PRACTICA DE LABORATORIO

EXTRACCIN DE ADN BACTERIANO

Joan David Ayala Agudelo*, MVZ Est, Daniel Castrillon Pulgarin, MVZ
Est.
Universidad de Crdoba, Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad
Medicina Veterinaria y Zootecnia. Berastegui, Colombia, Curso Biologia
Molecular.
*Correspondencia: halo.3.joan@gmail.com

OBJETIVO GENERAL:
Obtener ADN genmico bacteriano de ptima calidad y cantidad para ser
utilizado en tcnicas de biologa molecular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Adquirir habilidades y destrezas del manejo de los materiales
utilizados para la implementacin de la tcnica IN HOUSE para la
extraccin de ADN bacteriano.
Conocer las funciones especficas de cada uno de los reactivos
utilizados para esta tcnica de extraccin de ADN.
Conocer los pasos primordiales para la extraccin de ADN como son:
Lisis celular, desnaturalizacin de protenas y precipitacin de ADN.
INTRODUCCION

Todo estudio de biologa molecular implica la disponibilidad de muestras
de cidos nuclecos o protenas. En la mayora de los casos es el ADN.
Las cantidades necesarias de ADN para realizar estos estudios son lo
suficientemente pequeas, tanto como cantidades en nanogramos.

Las tcnicas de biologa molecular para la extraccin de ADN bacteriano
son relativamente sencillas. El ADN es estable y casi indestructible
dentro de la clula bacteriana, mostrando fragilidad tan solo fuera de la
clula a enzimas de restriccin una vez que la clula es lisada.

La purificacin de ADN consta de los siguientes pasos:
Lisis de la pared bacteriana
Desnaturalizacin de protenas
Precipitacin y rehidratacin del ADN

La lisis de la pared bacteriana se realiza por adicin de protenas
enzimticas que hidrolizan los mucopolisacaridos y el peptidoglicano,
tambin, la lisis se puede ejecutar por el empleo de detergentes como
el dodecil sulfato de sodio (SDS), deoxicolato de sodio o por el uso de
altas temperaturas (ebullicin). El uso de sales permiten quelar
protenas y precipitarlas, o el uso de solventes orgnicos como el alcohol
isoamilico para separar las protenas del ADN. Las protenas pierden su
solubilidad y precipitan, permitiendo separar el sobrenadante que
contiene el ADN del precipitado que contiene las protenas
desnaturalizadas. Finalmente el ADN es precipitado y purificado por el
uso de etanol e isopropanol, lo que permite que est sea rehidratado por
la adicin de agua ultrapura o bien por el uso de una solucin buffer TE
(Tris 10mM, EDTA 10 mM pH 8,0).

El ADN purificado es conveniente para una variedad de aplicaciones,
incluyendo PCR, digestin con enzimas de restriccin e hibridacin.



























MATERIALES Y METODOS

Aislamiento de ADN genmico de bacterias gram-negativas
(Salmonella)

Reactivo Cantidad en
microlitros
Cantidad en mililitros
Buffer TEG 200 ul 0.20000 ml
Buffer Lissis 400 ul 0.40000 ml
Acetato de potacio 300 ul 0.30000 ml
Isopropanol 480 ul 0.48000 ml

1. Centrifugamos el cultivo por 10 minutos a una gravedad de
5.100 xG, a 4C
Se llevo el eppendorf que contenia las bacterias suspendidas en el
buffer TEG, a la centrifuga y se le aumenta 5.100 veces la
Gravedad, Sabiendo que la gravedad de la tierra es de 9.8 m/s
2

