Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 1

C A P T U L O 2 . 9 . 1 0 .
TOXOPLASMOSI S
RESUMEN
Definicin y descripcin de la enfermedad: La toxoplasmosis es una infeccin zoonsica de los
animales causada por el protozoo parsito Toxoplasma gondii. Puede infectar a todos los animales
de sangre caliente y, aunque la infeccin no causa enfermedad clnica en la mayora de las
especies animales, en algunas de ellas causa una enfermedad aguda potencialmente letal, y en
otras, sobre todo en ovejas y cabras, puede manifestarse como enfermedad de la gestacin,
multiplicndose en la placenta y el feto. En estos animales puede provocar abortos o el nacimiento
de corderos/cras dbiles, lo que puede ir acompaado de fetos momificados. En estos casos, las
caractersticas de las membranas intercotiledonarias placentales son normales, pero en los
cotiledones pueden verse focos blancos de necrosis, de aproximadamente 23 mm de dimetro.
Microscpicamente, estos focos aparecen como reas de necrosis por coagulacin que estn
relativamente libres de inflamacin. La inflamacin, cuando existe, no es supurativa. Los
taquizotos de Toxoplasma se observan solo raramente asociados con estos focos, habitualmente
en la periferia de la lesin. El examen del cerebro puede revelar microgliosis focal. Las lesiones a
menudo tienen un pequeo foco central de necrosis que se podra mineralizar. Con frecuencia se
presenta leucomalacia focal en la sustancia blanca cerebral, debida a la anoxia producida a
consecuencia de la patologa placentaria. La microgliosis focal es ms especfica cuando la
leucomalacia refleja una patologa placentaria, pero puede ocurrir en otras condiciones patolgicas
en las que se compromete la placenta y que incluyen, aunque con poca frecuencia, la clamidiosis
ovina. La infeccin en cerdos puede causar prdidas fetales severas en cerdas gestantes pero con
ms frecuencia es leve e inapreciable. La infeccin aguda fatal afecta a los monos del Nuevo
Mundo, los marsupiales y algunos otros animales.
Identificacin del agente: Toxoplasma gondii es un parsito intracelular obligado, que tiene un
ciclo sexual en los flidos y un ciclo asexual de dos fases en los animales de sangre caliente.
Comprende fundamentalmente tres linajes clnicos (I, II y III). En la fase aguda de la infeccin, los
taquizotos se multiplican en las clulas causando diversos grados de destruccin de tejidos y, en
los casos fatales, pueden demostrase en lquido asctico o en frotis de pulmn. Al iniciarse la
respuesta inmune, los taquizotos se transforman en bradizotos que se multiplican lentamente en
las clulas hasta producir quistes tisulares. En las ovejas, cabras y cerdas que abortan, T. gondii
es a menudo difcil de encontrar en secciones de tejidos, y es ms probable su presencia en
secciones de cerebro y placenta. Se puede confirmar su identidad mediante inmunohistoqumica,
mientras que se puede emplear la reaccin en cadena de la polimerasa para identificar el ADN del
parsito en los tejidos. El aislamiento de T. gondii a partir de muestras es caro y lento, pero, si es
preciso, es mejor llevarlo a cabo inoculando ratones con homogeneizado derivado de cerebro fetal
o placenta. El ciclo de vida sexual del parsito tiene lugar de forma exclusiva en las clulas
epiteliales del intestino de los felinos y puede desembocar en la excrecin de grandes cantidades
de ooquistes en las heces. Los ooquistes pueden permaneces viables en el medio ambiente
durante muchos meses.
Pruebas serolgicas: La prueba de tincin es el mtodo serolgico establecido desde hace ms
tiempo, y en muchos sentidos representa el patrn de oro, al menos en humanos. La prueba de
tincin emplea taquizotos de Toxoplasma virulentos vivos, un factor accesorio como
complemento y suero problema. Cuando el anticuerpo especfico acta sobre los taquizotos, estos
ltimos no se tien uniformemente con azul de metileno alcalino. La prueba no se puede realizar en
algunas especies. Adems, como se emplea Toxoplasma vivo, la prueba conlleva un riesgo
potencial de infeccin en humanos y, por otra parte, resulta cara su realizacin. La prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) es ms segura y proporciona ttulos comparables a los de la
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prueba de tincin y puede utilizarse para diferenciar anticuerpos IgM e IgG. La prueba de
aglutinacin directa y la de aglutinacin con ltex son relativamente rpidas y ninguna de las dos
requiere instrumental de laboratorio complicado. La tcnica del enzimoinmunoensayo requiere un
equipamiento de laboratorio algo ms sofisticado pero permite manejar gran nmero de muestras y
no est sujeta a la interpretacin humana de los resultados.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Se dispone comercialmente de una
vacuna compuesta por taquizotos vivos de T. gondii para ser empleada en ovejas en algunos
pases europeos y en Nueva Zelanda. La vacuna se administra como una suspensin concentrada
de taquizotos con un adecuado diluyente y sistema de presentacin. La vacuna se debe mantener
y manipular estrictamente de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, puesto que tiene un
periodo de validez muy corto.
