Joan David Ayala Agudelo*, MVZ Est, Daniel Castrillon Pulgarin, MVZ Est. Universidad de Crdoba, Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia. Berastegui, Colombia, Curso Biologia Molecular. *Correspondencia: halo.3.joan@gmail.com
OBJETIVO GENERAL: Obtener ADN genmico bacteriano de ptima calidad y cantidad para ser utilizado en tcnicas de biologa molecular. OBJETIVOS ESPECIFICOS: Adquirir habilidades y destrezas del manejo de los materiales utilizados para la implementacin de la tcnica IN HOUSE para la extraccin de ADN bacteriano. Conocer las funciones especficas de cada uno de los reactivos utilizados para esta tcnica de extraccin de ADN. Conocer los pasos primordiales para la extraccin de ADN como son: Lisis celular, desnaturalizacin de protenas y precipitacin de ADN. INTRODUCCION
Todo estudio de biologa molecular implica la disponibilidad de muestras de cidos nuclecos o protenas. En la mayora de los casos es el ADN. Las cantidades necesarias de ADN para realizar estos estudios son lo suficientemente pequeas, tanto como cantidades en nanogramos.
Las tcnicas de biologa molecular para la extraccin de ADN bacteriano son relativamente sencillas. El ADN es estable y casi indestructible dentro de la clula bacteriana, mostrando fragilidad tan solo fuera de la clula a enzimas de restriccin una vez que la clula es lisada.
La purificacin de ADN consta de los siguientes pasos: Lisis de la pared bacteriana Desnaturalizacin de protenas Precipitacin y rehidratacin del ADN
La lisis de la pared bacteriana se realiza por adicin de protenas enzimticas que hidrolizan los mucopolisacaridos y el peptidoglicano, tambin, la lisis se puede ejecutar por el empleo de detergentes como el dodecil sulfato de sodio (SDS), deoxicolato de sodio o por el uso de altas temperaturas (ebullicin). El uso de sales permiten quelar protenas y precipitarlas, o el uso de solventes orgnicos como el alcohol isoamilico para separar las protenas del ADN. Las protenas pierden su solubilidad y precipitan, permitiendo separar el sobrenadante que contiene el ADN del precipitado que contiene las protenas desnaturalizadas. Finalmente el ADN es precipitado y purificado por el uso de etanol e isopropanol, lo que permite que est sea rehidratado por la adicin de agua ultrapura o bien por el uso de una solucin buffer TE (Tris 10mM, EDTA 10 mM pH 8,0).
El ADN purificado es conveniente para una variedad de aplicaciones, incluyendo PCR, digestin con enzimas de restriccin e hibridacin.
MATERIALES Y METODOS
Aislamiento de ADN genmico de bacterias gram-negativas (Salmonella)
Reactivo Cantidad en microlitros Cantidad en mililitros Buffer TEG 200 ul 0.20000 ml Buffer Lissis 400 ul 0.40000 ml Acetato de potacio 300 ul 0.30000 ml Isopropanol 480 ul 0.48000 ml
1. Centrifugamos el cultivo por 10 minutos a una gravedad de 5.100 xG, a 4C Se llevo el eppendorf que contenia las bacterias suspendidas en el buffer TEG, a la centrifuga y se le aumenta 5.100 veces la Gravedad, Sabiendo que la gravedad de la tierra es de 9.8 m/s 2
por un tiempo de 10 minutos y dejamos enfriar a temperatura ambiente. Logrando con esto que las bacterias se fijen a la pared basal del eppendorf y en el sobrenadante (parte liquida) quedan las sobras bacterianas que son desechadas al terminar de centrifugar. 2. Adicin del buffer TEG (TRI EDTA GLUCOSA). Utilizando la pipeta exclusiva de clonacin le agregamos 200 ul del buffer TEG el cual tiene un pH de 7.5, se resuspende nuevamente teniendo en cuenta que se debe hacer con mayor fuerza debido a que las bacterias se encuentran fijadas por la anterior centrifugacin, posteriormente dejamos reposar a temperatura ambiente por 5 minutos. 3. Adicin del buffer lisis. Luego se le adicion al eppendorf 400 ul de buffer lisis, el cual contiene hidrixido de sodio, SDS y pH 8, despues se incubo a 4C en una caja que contiene hielo por un tiempo de 5 minutos. Es importante la observacin de la reaccin que se presenta, la cual describiremos posteriormente en el analisis de resultados. 4. Adicin de acetato de potasio(KCH3CO2) 3molar. Le agregamos al eppendorf 300 ul de acetato de potasio el cual tiene concentracin 3 Molar Luego se incubo por 5 minutos a 4C, posteriormente, se sometio a la centrifuga por 10 minutos, infringiendole 15.355 xG a 25C 5. Adicin de isopropanol ((CH3)2CHOH) 96% Le agregamos 480 ul de isopropanol Cubrimos el eppendorf y posteriormente lo re-suspendemos, lo cual nos permite observar una especie de un hilo transparente Luego se incuba por 10 minutos a 4C Se lleva a la centrifuga por 10 minutos donde se le infringe 15.355 Gravedad a 4C Descartamos el sobrenadante, donde se evapora el alcohol Le adicionamos 75 ul de buffer TE con un Ph de 8.8 Observamos el ADN.
ANALISIS DE RESULTADOS
Utilizamos Bacterias Salmonella Clasificacin Cientifica Dominio Bacteria Filo Proteobaceria Clase Proteobacteria gamma Orden Enterobacteriales Familia Enterobacteriaceae Genero Salmonella
1) En el primer prosedimiento se adecuo la bacteria para poder trabajar con ella en el laboratorio, mediante los pasos mensionados anteriormente.