por un tiempo de 10 minutos y dejamos enfriar a temperatura
ambiente. Logrando con esto que las bacterias se fijen a la pared
basal del eppendorf y en el sobrenadante (parte liquida) quedan
las sobras bacterianas que son desechadas al terminar de
centrifugar.
2. Adicin del buffer TEG (TRI EDTA GLUCOSA).
Utilizando la pipeta exclusiva de clonacin le agregamos 200 ul
del buffer TEG el cual tiene un pH de 7.5, se resuspende
nuevamente teniendo en cuenta que se debe hacer con mayor
fuerza debido a que las bacterias se encuentran fijadas por la
anterior centrifugacin, posteriormente dejamos reposar a
temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Adicin del buffer lisis.
Luego se le adicion al eppendorf 400 ul de buffer lisis, el cual
contiene hidrixido de sodio, SDS y pH 8, despues se incubo a
4C en una caja que contiene hielo por un tiempo de 5 minutos.
Es importante la observacin de la reaccin que se presenta, la
cual describiremos posteriormente en el analisis de resultados.
4. Adicin de acetato de potasio(KCH3CO2) 3molar.
Le agregamos al eppendorf 300 ul de acetato de potasio el cual
tiene concentracin 3 Molar
Luego se incubo por 5 minutos a 4C, posteriormente, se sometio
a la centrifuga por 10 minutos, infringiendole 15.355 xG a 25C
5. Adicin de isopropanol ((CH3)2CHOH) 96%
Le agregamos 480 ul de isopropanol
Cubrimos el eppendorf y posteriormente lo re-suspendemos, lo
cual nos permite observar una especie de un hilo transparente
Luego se incuba por 10 minutos a 4C
Se lleva a la centrifuga por 10 minutos donde se le infringe 15.355
Gravedad a 4C
Descartamos el sobrenadante, donde se evapora el alcohol
Le adicionamos 75 ul de buffer TE con un Ph de 8.8
Observamos el ADN.





























ANALISIS DE RESULTADOS

Utilizamos Bacterias Salmonella
Clasificacin Cientifica
Dominio Bacteria
Filo Proteobaceria
Clase Proteobacteria
gamma
Orden Enterobacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Genero Salmonella


1) En el primer prosedimiento se adecuo la bacteria para poder trabajar
con ella en el laboratorio, mediante los pasos mensionados
anteriormente.

2) En este procedimiento se observo que cuando se la agrega la
Bacteria al eppendorf, y despues de sacarla de la centrifuga, aparese en
el fondo un precipitado (bacterias). Esto sucede, ya que las Bacterias se
encuentran dispersas en un medio acuoso (TEG), y al momento de
infringirle una gravedad fuera de lo normal (5100G), hace que las
Bacterias dispersas se aglomeren en un solo sitio, ayudandonos as a
recoger las bacterias y tenerlas en un sitio especifico, para la utilizacion
de la sustancia de interes (bacterias), y luego desechar el sobrenadante
(resto del cultivo).

3) En este procedimiento se le agrega el buffer TEG debido a que
cumple diversas funciones con cada uno de sus componentes nesasarias
para continuar con el procedimiento de extraccin del ADN bacteriano
como son: funciones de glucosa para mantener la presin osmtica,
mientras que el Tris amortigua las clulas a pH 8. O. El EDTA se une a
los cationes divalentes en la bi-capa lipdica, debilitando as la envoltura
celular, preparndola as posteriormente para la lisis y se deja en
reposo para asegurarse que el TEG sea asimilado en su totalidad por las
bacterias.


4) En este procedimiento se observo que cambia de color transparente,
a un color lila, al igual que cambio su consistensia, tornandose un poco
viscosa. Esto sucede, ya que adicionado el buffer TEG, el cual debilito la
envoltura celular, y posteriormente agregarle el Buffer Lisis, ste
rompe la envoltura celular dbil al igual que la nuclear, lo que ocaciona
que todo el contenido intracelular salga al medio exterior donde est
disuelto, en este caso acuoso. Por esta razn, cambio su consistencia
liquida a viscosa, ademas como se trata de una bacteria gram -, por lo
que tiene una capa lipidica delgada, no se tie de color azul oscuro o
violeta, por lo que tie de rosado y como se habia sometido
previamente a diversos pasos, fue perdiendo su coloracion inicial, por lo
cual se torna un poco de color lila. Ademas se incuba a 5C, porque a
esta temperatura este tipo de bacteria tiene las condiciones optimas
para un mayor crecimiento, ademas en el medio de cultivo, contaba con
aire, ya que estas bacterias son extrictamente aeorabias, es decir se
reproducen solamente en presencia de aire.