A. INTRODUCCIN
Toxoplasma gondii es un protozoo parsito intracelular obligado, de tipo zoonsico, que tiene la capacidad de
infectar a todos los animales de sangre caliente, y aunque la infeccin no causa enfermedad clnica en la mayor
parte de las especies de animales, en algunas de ellas causa enfermedad aguda potencialmente mortal y, en
otras, sobre todo en ovejas y cabras, se manifiesta como enfermedad de la gestacin multiplicndose en la
placenta y el feto. La infeccin aguda fatal afecta a los monos del Nuevo Mundo (8), los marsupiales (6) y a otros
pocos animales (vase ms adelante). En estos casos, la sintomatologa puede incluir linfoadenopata,
hepatomegalia, neumona intersticial y sntomas de tipo nervioso. En la necropsia, se observa que los ndulos
linfticos, el bazo y el hgado pueden aumentar de tamao y el hgado puede tener focos plidos. Las ovejas,
cabras y cerdos contraen una infeccin primaria durante la gestacin que puede provocar infertilidad manifiesta,
mortinatos y aborto, dependiendo de la fase de la gestacin en la que se contrae la infeccin. En un caso tpico
de aborto, una oveja o una gama infectada en la etapa intermedia de gestacin produce una cra de
cordero/nacida muerta unos pocos das antes de la fecha prevista para el nacimiento. El feto abortado se
acompaa a menudo de un hermano dbil o de un feto momificado (5). La oveja o la gama permanecen
asintomticas. En tales casos, los cotiledones placentarios estn tpicamente moteados con focos blancos de
alrededor de 23 mm de dimetro, mientras que las membranas intercotiledonarias se encuentran normales. La
infeccin en la etapa temprana de la gestacin, cuando el feto tiene solo un sistema inmune rudimentario,
provoca la muerte fetal y la reabsorcin. En este caso la madre puede presentarse como estril, lo que a la larga
puede parecer un problema de infertilidad del rebao. Las madres que resultan infectadas en la ltima etapa de
la gestacin previsiblemente producirn descendencia infectada pero clnicamente normal. Despus de la
infeccin, ya sea durante la gestacin o fuera de ella, no es de esperar que el parsito cause abortos en las
siguientes gestaciones. Aunque en investigaciones recientes se ha cuestionado esta conclusin (13, 38), la
mayora de las opiniones sostienen que el recrudecimiento de la infeccin persistente durante la gestacin, que
es la causa de abortos sucesivos, no se da con una frecuencia significativa (28). La infeccin en los cerdos
puede provocar graves prdidas fetales en cerdas gestantes, pero en las condiciones en las que se encuentran
las explotaciones ganaderas intensivas modernas, cuando es mnima o inexistente la contaminacin de las
instalaciones y los alimentos por ooquistes de T. gondii, es presumible que en general la infeccin tenga poco
impacto y cause solamente sntomas leves o imperceptibles (24). No obstante, cuando los cerdos se mantienen
fuera de las instalaciones en superficies amplias, es mucho ms probable que entren en contacto con los
ooquistes, por lo que es de esperar una mayor presencia de la infeccin en tales condiciones (21).
Toxoplasma gondii es un parsito intracelular obligado que tiene un ciclo asexual de dos fases en los animales de
sangre caliente y un ciclo sexual en los flidos. El parsito comprende principalmente tres linajes clonales (I, II y
III); los tipos II y III se asocian con la enfermedad en animales, mientras que el tipo II es la forma predominante
en la enfermedad humana (17, 20). En el ciclo asexual, los dos estadios de desarrollo son el taquizoto de
multiplicacin rpida y el bradizoto de multiplicacin lenta. En la infeccin aguda, los taquizotos penetran
activamente en las clulas del hospedador donde se multiplican causando la rotura celular y la liberacin de los
organismos localmente y en el torrente sanguneo. Cuando el hospedador desarrolla inmunidad, el parsito
mantiene su tamao y forma originales pero se transforma en el estadio de bradizoto y se multiplica ms
lentamente en los quistes tisulares hasta establecer una infeccin persistente. Estos quistes tisulares
microscpicos estn presentes con mayor frecuencia en el cerebro y en el msculo esqueltico y representan la
etapa quiescente del parsito dentro del hospedador. Los quistes viables de los tejidos dentro del msculo
(carne) son una fuente significativa de infeccin en humanos. En los animales que sucumben a la infeccin
aguda, los taquizotos pueden observarse en lquido asctico o en frotis de pulmn as como en cortes de tejido
de hgado y de otros rganos afectados.
El ciclo sexual ocurre en clulas enteroepiteliales del husped felino permanente y desemboca en la produccin
de ooquistes de Toxoplasma. Tras la infeccin primaria de un gato, los ooquistes pueden extenderse por las
heces durante varios das. Los ooquistes esporulan en el medio ambiente durante los siguientes 15 das
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(dependiendo de la aireacin, la humedad y la temperatura), tras lo cual se convierten en infectivos. Son muy
resistentes a las condiciones medioambientales y pueden permanecer infectivos durante un ao o ms. Los
ooquistes esporulados tienen un dimetro de 11 13 m y cada uno de ellos contiene cuatro esporozoitos en
cada uno de los dos esporoquistes (11). Cuando un animal susceptible ingiere ooquistes esporulados, se liberan
los esporozoitos que penetran el recubrimiento intestinal, se convierten en taquizotos y establecen la infeccin.