2) En este procedimiento se observo que cuando se la agrega la Bacteria al eppendorf, y despues de sacarla de la centrifuga, aparese en el fondo un precipitado (bacterias). Esto sucede, ya que las Bacterias se encuentran dispersas en un medio acuoso (TEG), y al momento de infringirle una gravedad fuera de lo normal (5100G), hace que las Bacterias dispersas se aglomeren en un solo sitio, ayudandonos as a recoger las bacterias y tenerlas en un sitio especifico, para la utilizacion de la sustancia de interes (bacterias), y luego desechar el sobrenadante (resto del cultivo).
3) En este procedimiento se le agrega el buffer TEG debido a que cumple diversas funciones con cada uno de sus componentes nesasarias para continuar con el procedimiento de extraccin del ADN bacteriano como son: funciones de glucosa para mantener la presin osmtica, mientras que el Tris amortigua las clulas a pH 8. O. El EDTA se une a los cationes divalentes en la bi-capa lipdica, debilitando as la envoltura celular, preparndola as posteriormente para la lisis y se deja en reposo para asegurarse que el TEG sea asimilado en su totalidad por las bacterias.
4) En este procedimiento se observo que cambia de color transparente, a un color lila, al igual que cambio su consistensia, tornandose un poco viscosa. Esto sucede, ya que adicionado el buffer TEG, el cual debilito la envoltura celular, y posteriormente agregarle el Buffer Lisis, ste rompe la envoltura celular dbil al igual que la nuclear, lo que ocaciona que todo el contenido intracelular salga al medio exterior donde est disuelto, en este caso acuoso. Por esta razn, cambio su consistencia liquida a viscosa, ademas como se trata de una bacteria gram -, por lo que tiene una capa lipidica delgada, no se tie de color azul oscuro o violeta, por lo que tie de rosado y como se habia sometido previamente a diversos pasos, fue perdiendo su coloracion inicial, por lo cual se torna un poco de color lila. Ademas se incuba a 5C, porque a esta temperatura este tipo de bacteria tiene las condiciones optimas para un mayor crecimiento, ademas en el medio de cultivo, contaba con aire, ya que estas bacterias son extrictamente aeorabias, es decir se reproducen solamente en presencia de aire.
5). En este procedimiento despues de agregarles isopropanol observamos ADN un color purpura mas oscuro y al fondo las proteinas, esto se da porque La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), y deshidratacin de la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitacin. Luego se lleva a la centrifuga, infringindole gravedad (15355G), con el fin de que el ADN, se adhiera al tubo, para que no se pierda al momento de desechar el medio acuoso y evaporar el alcohol.
6) Adicin del buffer TE
En este procedimiento, luego de que el alcohol se evaporara, el ADN quedo adherido al tubo que los contena, el ADN queda adherido al tubo por la gravedad que se le infringe previamente, luego se le agrega buffer TE (tris-Edta), que su funcin es de conservar al ADN y evitar su degradacin.
INFORME DE LABORATORIO (POR GRUPO DE TRABAJO)
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS.
1. Qu son las endonucleasas?
Las endonucleasas o enzimas de restriccin son enzimas de restriccin tienen como funcin principal ser catalizadores de protena, utilizadas por las bacterias para destruir los virus invasores. Las enzimas de restriccin cortan el ADN en sitios muy especficos, en las secciones del ADN que consisten en cadenas de cortas bases de ADN, estas son conocidas como secuencias de reconocimiento.
2. Cmo previene usted la contaminacin con endonucleasas en la extraccin de ADN?
Las altas concentraciones de (5M) de NaCL se pueden usan para prevenir la contaminacin de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN pudiendo inhibir la accin de enzimas como polimerasas, ligasas, y endonucleasas.
Tambien una forma fcil para evitar la contaminacin de endonucleasas, es que al utilizar una micropipeta siempre utilizar una punta diferente para cada procedimiento es decir utilizara una especfica para las enzimas de restriccin
3. Qu funcin cumple la lisozima, el fenol cloroformo, el SDS, el isopropanol, en la extraccin de ADN?
La lisozima cumple la funcin de suavizar las membranas de las clulas reduciendo notablemente su integridad, combinacin de fenol y cloroformo a menudo se utilizan como disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos con objeto de eliminar las protenas. El SDS (sodio dedecil sulfato), solubiliza protenas, tejidos y membranas evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol. 4. Un ADN de buena calidad cmo se observa en un gel de agarosa?
Se observa la separacin de fragmentos de ADN
DISCUSION Con la realizacin de este laboratorio de Biologa Molecular obtuvimos importantes conocimientos, habilidades y destrezas para la extraccin de ADN, En este caso de la Bacteria Salmonella, Mediante el procedimiento IN HOUSE utilizado pudimos seguir de manera secuencial todos los cambios que va teniendo la bacteria, logrando romper las membranas que protegen la informacion genetica, fijarlas y concervarlas para su posterior estudio. Aunque existen muchos procedimientos para la extraccin del ADN, logramos tener una idea clara acerca de cmo se puede obtener la informacin genetica y asi entender, como es posible que aunque podamos llegar a paracernos mucho a un familiar siempre hay algo que nos diferencia y esa informacin que hace posible tal diferencia se encuentra precisamente en el ADN. Para nosotros como futuros Medicos Veterinarios Zootecnistas es muy importante profundizar en cualquir fenomeno biologico y explicar la naturaleza intima de los procesos que determinan una propiedad o una funcion de los seres vivos como es el caso de las caracteristicas fisicas, geneticas entre otras que posee cada animal y que los hace unicos.