5). En este procedimiento despues de agregarles isopropanol
observamos ADN un color purpura mas oscuro y al fondo las proteinas,
esto se da porque La precipitacin de los cidos nucleicos permite su
purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de
las cargas negativas (mediante el aadido de sales), y deshidratacin de
la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitacin.
Luego se lleva a la centrifuga, infringindole gravedad (15355G), con el
fin de que el ADN, se adhiera al tubo, para que no se pierda al momento
de desechar el medio acuoso y evaporar el alcohol.

6) Adicin del buffer TE

En este procedimiento, luego de que el alcohol se evaporara, el ADN
quedo adherido al tubo que los contena, el ADN queda adherido al tubo
por la gravedad que se le infringe previamente, luego se le agrega
buffer TE (tris-Edta), que su funcin es de conservar al ADN y evitar su
degradacin.









INFORME DE LABORATORIO (POR GRUPO DE TRABAJO)

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS.

1. Qu son las endonucleasas?

Las endonucleasas o enzimas de restriccin son enzimas de
restriccin tienen como funcin principal ser catalizadores de
protena, utilizadas por las bacterias para destruir los virus
invasores. Las enzimas de restriccin cortan el ADN en sitios muy
especficos, en las secciones del ADN que consisten en cadenas
de cortas bases de ADN, estas son conocidas como secuencias de
reconocimiento.

2. Cmo previene usted la contaminacin con endonucleasas en la
extraccin de ADN?

Las altas concentraciones de (5M) de NaCL se pueden usan para
prevenir la contaminacin de la muestra con polisacridos que
afectan la pureza del ADN pudiendo inhibir la accin de enzimas
como polimerasas, ligasas, y endonucleasas.

Tambien una forma fcil para evitar la contaminacin de
endonucleasas, es que al utilizar una micropipeta siempre utilizar
una punta diferente para cada procedimiento es decir utilizara una
especfica para las enzimas de restriccin

3. Qu funcin cumple la lisozima, el fenol cloroformo, el SDS, el
isopropanol, en la extraccin de ADN?

La lisozima cumple la funcin de suavizar las membranas de las
clulas reduciendo notablemente su integridad, combinacin de
fenol y cloroformo a menudo se utilizan como disolventes para
eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos con objeto de
eliminar las protenas. El SDS (sodio dedecil sulfato), solubiliza
protenas, tejidos y membranas evitando que una cantidad
significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos
celulares. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una
precipitacin con isopropanol.
4. Un ADN de buena calidad cmo se observa en un gel de agarosa?

Se observa la separacin de fragmentos de ADN


















DISCUSION
Con la realizacin de este laboratorio de Biologa Molecular obtuvimos
importantes conocimientos, habilidades y destrezas para la extraccin
de ADN, En este caso de la Bacteria Salmonella, Mediante el
procedimiento IN HOUSE utilizado pudimos seguir de manera secuencial
todos los cambios que va teniendo la bacteria, logrando romper las
membranas que protegen la informacion genetica, fijarlas y concervarlas
para su posterior estudio.
Aunque existen muchos procedimientos para la extraccin del ADN,
logramos tener una idea clara acerca de cmo se puede obtener la
informacin genetica y asi entender, como es posible que aunque
podamos llegar a paracernos mucho a un familiar siempre hay algo que
nos diferencia y esa informacin que hace posible tal diferencia se
encuentra precisamente en el ADN.
Para nosotros como futuros Medicos Veterinarios Zootecnistas es muy
importante profundizar en cualquir fenomeno biologico y explicar la
naturaleza intima de los procesos que determinan una propiedad o una
funcion de los seres vivos como es el caso de las caracteristicas fisicas,
geneticas entre otras que posee cada animal y que los hace unicos.