En ovejas, cabras, cerdos, caballos y hombre, los quistes de tejidos pueden permanecer durante el resto de la
vida del individuo (11). Habitualmente no produce enfermedad clnica en el ganado vacuno, ni en camlidos o
ciervos, pero, tal como se ha observado, pueden causar la muerte de monos del Nuevo Mundo, marsupiales, y
algunos otros animales como las liebres (Lepus europaeus; L. timidus) (16), el gato de Pallas (2), el zorro del
rtico (32), algunas aves (12) y mamferos marinos (15). Se sugiere que estos y otros animales afectados de
forma semejante han estado mnimamente expuestos a T. gondii en su hbitat natural durante periodos de
tiempo muy largos, lo que les convierte en especialmente vulnerables al parsito.
El aborto de ovejas y cabras causado por T. gondii debe diferenciarse del provocado por otros agentes
infecciosos, incluyendo las infecciones por Chlamydophila abortus (vase el captulo 2.7.7. Aborto enzotico de
ovejas), Coxiella burnetii (vase el captulo 2.1.12. Fiebre Q), Brucella melitensis (vase el captulo 2.7.2.
Brucelosis caprina y ovina [excluyendo Brucella ovis]), Campylobacter fetus (vase el captulo 2.4.5.
Campilobacteriosis genital bovina), Salmonella spp. (vase el captulo 2.7.2), Enfermedad de la Frontera (vase
el captulo 2.7.1), y los virus que causan la Lengua Azul, la enfermedad de Wesselsbron y la enfermedad de
Akabane. En cerdos, Brucella suis (vase el captulo 2.8.5.) puede causar tambin muerte fetal, momificacin y
aborto.
Riesgos para la salud humana
Toxoplasma gondii infecta fcilmente a los seres humanos y, mientras la infeccin es relativamente comn
(aproximadamente el 30% de la poblacin, dependiendo de la edad y del ambiente), la enfermedad clnica es
relativamente inusual. Quienes de forma especial corren el riesgo de desarrollar la enfermedad clnica son las
mujeres embarazadas, ya que el parsito puede plantear una seria amenaza para el feto si la madre resulta
infectada por primera vez durante la gestacin, y los individuos en estado de inmunosupresin, tales como los
pacientes con transplantes de tejidos, pacientes de SIDA, pacientes con ciertos tipos de cncer y los que reciben
ciertas formas de terapia contra el cncer. Estos individuos corren el riesgo de desarrollar una infeccin aguda
letal de no ser tratados. Tambin pueden ser ms susceptibles los nios y ancianos. En ocasiones, las personas
sin inmunodeficiencia aparente pueden desarrollar una enfermedad caracterizada por un malestar general, fiebre
y linfoadenopata. Las principales fuentes de infeccin humana son la ingestin de carne poco cocinada o cruda
que contiene quistes tisulares de T. gondii vivos, la ingestin de verduras crudas o poco cocidas contaminadas
con ooquistes o la exposicin a ooquistes procedentes de heces de gato, que pueden encontrarse en jardines y
en hoyos de arena de parques infantiles. A la toxoplasmosis tambin se la reconoce actualmente como zoonosis
transmitida por el agua (10). Este mtodo de transmisin ocurre all donde el tratamiento del agua es ineficaz o
inexistente y existe una cantidad apreciable de poblacin local de flidos que contamina el agua de las
superficies con ooquistes (1, 10). Ligado a lo anterior tambin se sabe actualmente que los mamferos marinos
se estn infectando con aguas de terrenos contaminados y con aguas sucias urbanas sin tratar (15).
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
a) Aislamiento
La mejor forma de aislar T. gondii procedente de fetos abortados ovinos y caprinos y de membranas fetales
se realiza inoculando ratones de laboratorio. Los mejores tejidos para la inoculacin son cerebro fetal y
cotiledones placentarios, y los resultados ptimos se obtienen con muestras frescas libres de
contaminacin. Las muestras no deben congelarse en ningn momento puesto que el parsito morira.
i) Con precauciones aspticas, se recogen 25 g de cotiledn placentario o tejido cerebral del feto
abortado.
ii) Se homogeneiza el tejido en un volumen igual de 0,3 M de tampn salino fosfato estril (PBS), pH 7,4,
con adicin de antibiticos (100 Unidades Internacionales [UI])/ml de penicilina y 745 UI/ml
estreptomicina) en un homogeneizador stomacher (Seward Laboratory, Londres) u otro equipo de
maceracin adecuado. El tejido cerebral puede ser homogeneizado correctamente pasndolo diez
veces a travs de una aguja del calibre 16 mediante una jeringa.
iii) Se inoculan por va intraperitoneal tres ratones libres de Toxoplasma con 0,5 ml del tejido
homogeneizado.
