y los diversos orgnulos se separaron por centrifugacin. Estos estudios de
fraccionamiento celular haban demostrado que las protenas secretadas estn presentes
en vesculas unidas a la membrana asociados con el retculo endoplsmatico (ER), donde
se sintetizan, y con la membrana plasmtica, donde son liberados finalmente de la clula.
Desafortunadamente, los resultados de estos estudios eran difciles de interpretar debido
a las dificultades para obtener separaciones limpias entre diferentes orgnulos. Para
aclarar an ms el camino, Palade volvi a una tcnica de reciente desarrollo y alta
resolucin auto radiogrfica, que le permiti seguir protenas marcadas radiactivamente
mientras se movan dentro de la clula. Su trabajo condujo al descubrimiento seminal que
secretan protenas que viajan dentro de las vesculas del retculo endoplsmatico al
complejo de Golgi, y luego a la membrana plasmtica.
EXPERIMENTO
Palade quiso identificar qu estructuras celulares y orgnelos participan en la secrecin de
protenas. Para el estudio de tal proceso complejo, eligi cuidadosamente un modelo de
sistema apropiado para sus estudios, la clula pancretica exocrina, que es responsable de
producir y secretar grandes cantidades de las enzimas digestivas.
Palade examin en primer lugar la va de secrecin de protenas en in vivo mediante la
inyeccin de los conejillos de indias con [ H
3
]-leucina, que era incorporados en las
protenas recin hechas, y de ese modo etiquetarlos radiactivamente. En los puntos de
tiempo de 4 minutos a 15 horas, los animales fueron sacrificados, y el tejido pancretico
fue corregido. Al someter las muestras a autoradiografa y visualizacin en un microscopio
electrnico, Palade podra rastrear donde las protenas fueron marcadas en las clulas en
diferentes momentos. Como era de esperar, la radiactividad localizada en vesculas en el
ER en puntos de tiempo inmediatamente despus de la [3H] leucina de inyeccin, y en la
membrana plasmtica en los puntos de tiempo posteriores. La sorpresa lleg en los
puntos de tiempo medio. En lugar de viajar directamente desde el RE a la de membrana
de plasma, las protenas marcadas radiactivamente aparecieron en una parada en el
complejo de Golgi en el medio de su viaje. Adems, nunca hubo un punto en el tiempo
donde no se limitaron las protenas marcadas radiactivamente a vesculas. La observacin
de que el complejo de Golgi estaba involucrado en protenas de secrecin fue
sorprendente e intrigante. Para abordar a fondo el papel de este orgnulo en la secrecin
de la protena, Palade volvi a in vitro de pulso-caza experimentos, lo que permiti un
seguimiento ms preciso de la suerte de protenas marcadas. En esta tcnica de marcado,
las clulas se exponen a un precursor radio marcado, en este caso [3H] leucina, durante
un corto perodo de tiempo conocido como el "pulso". El precursor radiactivo es sustituido
por su forma no marcada por un perodo subsiguiente "persecucin". Las protenas
sintetizadas durante el perodo de pulso sern etiquetados y se detectaron por auto
radiografa, mientras que los sintetizados durante el perodo de caza, siendo no marcado,
no ser detectado. Palade comenz cortando el pncreas de cerdo de guinea en rodajas
gruesas, que a continuacin se incub durante 3 minutos en un medio que contena [3H]
leucina. Al final del impulso, se aadi un exceso de leucina no marcado.Los cortes de
tejido se fijaron a continuacin ya sea para auto radiografa o utilizados para el
fraccionamiento celular. Para asegurar que sus resultados eran un reflejo exacto de la
secrecin de la protena in vivo, Palade meticulosamente caracteriza el sistema. Una vez
convencido de que su sistema in vitro imita con precisin la secrecin de la protena in
vivo, procedi al experimento crtico. Los cortes de tejido los marco mediante pulso con [
3 H] leucina durante 3 minutos, a continuacin, persigui la etiqueta para el 7, 17, 37, 57,
y 117 minutos con leucina sin etiquetar. La radiactividad, una vez ms confinado en
vesculas, se inici en el RE, luego viaja en vesculas del complejo de Golgi, y se mantuvo
en las vesculas al pasar a travs del aparato de Golgi y en la membrana plasmtica (ver
Figure17.1). A medida que las vesculas viajaron ms lejos a lo largo de la va, se volvieron
ms densas con la protena radiactiva. Desde su notable serie de auto radiogramas en
diferentes momentos de persecucin, Palade llego a la conclusin de que las protenas
secretadas viajan en vesculas del RE al Golgi y en la membrana plasmtica, y que a lo
largo de este proceso permanecen en vesculas y no lo hacen mezclar con el resto de la
clula
DISCUSION
Los experimentos de Palade dieron los bilogos la primera mirada clara en las protenas
que viajan a travs de la va secretora. Sus estudios sobre las clulas exocrinas
pancreticas produjeron dos observaciones seminales. En primer lugar, que las protenas
secretadas atraviesan el complejo de Golgi en su camino fuera de la clula. Esto fue la
primera funcin asignada al complejo de Golgi. En segundo lugar, protenas secretadas
nunca se mezclan con otras protenas celulares; que son segregados en vesculas a lo largo
de la va. Estos hallazgos se basan en dos aspectos importantes del diseo experimental.
Uso cuidadoso de Palade de electrones microscopa y auto radiografa le permitieron
mirar los detalles finos de la va. De igual importancia fue la eleccin de un tipo de clula
dedicada a la secrecin, clula pancretica exocrina, como un sistema modelo. En un tipo
de clula diferente, cantidades significativas de protenas no tambin podran haber sido
producidas durante el pulso, que puede dar lugar a resultados ambiguos.
El trabajo de Palade sent las bases para estudios ms detallados.Una vez que la ruta de
secrecin fue claramente descrita, campos enteros de la investigacin se abrieron a la
investigacin, en la sntesis y el movimiento de ambas protenas secretadas y de
membrana. Para este trabajo pionero, Palade fue galardonado con el Premio Nobel de
Fisiologa y Medicina en 1974