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iv) Se sacrifican los ratones 68 semanas despus de la inoculacin y se extraen sus cerebros. Tambin
debe conservarse la sangre en esta etapa y el suero se separa y congela a 20C. Asimismo, deben
recogerse los cerebros de los ratones que mueran antes de las 68 semanas.
v) Se homogeniza cada cerebro de ratn con un volumen igual de PBS estril pasndolo diez veces a
travs de una aguja del calibre 16 mediante una jeringa.
vi) Se extiende una gota (5 l) de una suspensin dada en cinco portas.
vii) Se seca y se tie con Giemsa, se deshidrata y se monta bajo un cubreobjetos.
viii) Los portas se examinan al microscopio. Los quistes tisulares aparecen como estructuras circulares
que miden 550 m rellenos de bradizotos en forma de cuarto creciente y teidos de azul.
Un mtodo alternativo para examinar el cerebro de ratn consiste en tomar una pequea porcin de la parte
delantera del cerebro (aproximadamente del tamao de la cabeza de una cerilla) y aplastarla con un
cubreobjetos. Los quistes tisulares se detectarn fcilmente con el microscopio.
Si los tejidos inoculados estn fuertemente infectados con T. gondii, los ratones pueden morir al cabo de 1
2 semanas.
La ausencia de quistes tisulares no implica que se descarte un posible diagnstico positivo. Se debe
analizar el suero de los ratones para detectar la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma (p. ej.
utilizando una prueba de inmunofluorescencia indirecta [IFI]); si este anlisis es tambin negativo, es
improbable la infeccin por Toxoplasma.
b) Secciones de tejidos
En los animales que mueren de toxoplasmosis grave, se puede observar inflamacin mononuclear focal,
con o sin necrosis focal, en varios tejidos, como el hgado, el corazn y los pulmones. Estos ltimos pueden
estar edematosos. Los ndulos linfticos pueden haberse expandido y puede que se produzca o no
necrosis focal con o sin hemorragia. Lo tpico es que los taquizotos de Toxoplasma puedan observarse
asociados con necrosis e inflamacin.
En casos de aborto y de mortinatos en cabras y ovejas, es tpico que los cotiledones placentales afectados
contengan grandes focos de necrosis por coagulacin, que pueden mineralizarse con el tiempo. Tambin es
tpico que cualquier inflamacin asociada sea moderada y no supurativa. Las muestras bien preservadas de
cotiledones placentarios pueden mostrar un edema moderado del mesnquima de las vellosidades fetales
con una hipercelularidad difusa debida a la presencia de grandes clulas mononucleares. A veces son
visibles pequeas cantidades de toxoplasmas intra- y extracelulares, normalmente en la periferia del rea
necrtica o en una vellosidad que est en las etapas tempranas de la infeccin. Los taquizotos de
Toxoplasma son ovoides, de 26 m de largo, con ncleos moderadamente basfilos y localizados en el
centro o hacia el extremo posterior.
En el cerebro fetal se pueden desarrollar lesiones primarias y secundarias. Los focos microgliales,
tpicamente con un centro necrtico y a veces mineralizado y frecuentemente asociado con una meningitis
linfoidea focal leve, representan una respuesta inmune fetal despus de un dao directo por la multiplicacin
local del parsito. Los quistes tisulares de Toxoplasma se encuentran solo raramente, casi siempre en la
periferia de estas lesiones. Tambin es frecuente la leucomalacia focal y se considera que es debida a la
anoxia fetal en la etapa ltima de la gestacin causada por las lesiones avanzadas en el placentoma que
impiden la transferencia de suficiente oxgeno entre la madre y el feto. Estos focos se producen ms
comnmente en los centros de sustancia blanca cerebral, pero a veces tambin en la sustancia blanca
cerebelar. Esta leucomalacia focal sugiere por s sola la enfermedad placentaria o la insuficiencia aguda,
pero los dos tipos de cambios neuropatolgicos, cuando se ven juntos, son tpicos de la infeccin por
Toxoplasma. La confirmacin de la identidad de estructuras tipo T. gondii en secciones de tejido
procedentes de tales casos, as como de ejemplos de toxoplasmosis grave puede llevarse a cabo por
inmunohistoqumica que marca T. gondii intactos o restos antignicos. El mtodo es fcil y sensible y se
emplea con tejidos fijados (incluyendo tejidos de archivo) que pueden tambin exhibir cierto grado de
descomposicin, de modo que en este caso el aislamiento no sera apropiado o posible. Son igualmente
adecuados el mtodo ABC indirecto de la inmunoperoxidasa y la tcnica peroxidasaantiperoxidasa (PAP)
(34).
c) Mtodos de reconocimiento del cido nucleico
Se han desarrollado varias tcnicas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa para detectar el
ADN de T. gondii. Las regiones diana principales son la secuencia repetitiva B1 (3), el gen P30 (SAG1) (31)
o el ARN ribosmico (ARNr) 18S (14). La sensibilidad de la PCR depende del nmero de copias de la
secuencia diana (P30: 1 copia; B1: 35 copias; ARNr: 110 unidades repetidas). Se dispone comercialmente
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de oligonucletidos sintticos de ADN personalizados (ej. www.sigma-genosys.co.uk). Recientemente, se ha
utilizado el mtodo de amplificacin de la secuencia repetitiva B1 para analizar aspirados de lentes de
pacientes humanos con cataratas infectados de forma congnita (25) y se hall que ese mtodo es ms
sensible que el mtodo convencional utilizado (enzimoinmunoensayo [ELISA]). No obstante, aunque la PCR
es extremadamente sensible, en caso de ser ese el nico mtodo disponible, se obtendr un diagnstico
ms fiable si se utiliza en combinacin con otros datos de diagnstico,
Recientemente se ha elaborado una PCR en tiempo real para la cuantificacin y amplificacin de ADN. Es
muy parecida a otros mtodos PCR en uso y puede realizarse en placas de microtitulacin de 96 pocillos.
Tras cada ronda de amplificacin, los tintes fluorognicos se intercalan con el ADN bicatenario y los
resultados, mostrados en una representacin grfica de la amplificacin, permiten la cuantificacin del ADN
del parsito de la muestra. Se ha utilizado la PCR en tiempo real para amplificar y cuantificar el ADN del gen
B1 de T. gondii (7, 23). Esta cuantificacin del ADN del parsito puede utilizarse para establecer el nmero
de parsitos en los tejidos y los lquidos, tales como el lquido amnitico de pacientes sospechosos de
infeccin congnita por T. gondii. (27). La PCR en tiempo real es un mtodo muy sensible y especfico; no
obstante es caro y requiere sistemas de deteccin especializados, por lo que la relacin precio/coste solo se
justifica si se utiliza en laboratorios en los que se analizan grandes cantidades de muestras.
El mtodo siguiente es una forma combinada de la PCR, que amplifica la secuencia de ADN repetitiva B1
(36). El ADN del parsito puede extraerse y purificarse a partir de varios tejidos, incluyendo la placenta, el
sistema nervioso central, el corazn y el msculo esqueltico.
Se retiran los glbulos rojos contaminantes de los tejidos lavando en tampn de lisis Tris/NH
4
Cl 10 mM,
pH 7,6, y a continuacin se centrifugan a 2.000 g durante 15 minutos. Entonces se extrae el ADN a partir
del sedimento resultante y se resuspende en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl
2
1,5 mM que contenga
100 g/ml de proteinasa K y Tween 20 al 0,5%.
Las muestras se incuban a 55C durante al menos 1 hora; entonces se inactiva la proteinasa K mediante
ebullicin. El procedimiento de la PCR se realiza en volmenes de 50 l. La amplificacin del gen B1 se
lleva a cabo segn una modificacin del procedimiento descrito en la ref. 1. La mezcla de reaccin contiene
Tris 10 mM, pH 8,3, MgCl
2
2,5 mM, KCl 40 mM, gelatina al 0,01%, dNTPs 0,1 mM, 0,2 M de cada cebador
(los oligonucletidos cebadores se describen en la ref. 1), dos cebadores sentido P1 y P2 y dos antisentido
P3 y P4) y 2,5 unidades de polimerasa Taq.
La amplificacin primaria se realiza con los cebadores 1 y 4 dando un producto de 193 pb despus de
25 ciclos a 93C durante 1 minuto, 50C durante 1,5 minutos y 72C durante 3 minutos. El producto
amplificado se diluye entonces al 1/20 en agua destilada para reducir la amplificacin de los productos no
especficos.
La amplificacin secundaria utilizando los cebadores internos 2 y 3 y las mismas condiciones de reaccin,
se lleva a cabo en 15 ciclos dando un producto de 94 pb. Entonces se visualiza el producto final en geles de
agarosa a 1%. Se puede emplear un ensayo tipo Southern utilizando una sonda marcada para confirmar la
identidad de los productos B1 de la PCR y distinguirlos de los productos no especficos.
d) Deteccin de ooquistes en agua potable
Se han detectado ooquistes de Toxoplasma gondii en agua potable utilizando el mtodo para la deteccin
de ooquistes de Cryptosporidium (18). El mtodo se basa en la recogida de una muestra de agua de gran
volumen y en pasarla por un filtro de cartucho. La deteccin de ooquistes de Toxoplasma se realiz
mediante la inoculacin de rumiantes. (rodents)
2. Pruebas serolgicas
Se dispone de diversas pruebas serolgicas para la deteccin de anticuerpos frente a T. gondii. En un tipo de
prueba el observador juzga el color de los taquizotos al microscopio, tal como sucede con la prueba de tincin
(DT) y la prueba IFI. Otra prueba depende del principio de aglutinacin de taquizotos de Toxoplasma, glbulos
rojos o partculas de ltex, como sucede con la prueba de aglutinacin directa (PAD), la prueba de aglutinacin
indirecta (IHA) y la prueba de aglutinacin con ltex (LA), respectivamente. Con el ELISA, el cambio en la
intensidad de color define la cantidad de anticuerpo especfico en una solucin dada. Las pruebas DT, IFI, PAD y
ELISA se especifican ms adelante, indicndose la prueba IFI con ms detalle.
La prueba serolgica DT (29) se considera el patrn de oro para anticuerpos anti-Toxoplasma en humanos. Los
taquizotos vivos de Toxoplasma se incuban con un factor accesorio tipo complemento y el suero problema a
37C durante 1 hora antes de aadir azul de metileno. Los anticuerpos especficos inducen la permeabilizacin
de la membrana del parsito de modo que el citoplasma se derrama y los taquizotos no incorporan el colorante
de modo que aparecen incoloros. Los taquizotos no expuestos al anticuerpo especfico (p. ej. una muestra de
suero negativo) incorporan el colorante y aparecern azules. La prueba DT es al mismo tiempo sensible y
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especfica en humanos, pero podra ser impracticable en otras especies. Adems es potencialmente peligrosa
puesto que se emplea el parsito vivo. Es costosa y requiere un alto grado de experiencia tcnica. Debe tenerse
en cuenta que, por motivos de bienestar animal, en la medida de lo posible, los taquizotos deben cultivarse en
cultivo de tejidos en lugar de hacerlo en el peritoneo de los ratones.
La prueba IFI (26) es un mtodo simple y se utiliza ampliamente. Los taquizotos intactos y muertos de
Toxoplasma se incuban con el suero problema diluido, se aade el antisuero especfico anti especie fluorescente
apropiado, y el resultado se visualiza entonces con un microscopio de fluorescencia. Se dispone comercialmente
de anticuerpos marcados con fluorescencia para una variedad de especies animales; el mtodo es relativamente
econmico y se encuentran disponibles comercialmente los kits adecuados. Sin embargo, el mtodo requiere un
microscopio de fluorescencia y como los datos son interpretados visualmente, se pueden producir variaciones
subjetivas. Puede resultar difcil encontrar algunos conjugados especficos de las especies y existe riesgo de una
posible reaccin cruzada con anticuerpos frente al factor reumatoide y con anticuerpos antinucleares.
La prueba PAD (49) es sensible y especfica. Se aaden taquizotos formalinizados de Toxoplasma a pocillos con
forma de U de placas de microtitulacin y se aplican las diluciones de los sueros problema. Las muestras
positivas producirn aglutinacin que puede ser variable, mientras que las muestras negativas producirn un
botn de taquizotos sedimentados en el fondo del pocillo. La prueba es simple y fcil de realizar aunque se
requieren cantidades relativamente grandes de antgenos. Se dispone de kits comerciales. Ms adelante se
indica el mtodo de crecimiento y recogida de los parsitos. Tambin est disponible en el mercado una prueba
de aglutinacin con ltex (PAL). Las PAD y las PAL no son especficas de especie y son adecuadas para su
utilizacin con todas las especies.
La tcnica original ELISA (35) utiliza una preparacin de antgeno soluble realizada con taquizotos de la cepa de
Toxoplasma RH (como se describe ms adelante) y se coloca en pocillos de una placa de microtitulacin. Se
aaden los sueros problema (p. ej. ovino en origen), seguido de un conjugado anti-especie marcado con un
enzima como puede ser IgG anti-ovina marcada con peroxidasa de rbano. Cualquier conjugado adherido causa
un cambio de color en el sustrato que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo unido y puede ser
ledo con un espectrofotmetro a la absorbancia especfica del sustrato empleado. La tcnica es simple, permite
ensayar un gran nmero de muestras y es fcil de realizar con el conjugado anti-especie elegido. Se dispone
comercialmente de conjugados anti-especies, sustratos y kits completos. Sin embargo la tcnica requiere un
espectrofotmetro. La tcnica ELISA es idnea para laboratorios que analizan gran nmero de muestras.
Recientemente se ha elaborado un ELISA cintico (KELA) (37). El sistema KELA sirve para medir la tasa de
reaccin entre el enzima ligado y la solucin de substrato que provoca el desarrollo del color. Se leen tres
densidades pticas (DO) a intervalos de 45 segundos (utilizando el programa de manejo de datos KELA) y se
presentan los resultados en forma de pendientes. Se da una correlacin muy alta entre el ELISA y el KELA, y, por
tanto, las dos pruebas constituyen excelentes herramientas de diagnstico.
A fin de mejorar la especificidad del ELISA convencional, se han elaborado pruebas para utilizar en ovejas (30,
33), en las que se utilizan antgenos recombinantes (19) y antgenos especficos de Toxoplasma purificados por
afinidad (22), pero estas pruebas no se utilizan an de forma rutinaria.
Con el ELISA convencional, la deteccin de anticuerpos de IgG e IgM especficos para Toxoplasma permite un
cierto grado de discriminacin entre la toxoplasmosis grave y la crnica. Ms recientemente se han elaborado
pruebas de avidez. A medida que madura la respuesta inmune, despus de haberse establecido la infeccin, se
desarrollan anticuerpos con avidez creciente (afinidad funcional) de antgenos. Esa avidez puede medirse y
utilizarse para indicar una infeccin por T. gondii activa o reciente. Se ha elaborado una prueba para la deteccin
de la avidez de IgG por el antgeno P30 de T. gondii en ovejas (30). Esta prueba es una buena herramienta de
diagnstico para diferenciar las infecciones relativamente recientes de las ms antiguas.
Preparacin de antisueros y antgenos
Se pueden obtener comercialmente antisueros contra T. gondii y antisueros conjugados para las pruebas IFI y
ELISA, lo que permite muestrear una variedad de especies animales. No se dispone de patrones internacionales
para sueros animales.
Ms adelante se indican los protocolos a seguir en la preparacin del antgeno del taquizoto para su utilizacin
en las pruebas IFI y ELISA. Los taquizotos se pueden cultivar en ratones o en cultivo de tejidos y se mantienen
intactos para la prueba IFI o se preparan como antgeno soluble para la tcnica ELISA.
Produccin de taquizotos de Toxoplasma en ratones
i) Se inyectan seis ratones libres de Toxoplasma por va intraperitoneal utilizando una jeringa de 1 ml y
una aguja del calibre 23, con 0,2 ml de 1 10
7
/ml de taquizotos de T. gondii de la cepa RH, se
recogen frescos a partir de un pase previo por ratn o a partir de cultivo de tejidos. (Para la
Captulo 2.9.10. Toxoplasmosis
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 7
recuperacin ptima de los taquizotos tomando el mnimo nmero de clulas mononucleares del
hospedador, los ratones deben tener ms de 68 semanas de vida y pesar aproximadamente 22
25 g.)
ii) Se sacrifican los ratones 3 das ms tarde mediante inhalacin de CO
2
(debe evitase la dislocacin
cervical porque puede causar contaminacin del fluido peritoneal con glbulos rojos).
iii) Se fija el ratn de espaldas sobre una superficie de corcho limpia. Se separa aspticamente la piel
abdominal, se extrae cualquier fluido peritoneal con una aguja de calibre 21 unida a una jeringa de
1 ml y se expulsa suavemente el exudado recogido en un volumen igual de PBS.
El momento ptimo de recoger los taquizotos es 72 horas despus de la inoculacin inicial, momento
en el que habr organismos suficientes, pero antes de que exista contaminacin significativa de las
clulas hospedadoras. Tambin es importante no posponer la recogida del fluido peritoneal ms all
de 3 das desde la muerte de los ratones. (Si los taquizotos para la inoculacin del ratn se toman a
partir de muestras estabilizadas congeladas, podra ser necesario recoger los ratones 4 o 5 das
despus de la inoculacin inicial y realizar un pase del parsito una vez ms a travs de ratones antes
de ser utilizados como antgeno en las pruebas indicadas anteriormente.)
iv) Se centrifuga el fluido a 500 g durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se resuspende en una
solucin salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se alternan lavados en PBS y HBSS por centrifugacin.
v) Se calcula la concentracin de taquizotos y clulas hospedadoras contaminantes con una cmara de
recuento Neubauer mejorada (El recuento de taquizotos se realiza a una dilucin 1/1.000 y la
contaminacin celular a una dilucin 1/10).
vi) Se llevan a cabo lavados posteriores (etapa (iv) anterior) cuando sea necesario para reducir la
contaminacin celular a <0,5% de clulas mononucleares y <0,25% de glbulos rojos.
vii) Se resuspenden los taquizotos en PBS hasta alcanzar una concentracin final de 1 10
7
/ml.
viii) Los taquizotos se pueden mantener de esta manera por pases continuos sin necesidad de adicionar
penicilina/estreptomicina, siguiendo procedimientos aspticos estrictos.
Preparacin de alcuotas de taquizotos de T. gondii estabilizadas y congeladas
i) Los taquizotos se consiguen a partir de ratones o cultivos de tejidos como ya se ha descrito.
ii) Se centrifugan a 500 g durante 5 minutos y se resuspenden en medio de Dulbecco modificado por
Iscove (IMDM) (Gibco BRL, Paisley, Gran Bretaa) aproximadamente tres veces.
iii) Se aaden las siguientes soluciones hasta conseguir estas concentraciones: dimetil sulfxido al 10%;
suero de caballo normal al 20% (libre de anticuerpos frente a T. gondii); taquizotos resuspendidos al
70% hasta una concentracin final de 1 10
8
taquizotos/ml.
iv) La preparacin debe permanecer esttica durante 1 hora.
v) Se distribuyen alcuotas de 1ml en tubos de tapn de rosca apropiados para el almacenamiento en
nitrgeno lquido.
vi) Se introducen los tubos en un pequeo contenedor. Se envuelven en un material aislante grueso y se
colocan en un congelador a 70C hasta conseguir que los taquizotos se congelen gradualmente.
vii) Al da siguiente se transfieren a nitrgeno lquido, mantenindolos bien aislados mientras se
transfieren.
viii) Este material estabilizado puede ser empleado para inocular ratones o cultivar el parsito en cultivo de
tejidos. Cuando se saca del congelador, la muestra se descongela rpidamente en agua templada.
Produccin de taquizotos de Toxoplasma en cultivos de tejidos
i) Se puede cultivar Toxoplasma gondii y mantener en cultivo de tejidos mediante pases dos veces por
semana en clulas de rin de mono verde africano (Vero).
ii) Las clulas y el parsito se cultivan en medio IMDM suplementado con 50 UI/ml de penicilina, 50 g/ml
estreptomicina y suero fetal bovino al 2%.
iii) Los taquizotos se recogen a partir de frascos de cultivo de tejidos raspando la monocapa celular
mediante un raspador celular estril.
Captulo 2.9.10. Toxoplasmosis
8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
iv) Se emplean frascos de cultivo de tejidos de 25cm
2
que han sido sembrados con 1 10
5
clulas Vero,
se aaden taquizotos en una relacin de dos taquizotos por clula de la monocapa y se incuban a
37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO
2
. Se recogen despus de 34 das.
Preparacin de taquizotos intactos para ser utilizados en la prueba IFI
i) Se prepara una suspensin de 4 10
7
/ml taquizotos de la cepa de T. gondii RH en PBS.
ii) Se aade formaldehdo (40%) hasta conseguir una concentracin final de 0,2% (v/v).
iii) Se incuba a 4C durante toda la noche y se divide en alcuotas empleando tubos cerrados
adecuadamente que se mantienen congelados hasta su uso.
Produccin de antgeno soluble para la tcnica ELISA
i) Se prepara una suspensin de taquizotos de la cepa de T. gondii RH en PBS.
ii) Se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos, se conserva el precipitado y se resuspende en nueve
veces su volumen en agua destilada.
iii) Se rompen los taquizotos mediante tres ciclos de congelacin y descongelacin.
iv) Entonces se sonica la preparacin de antgeno durante 20 segundos a 4C y una amplitud de
20 micras.
v) Se extrae cualquier residuo celular mediante centrifugacin a 10.000 g durante 30 minutos a 4C.
vi) Se retiene el sobrenadante y se conserva a 20C hasta su uso. (La estimacin de protenas esperada
tiene un valor de entre 2 y 4 g/ml.)
Protocolo para la prueba IFI
El siguiente es un protocolo para realizar una prueba IFI de deteccin de anticuerpos IgG antiToxoplasma
en suero ovino. Solo requiere pequeas modificaciones para las pruebas en diferentes especies o para la
medida de anticuerpos IgM.
i) Se limpia el nmero necesario de portas multiprueba de 15 pocillos para cultivo de tejidos (laboratorios
Flow) y se deja secar.
ii) Se colocan 5 l de una preparacin de taquizotos intactos en cada pocillo y se dejan secar.
iii) Se fijan en metanol durante 10 minutos.
iv) Se realizan dos lavados de 10 minutos cada uno en 0,3 M de PBS, pH 7,4.
v) Se aaden 5 l del suero ovino problema (diluido en PBS) a cada pocillo. (Se preparan diluciones
seriadas de los sueros problema, p. ej. 1/16, 1/32, etc. hasta 1/1.024.) Se debe incluir un suero control
positivo y negativo en cada prueba as como una muestra con solo PBS. Se incuban 30 minutos a
temperatura ambiente.
vi) Se realizan dos lavados de 10 minutos cada uno en PBS.
vii) A cada pocillo se aaden 5 l de una dilucin apropiada de IgG de conejo anti-oveja conjugada a
isotiocianato de fluorescena, diluidos en colorante azul de Evan filtrado al 2% en PBS, y se incuban
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
viii) Se realizan tres lavados de 10 minutos cada uno en PBS.
ix) Se colocan los portas bajo cubreobjetos con glicerol tamponado (nueve partes de PBS y una de
glicerol) o Citifluor (Citifluor Ltd, Londres).
x) Se examina mediante un microscopio de fluorescencia, provisto de objetivos de 20 y de 40.
Con un resultado negativo del suero problema los parsitos intactos aparecern rojos debido a la
autofluorescencia del colorante azul de Evan. Tambin pueden presentar un casquete fluorescente verde en
un extremo del parsito (fluorescencia polar no especfica). Con un suero problema positivo los parsitos
presentarn fluorescencia roja y al menos el 80% de ellos en un pocillo dado estarn rodeados por una
banda continua de fluorescencia verde. En una oveja/cabra adulta un ttulo se considerar positivo cuando
los pocillos muestren resultado positivo a diluciones 1/64 y ser negativo a diluciones 1/32. Para cras de
cordero y suero fetal, los ttulos sern 1/32 y 1/16, respectivamente.
Captulo 2.9.10. Toxoplasmosis
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 9
A continuacin se indica un ejemplo de sistema en porta:
Muestra 1
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

|
1/512 1/1024 PBS solo | 1/1024 1/512
|

1/1256 1/128 1/64 1/32 1/16

Muestra 2
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO
La nica vacuna disponible es una preparacin viva producida comercialmente para ovejas (Toxovax, Intervet
BV, Pases Bajos; Toxovax, AgVax, Ag Research, Nueva Zelanda), y actualmente con licencia de uso en Gran
Bretaa, Irlanda, Francia, Portugal, Espaa y Nueva Zelanda. Consiste en el cultivo de tejidos en el que se
desarrollan taquizotos de T. gondii S48 atenuados por mas de 3.000 pases en ratones. La vacuna estimula la
inmunidad protectora efectiva durante al menos 18 meses despus de una nica inyeccin subcutnea, pero,
como es incapaz de producir quistes tisulares, las ovejas no permanecen con una infeccin vacunal persistente.
La vacuna tiene un corto periodo de validez y supone un riesgo potencial para individuos inmunodeprimidos y
hembras en estado de gestacin (4). La vacuna debe guardarse y utilizarse siguiendo estrictamente las
instrucciones del fabricante, de modo que nunca debe congelarse, debe mantenerse en refrigeracin (4C) y
protegida de la luz solar. Deber aadirse el diluyente a la suspensin concentrada de taquizotos
inmediatamente antes de usarse.
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